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Developmental Biology

Applicazione del DNA-Specific Stain metile Verde al Fluorescent Etichettatura degli embrioni

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

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1. Purificazione del colorante

  1. Preparare una soluzione acquosa al 4% del verde metile sciogliendo 0,4 g di colorante in polvere in 10 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente fino a completa dissoluzione.
  2. Sotto una cappa-cappa, mescolare con almeno 2 parti di cloroformio. E 'importante verificare in anticipo se i tubi sono resistenti cloroformio.
  3. Mescolare accuratamente e centrifugare per 1 minuto a 2000 xg per accelerare la separazione di fase.
  4. Dopo centrifugazione, una fase superiore acquosa con verde metile e una fase organica inferiore con cloroformio e la solita contaminante cristalvioletto sono ottenuti.
  5. Recuperare la fase superiore e ripetere l'operazione fino a quando appare fase inferiore del tutto privo di cristallo viola.
  6. Al termine, la fase superiore viene recuperato e diluito in acqua ad una concentrazione finale del 2% verde metile. Questa soluzione madre è stabile sul banco di lavoro per mesi e non deve essere protetto dalla luce.

  1. Fissare gli embrioni durante la notte nel 4% di formaldeide (da paraformaldeide) in tampone fosfato (PBS).
    NOTA: Questo può richiedere da alcune ore a seconda overnight dello spessore degli embrioni. Nell'esempio, abbiamo fissato 48 hr post-fecondazione (HPF) zebrafish embrioni durante la notte.
  2. Lavare gli embrioni tre volte in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) per 5 min. L'elevata concentrazione di detersivo permeabilizes cuticola.
  3. Preparare un 1: 5,000-1: 10.000 soluzione di verde metile (dal 2% soluzione madre) in PBS-T. La presenza di detersivo durante l'incubazione è utile per i campioni spessi, come zebrafish embrioni e larve.
  4. Incubare gli embrioni nella soluzione per almeno 6 ore a 4 ° C, con dolce dondolio. Anche in questo caso, lo spessore dell'embrione è il parametro di calibrazione per la lunghezza dell'incubazione.
  5. Lavare gli embrioni 3 times con PBS per 30 minuti per eliminare l'eccesso di detersivo. Metile fluorescenza verde è solo evidente quando si lega al DNA, quindi sfondo dalla molecola non legato è trascurabile.
  6. Montare su un vetrino scavato o una camera in casa con soluzione di montaggio (75% glicerolo, 0,1 M Tris · HCl pH 8).
    NOTA: Se la colorazione nucleare deve essere eseguita dopo immunomarcatura, verde metile può essere incorporato alla soluzione di montaggio alla concentrazione di lavoro, senza la necessità di lavare via.
  7. Conservare in frigorifero o avviare immediatamente l'imaging. Eseguire l'imaging con un confocale a scansione laser (o altro a fluorescenza) microscopio con eccitazione a 633 nm ed emissione filtri impostati per registrare a 650-750 nm, tenendo conto del fatto che le emissioni di metile verde raggiunge il suo massimo a 677 nm.
    NOTA: Forniamo i dati misurati del profilo emissioni verde metile, per essere caricati nel software di acquisizione, come materiale supplementare.

3. fluorescente nucleare StAining di Whole Chick embrioni utilizzando metile Verde

  1. Incubare le uova di gallina fecondate allo stadio di interessi. Fissare gli embrioni notte in formaldeide al 4% (da paraformaldeide) in PBS a 4 ° C. Lavare gli embrioni 3 volte in PBS-T per 2 ore.
  2. Preparare un 1: 5,000-1: 10.000 soluzione di verde metile (dal 2% soluzione madre) in PBS-T. Incubare gli embrioni nella soluzione colorante notte a 4 ° C. Lavare gli embrioni 3 volte in PBS, 1 ora ciascuno. Montare in camera con il 75% di glicerolo, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluorescente Nuclei in embrioni interi montato

  1. Preparare una camera di imaging incollando diversi strati di nastro isolante su un vetrino da microscopio e accuratamente tagliato un foro in esso con un bisturi per posizionare gli embrioni all'interno. Questo consentirà di evitare gli embrioni da schiacciamento durante l'imaging.
  2. Trasferire accuratamente gli embrioni alla camera di imaging e riempire la camera verso l'alto con il 75% glicerolo, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8 con unla formazione di bolle vuoto.
  3. Coprire con un # 0 vetrino evitare o eliminare media straripante. Sigillare con smalto.
  4. Acquisire immagini del campione su un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro di eccitazione 633 o linea laser.
    NOTA: i filtri delle emissioni dovrebbero riguardare al massimo 677 emissione di verde metile.

