Protocol
1. Zuivering van de Dye
- Bereid een 4% oplossing van methyl green door oplossen van 0,4 g vlek poeder in 10 ml gedestilleerd water. Meng grondig tot volledig op te lossen.
- Onder een rook-kap, meng het met minstens 2 delen van chloroform. Het is belangrijk om vooraf te controleren of de buizen chloroform resistent.
- Meng goed en centrifugeer gedurende 1 min bij 2000 xg om fasescheiding te versnellen.
- Na centrifugeren, een bovenste waterfase met methylgroen en een onderste organische fase met chloroform en de gebruikelijke verontreinigingen kristalviolet worden verkregen.
- Herstellen van de bovenste fase en herhaal deze stap totdat onderste fase lijkt volledig verstoken van kristalviolet.
- Aan het einde is de bovenste fase teruggewonnen en verdund in water tot een eindconcentratie van 2% methylgroen. Deze voorraad oplossing is op de werkbank maanden en niet behoeft te worden beschermd tegen licht.
- Bevestig de embryo overnacht in 4% formaldehyde (van paraformaldehyde) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: Dit kan duren van enkele uren tot gedurende de nacht, afhankelijk van de dikte van het embryo. In het voorbeeld, we vast 48 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo's 's nachts. - Was de embryo driemaal in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) gedurende 5 min. De verhoogde concentratie van wasmiddel permeabilizes de cuticula.
- Bereid een 1: 5,000-1: 10,000 oplossing van methyl-groen (van 2% voorraad-oplossing) in PBS-T. De aanwezigheid van detergent tijdens de incubatie bruikbaar voor dikke monsters, zoals zebravis embryo's en larven.
- Incubeer de embryo's in de oplossing gedurende tenminste 6 uur bij 4 ° C onder zachtjes wiegen. Ook de dikte van het embryo is de parameter ijken van de lengte van de incubatietijd.
- Was de embryo's 3 times met PBS gedurende 30 min naar het detergens overmaat te verwijderen. Methyl groene fluorescentie alleen zichtbaar indien gebonden aan DNA, waardoor de achtergrond van het ongebonden moleculen verwaarloosbaar.
- Mount op een opgegraven dia of een zelfgemaakte kamer met montage-oplossing (75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
Opmerking: Als de nucleaire kleuring wordt uitgevoerd na immunokleuring kan methylgroen worden opgenomen om de bevestiging oplossing vlak werkconcentratie, zonder de noodzaak om het weg te wassen. - Store gekoeld of onmiddellijk beginnen beeldvorming. Voer beeldvorming met een confocale laser scanning (of andere fluorescentie) microscoop met excitatie bij 633 nm en emissie filters instellen om te registreren bij 650-750 nm rekening houdend met dat methyl groene emissie haar maximum bereikt op 677 nm.
LET OP: Wij bieden de gemeten gegevens van de methyl groene emissie profiel, in de acquisitie software worden geladen, als aanvullend materiaal.
3. Fluorescent Nuclear Staining van Whole kippenembryo's met Methyl Green
- Incubate bevruchte kippeneieren tot het stadium van belang. Bevestig de embryo overnacht in 4% formaldehyde (van paraformaldehyde) in PBS bij 4 ° C. Was embryo 3 maal in PBS-T gedurende 2 uur.
- Bereid een 1: 5,000-1: 10,000 oplossing van methyl-groen (van 2% voorraad-oplossing) in PBS-T. Incubeer de embryo kleuroplossing overnacht bij 4 ° C. Was de embryo 3 maal in PBS, 1 uur elk. Mount in de kamer met 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8.
4. Imaging fluorescent gelabelde kernen in Whole-gemonteerde embryo
- Bereid een imaging kamer door steken verschillende lagen van elektrische tape over een microscoop glijbaan en voorzichtig een gat in het met een scalpel om de embryo's binnen te plaatsen. Hiermee wordt voorkomen dat embryo's uit het verpletteren tijdens de beeldvorming.
- Breng voorzichtig de embryo's naar de beeldvorming kamer en vult de kamer naar de bovenzijde met 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8 met eenleegte belvorming.
