Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Применение ДНК-специфичных красителей метиловым зеленым в Флуоресцентная маркировка эмбрионов

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Очистка красителя

  1. Подготовка 4% -ный водный раствор метиловым зеленым при растворении 0,4 г порошка красителя в 10 мл дистиллированной воды. Смешивайте до полного его растворения.
  2. Под вытяжного шкафа, смешать его с, по крайней мере 2-х частей хлороформа. Важно заранее проверить трубы, являются ли хлороформ устойчивостью.
  3. Тщательно перемешать и центрифугировать в течение 1 мин при 2000 х г чтобы ускорить разделение фаз.
  4. После центрифугирования верхнюю водную фазу метиловым зеленым, и ниже, органическую фазу с хлороформом и обычно загрязнителем кристаллический фиолетовый получены.
  5. Восстановление верхней фазы и повторите этот шаг, пока нижняя фаза не появляется полностью лишенный кристаллического фиолетового.
  6. В конце концов, верхнюю фазу и разбавляли водой до конечной концентрации 2% метиловым зеленым. Этот исходный раствор стабилен на верстаке в течение нескольких месяцев, и не должны быть защищены от света.

  1. Исправление эмбрионов в течение ночи в 4% формальдегиде (с параформальдегидом) в фосфатном буферном растворе (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять от нескольких часов до ночи в зависимости от толщины эмбрионов. В примере, мы зафиксировали 48 часов после оплодотворения (ФВЧ) данио эмбрионов в течение ночи.
  2. Промыть эмбрионы три раза в PBS-T (1% Тритон Х-100 в PBS) в течение 5 мин. Повышенная концентрация моющего средства permeabilizes кутикулу.
  3. Подготовьте 1: 5,000-1: 10,000 решение метиловым зеленым (от 2% раствора) в PBS-T. Наличие моющего средства во время инкубации полезен для толстых образцов, таких как эмбрионов данио и личинок.
  4. Инкубируйте эмбрионов в растворе в течение по крайней мере 6 ч при температуре 4 ° С при осторожном качания. Опять же, толщина эмбриона является параметром для калибрования длины инкубации.
  5. Вымойте эмбрионов 3 TIMES с PBS в течение 30 мин, чтобы удалить избыток моющего средства. Метил зеленая флуоресценция проявляется только при связывании с ДНК, следовательно, фон от несвязанного молекулы является незначительным.
  6. Mount на раскопки слайда или самодельной камеры с монтажной раствора (75% глицерина, 0,1 М Трис HCl рН · 8).
    Примечание: Если ядерный окрашивание должно быть выполнено после того, как иммунноокрашивания, метиловым зеленым, могут быть включены в монтажной раствора в рабочей концентрации, при этом нет необходимости смыть.
  7. Храните в холодильнике или начать визуализацию сразу. Выполнение визуализации с лазерной сканирующей конфокальной (или другого флуоресценции) микроскопа с возбуждением при 633 нм и эмиссии фильтров, установленных зарегистрироваться на 650-750 нм с учетом того, метиловым зеленым выбросов достигает максимума при 677 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предоставляем измеренные данные метилового зеленого профиль излучения, чтобы быть загружены в программу приобретения, в качестве дополнительного материала.

3. Люминесцентные ядерной СанктAining всей куриных эмбрионов с помощью метиловым зеленым

  1. Выдержите оплодотворенных куриных яиц на сцену интересов. Исправление эмбрионов в течение ночи в 4% формальдегиде (с параформальдегидом в PBS) при 4 ° С. Промыть 3 раза эмбрионов в PBS-T в течение 2 ч.
  2. Подготовьте 1: 5,000-1: 10,000 решение метиловым зеленым (от 2% раствора) в PBS-T. Инкубируйте эмбрионов в красящим раствором в течение ночи при 4 ° С. Вымойте эмбрионов 3 раза в PBS, 1 ч каждый. Крепление в камере с 75% глицерина, 0,1 М Трис, рН 8.

4. изображений Флуоресцентно меченых ядер в целом монтажа эмбрионов

  1. Подготовка камеры изображения, придерживаясь несколько слоев изоленты на предметное стекло и осторожно вырезать отверстие в ней с помощью скальпеля на место эмбрионов в. Это позволит предотвратить эмбрионов от дробления во время съемки.
  2. Тщательно передачи эмбрионов в камеру изображения и заполнить камеру к вершине с 75% глицерина, 0,1 М Трис-HCl, рН = 8недействительными образование пузырьков.
  3. Накрыть # 0 покровное избежать или устранить средний перетекание. Печать его с лаком для ногтей.
  4. Получение изображений образца на флуоресцентный микроскоп оснащен фильтром 633 возбуждения или лазерной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: фильтры выбросов должна охватывать максимум 677 излучения метиловым зеленым.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ядерная окрашивание толстых образцах. Протокол описано позволяет для достижения однородной окраски глубинных структур в целом эмбрионов. Развивающиеся объектив ядра образуют 48 эмбрионы рыбок данио HPF однородно помечены (рис 1).