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Representative Results

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Colorazione nucleare dei campioni di spessore. Il protocollo qui descritto consente il conseguimento di colorazione omogenea delle strutture profonde in embrioni interi. Lenti in via di sviluppo formare nuclei 48 hpf embrioni di zebrafish sono omogeneamente etichettati (Figura 1).

Metile colorazione verde DNA permette la discriminazione di ciclo cellulare differenze morfologiche a carico, come l'individuazione di figure mitotiche o nuclei apoptotici (Figura 2A). Strutture subnucleare ad alta risoluzione sono evidenti anche come indicato per nuclei epidermiche di embrioni di zebrafish (Figura 2b).

Verde metile è resistente a photobleaching ad alta intensità di irradiazione per periodi di tempo prolungati. Quando irradiati con luce laser 633 nm alla stessa intensità, metil colorazione verde nucleare non sbianca come è il caso di un altro specifico DNA condivisione macchia caratteristiche spettrali simili, TO-PRO-34. Un aereo confocale della retina di un intero montato embrione zebrafish è stato selezionato e ingrandita con un obiettivo 63x 1.4NA per realizzare alta irradiazione. Quando si riduce, i campioni macchiati con TO-PRO-3 ha mostrato candeggio entro 60 secondi di irraggiamento continuo (figura 3, pannelli superiori), mentre i campioni colorati con verde metile non hanno evidenziato visibile di photobleaching anche a 120 secondi stesse condizioni (Figura 3, pannelli inferiori). Le immagini acquisite in software LASAF sono stati successivamente trattati (luminosità / contrasto, la ricostruzione 3D, MIP) utilizzando software open source Fiji (http://fiji.sc/).

Figura 1
Figura 1:. Colorazione nucleare omogeneo di strutture profonde con verde metile Sviluppare obiettivo di un 48 hpf zebrafish colorati con verde metile (MG) ​​in una z-proiezione of 20 aerei confocale. Gli embrioni sono stati controcolorate per F-actina con falloidina TRITC coniugato (Phal). Scala bar: 15 micron.

Figura 2
Figura 2: la morfologia nucleare e subnucleare con risoluzione di metile verde colorazione A) diverse morfologie nucleari nell'epidermide di 48 hpf zebrafish.. MG, verde metile. I campioni sono stati controcolorate per F-actina con TRITC-falloidina. Arrowhead: cellula mitotica. Proiezione di massima intensità di 10 aerei confocale. B) Chick embrione piastra neurale etichettati allo stesso modo, la visualizzazione di cellule in mitosi (frecce) e nuclei picnotici (frecce). Singolo piano confocale. C) Tre aerei confocale singole di un nucleo zebrafish embrione epidermica ad alto ingrandimento, mostrando un alto grado di risoluzione subnucleare. Bar Scala: A, 15 micron; B, 5 micron; C, 1 micron.


Figura 3:. Fotostabilità di verde metile sotto eccitazione continuo TO-PRO-3 macchiato nuclei di una retina zebrafish 48 hpf stato sbiancato su 60 sec di eccitazione continuo a 633 nm (pannelli superiori). Alle stesse condizioni, un embrione di metile verde macchiato (MG) non ha mostrato candeggio percepibile, anche quando la duplicazione del tempo di esposizione (pannelli inferiori). Sbiancamento e l'acquisizione è stata fatta attraverso la scansione in piani singoli, a 8.000 Hz, potenza del laser il 30% e la linea (x2) e telaio (x4) media. Scala bar: 30 micron.

Lunghezza d'onda (nm) Percentuale delle emissioni
640 21.37
643 27.5
646 36.69
44.47
652 53.92
655 61.82
658 67.86
661 83.2
664 85.22
667 89.45
670 87.33
673 92,3
676 100
679 97.41
682 90.34
685 83.32
78.37
691 76.09
694 73.95
697 67.36
700 64,4
703 61.26
706 56.39
709 55.06
712 49.56
715 46.12
718 41.4
721 38,8
724 35.97
33.27
730 30.95
733 28.78
736 26.28
739 24.96
742 23.3
745 21.12
748 19.86
751 17.47
754 16.14
757 14.21
760 12.45
763 11.49
9.97
769 7.55
772 7.75
775 6.46
778 5.76
781 4.38
784 2.6
787 2.75
790 2.27
793 1.52
796 0

Materiale supplementare 1: Spettro di emissione di metile colorazione nucleare verde sotto 633 nm di eccitazione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

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References

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Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

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