- Dek af met een # 0 dekglaasje vermijden of elimineren medium overlopen. Verzegelt het met nagellak.
- Acquire beelden van het monster op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 633 excitatiefilter of laser lijn.
OPMERKING: Emissie filters moet de maximale uitstoot van 677 methyl groene dekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nucleaire kleuring van dikke monsters. De hierin beschreven protocol maakt het bereiken van homogene kleuring van dieptestructuren gehele embryo. Ontwikkeling lens kernen vorm 48 HPF zebravis embryo homogeen aangeduid (figuur 1).
Methylgroen DNA kleuring maakt onderscheid van celcyclus afhankelijke morfologische verschillen zoals de identificatie van mitotische figuren of apoptotische nuclei (figuur 2A). Subnucleaire structuren met een hoge resolutie zijn ook duidelijk zoals getoond epidermale kernen van zebravis embryo's (Figuur 2B).
Methylgroen is bestand tegen fotobleken onder hoge intensiteit bestraling gedurende langere perioden. Wanneer bestraald met 633 nm laserlicht met dezelfde intensiteit, ofwel methylgroen kernkleuring Niet bleken als het bij een DNA-specifieke kleuring sharing vergelijkbare spectrale kenmerken, TO-PRO-34. Een confocale vlak van het netvlies van een hele gemonteerde zebravis embryo werd geselecteerd en ingezoomd met een 63x 1.4NA doel om hoge straling te bereiken. Bij uitzoomen, de monsters gekleurd met TO-PRO-3 vertoonden bleken binnen 60 seconden continu bestraling (Figuur 3, bovenste panelen), terwijl de monsters gekleurd met methylgroen vertoonden geen zichtbare tekenen van fotobleken, zelfs bij 120 seconden onder dezelfde omstandigheden (Figuur 3, onderste panelen). Afbeeldingen verworven LASAF software werden verder verwerkt (helderheid / contrast, 3D-reconstructie; maximale intensiteit projectie) met Fiji open source software (http://fiji.sc/).
Figuur 1:. Homogene kleuring van kernen van diepe structuren met methylgroen ontwikkelen lens van 48 HPF zebravis embryo gekleurd met methyl groen (MG) in een z-uitsteeksel of 20 confocale vliegtuigen. Embryo's werden tegengekleurd voor F-actine met TRITC-geconjugeerde phalloidin (Phal). Schaal bar: 15 micrometer.
Figuur 2: Nuclear morfologie en subnucleaire resolutie methyl groene vlekken A) Verschillende nucleaire morfologie in de epidermis van 48 HPF zebravis embryo.. MG, methylgroen. Monsters werden tegengekleurd voor F-actine met TRITC-phalloidin. Arrowhead: mitotische cel. Maximale intensiteit projectie van 10 confocale vliegtuigen. B) kippenembryo neurale plaat gemerkt op dezelfde wijze weergeven mitotische cellen (pijlpunten) en pyknotische kernen (pijlen). Single confocale vlak. C) Drie enkelvoudige confocale vlakken van een zebravis embryo epidermale kern bij een sterke vergroting, die een hoge mate van subnucleaire resolutie. Schaalbalken: A, 15 urn; B, 5 micrometer; C, 1 urn.
Figuur 3:. Fotostabiliteit van methylgroen onder continue excitatie TO-PRO-3-gekleurde kernen van 48 HPF zebravis retina werd gebleekt na 60 seconden continue excitatie bij 633 nm (bovenste panelen). Onder dezelfde voorwaarden, leverde een methyl groen gekleurd embryo (MG) niet tonen waarneembaar bleken, zelfs als het dupliceren van de belichtingstijd (onderste panelen). Bleken en acquisitie werd gemaakt door het scannen in enkele vliegtuigen, bij 8.000 Hz, 30% laservermogen en lijn (x2) en het frame (x4) gemiddelde. Schaal bar: 30 micrometer.
| Golflengte (nm) | Procent emissie |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53,92 |
| 655 | 61,82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87,33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97,41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83,32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Aanvullend materiaal 1: emissiespectrum van methylgroen nucleaire kleuring onder 633 nm excitatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9 (1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