Метил зеленый окрашивание ДНК позволяет дискриминацию клеточного цикла зависимых морфологических различий, таких как идентификация фигуры митоза или апоптоза ядер (рис 2А). Субъядерных структуры с высоким разрешением также очевидны, как показано на эпидермиса ядер эмбрионов данио (рис 2b).

Метил зеленый устойчив к фотообесцвечивания под высоким облучения интенсивностью в течение длительных периодов времени. При облучении 633 нм лазерного света с той же интенсивностью, метиловым зеленым атомной окрашивание не отбеливают, как это имеет место другой ДНК-специфичных пятен обмена подобными спектральными характеристиками, К-PRO-34. Конфокальной плоскости сетчатки целого монтажа данио эмбриона был выбран и увеличенной в с 63x 1.4NA целью достижения высокой облучение. При уменьшении масштаба, образцы окрашивали К-PRO-3 показали отбеливания в течение 60 секунд непрерывного облучения (рис 3, верхние панели), в то время как образцы, окрашенные метиловым зеленым показали никаких видимых доказательств фотообесцвечиванию даже на 120 секунд в тех же условиях (Рисунок 3, нижние панели). Изображения, полученные в программном обеспечении Ласафом были дополнительно обработаны (яркость / контрастность; 3D реконструкция; максимальная интенсивность проекции) с помощью Фиджи с открытым исходным кодом программное обеспечение (http://fiji.sc/).

Фигура 1
Рисунок 1:. Гомогенный ядерный окрашивание глубинных структур с метиловым зеленым Разработка линзу 48 HPF данио эмбриона окрашенных метиловым зеленым (MG) ​​в Z-проекции OF 20 конфокальной самолетов. Эмбрионы были контрастно для F-актина с TRITC-сопряженного фаллоидином (Phal). Масштабная линейка: 15 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2: Ядерная морфология и субъядерная разрешения с метиловым зеленым окрашивание А) различных ядерных морфологии в эпидермисе в 48 HPF данио эмбриона.. М., метиловым зеленым. Образцы контрастно для F-актина с TRITC-фаллоидином. Arrowhead: митотический клеток. Проекция Максимальная интенсивность 10 конфокальной самолетов. Б) куриного эмбриона нервная пластинка помечены таким же образом, отображение митотических клеток (стрелки) и пикнотические ядра (стрелки). Одноместный самолет конфокальной. С) Три односпальные конфокальные плоскостей данио эмбрион эпидермиса ядра при большом увеличении, показывая высокую степень субъядерной резолюции. Масштабные бары: A, 15 мкм; B, 5 мкм; С 1 мкм.


Рисунок 3:. Фотостабильность метиловым зеленым при непрерывном возбуждении К-PRO-3-окрашенных ядер 48 часов после оплодотворения данио сетчатки исчез при 60 сек непрерывного возбуждения при 633 нм (верхние панели). При тех же условиях, метиловым зеленым пятнами эмбриона (МГ) не показывают заметного отбеливание, даже при дублировании время экспозиции (нижние панели). Отбеливание и приобретение было сделано путем сканирования в одиночных самолетов, в 8000 Гц, 30% мощности лазера и линии (х2) и рамка (x4) усреднения. Масштабная линейка: 30 мкм.

Длина волны (нм) Процент выбросов
640 21.37
643 27,5
646 36.69
44.47
652 53.92
655 61.82
658 67.86
661 83,2
664 85.22
667 89.45
670 87.33
673 92,3
676 100
679 97.41
682 90.34
685 83.32
78.37
691 76.09
694 73.95
697 67.36
700 64,4
703 61.26
706 56.39
709 55.06
712 49.56
715 46.12
718 41,4
721 38,8
724 35.97
33.27
730 30.95
733 28.78
736 26.28
739 24.96
742 23,3
745 21.12
748 19.86
751 17.47
754 16.14
757 14.21
760 12.45
763 11.49
9.97
769 7,55
772 7,75
775 6.46
778 5.76
781 4.38
784 2.6
787 2.75
790 2.27
793 1.52
796 0

Дополнительный материал 1: Спектр излучения метил зеленой ядерной окрашивания под 633 нм возбуждения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192, (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70, (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24, (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17, (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11, (1), 9 (1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142, (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315, (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50, (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18, (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55, (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10, (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38, (16), 3662-3669 (1999).
Применение ДНК-специфичных красителей метиловым зеленым в Флуоресцентная маркировка эмбрионов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter