Summary
Sink finger-domener er iboende celle-gjennomtrengelige og i stand til å mediere proteinlevering til et bredt utvalg av pattedyrcelletyper. Her er en detaljert steg-for-steg-protokollen for å implementere sink-finger-teknologien for intracellulær protein levering presentert.
Introduction
Svært effektive og allsidige protein levering strategier er kritisk for mange grunnleggende forskning og terapeutiske anvendelser. Den direkte levering av rensede proteiner i celler representerer en av de sikreste og enkleste metoder for å oppnå dette. 1,2 motsetning strategier som er avhengige av genekspresjon fra nukleinsyrer, proteiner utgjør 3-5 levering ingen risiko for insertional mutagenese, er uavhengig av cellulær transkripsjon / oversettelse maskiner og åpner for en umiddelbar effekt. Men forundrer mangelen på enkle og generaliseres metoder for endowing celle-trengende aktivitet på proteiner rutinemessig sine direkte inntreden i cellene. Nåværende metoder for å lette intracellulær proteinlevering er basert på bruk av naturlig forekommende 6-8 eller utformet cellepenetrerende peptider, 9-12 kompressor transduksjon domener, 13,14 nanopartikler 15 og liposomer, 16-viruslignende partikler 17,18 19 Dessverre er mange av disse tilnærmingene er hemmet av lave cellulært opptak priser, 20,21 dårlig stabilitet, 22 utilsiktet celle-type spesifisitet, 23 lav endosomal rømningsegenskaper 24 og toksisitet. 25 I tillegg er mange protein transduksjon teknologier redusere bioaktiviteten av de leverte proteiner. 14
Vårt laboratorium tidligere vist at sink-finger-nuklease (ZFN) proteiner - kimære restriksjonsendonukleaser som består av en programmerbar Cys to -Hans 2 sink-finger-DNA-bindende protein, og spalting domenet til FoKI restriksjonsendonuklease 26-28 - er iboende celle- 29 Denne overraskende celle-trengende aktivitet ble vist seg å være en iboende egenskap ved spesialdesignede sink-finger domene, et DNA-bindende plattform som har dukket opp som et kraftig verktøy for målrettet genom en gjennomtrengelig.gineering, 30-32 og anses å være et resultat av den konstellasjon av seks positivt ladede rester på proteinoverflaten. Faktisk har flere DNA-bindende proteiner, inkludert c-Jun og N-DEK blitt vist å ha en iboende evne til å krysse cellemembraner. 33 Mer nylig vårt laboratorium utvidet på disse resultater og viste at cellepenetrerende aktivitet av sink- finger (ZIF) domener kan utnyttes for intracellulær protein levering. Genetisk fusjon av enten en- eller to-finger ZIF domener til spesifikke protein last førte til opptak effektivitet som oversteg mange konvensjonelle celletrengende peptid leveringssystemer. 34 Mest spesielt, gjorde ZIF-mediert levering ikke kompromiss aktiviteten av smeltet enzymatisk last og tilrettelagt høye nivåer av cytosolisk levering. Sammen er disse funnene viser potensialet av ZIF domene for tilrettelegging for effektiv og lettvinte levering av proteiner, og potensielt mer varierte typer av makromolekyler, inn i cellene.
Her er en detaljert steg-for-steg-protokoll på hvordan man implementerer ZIF-teknologi for protein levering i pattedyrceller presentert. Vi har tidligere konstruert en pakke med en-, to-, tre-, fire-, fem- og seks-finger-domener Zif som mangler evnen til å binde DNA, på grunn av substitusjon av hver av de α-heliks DNA-bindingsrester, men er i stand til å levere proteiner i celler 34 (figur 1). Produksjon og transduksjon av Emerald GFP (EmGFP) i HeLa celler ved hjelp av en to-finger ZIF domenet er beskrevet. Denne protokollen er utvidbar til nesten hvilken som helst protein i stand til ekspresjon av oppløselig i Escherichia coli, og nesten en hvilken som helst pattedyrcelletype. Forventede resultater er gitt og strategier for å maksimere ytelsen til dette systemet blir også diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning
- Skaff alanine-byttet to-finger ZIF domener som har blitt under klonet inn i Dyre 28 ekspressjonsvektor system og er tilgjengelig på forespørsel (PET-2F-ZIF). 34
- PCR amplifisere EmGFP fra plasmidet Emerald-pBAD med primerne 5'-Xmal-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3 ', Xma I-sete i fet skrift) og 3' SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 ' ; Sac jeg nettsted i fet skrift).
- Bruke 5 ng templat-DNA, 10 pl 10 x polymerase-buffer, 1 enheter (U) av Taq DNA-polymerase, 0,2 mM av hver dNTP og 0,2 uM av hver primer i 100 pl løsning med den gjenværende volum som består av destillert / deionisert vann . Bruk sykkelforholdene: 95 ° C i 5 min; 30 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minutt; 72 ° C i 10 min. Rens det PCR-produktet ved gel extractipå og bestemme DNA-konsentrasjon ved anvendelse av et spektrofotometer som måler Abs 260 x 50 mikrogram / ml.
- Digest pET-2F-Zif og innsatsen som koder EmGFP med restriksjonsenzymene Xma I og Sac I, anbefales buffer i 3 timer ved 37 ° C ved anvendelse av 10 U av enzymet per 1 pg av DNA. Visualisere DNA ved agarosegel-elektroforese ved bruk av en fluorescerende interkalerende fargestoff, slik som etidiumbromid.
- Rens det spaltet DNA ved gel-ekstraksjon kit og bestemme DNA-konsentrasjon av et spektrofotometer som måler Abs 260 x 50 mikrogram / ml.
- Ligere den rensede EmGFP-kodende DNA i 50 til 100 ng av pET-2F-Zif ved hjelp av en U av T4 DNA-ligase i minst 1 time ved RT. For best resultat, utføre ringsreaksjonen ved hjelp av en 6: 1 insert-til-vektor molarforhold.
- Tine 50 mL av noe kjemisk kompetente XL-1 Blå Escherichia coli-celler på is og bland forsiktig med 10-20 ng av legert Dyre 2F-ZIF-EmGFP.
- Hold på is i tre0 min. Varmesjokk blandingen ved 42 ° C i 90 sek, og gjenvinne cellene i 2 ml Super Optimal kokes med catabolitt-represjon (SOC) i 1 time ved 37 ° C med risting.
- Spre 100 ul utvinning kultur på en lysogeni buljong (LB) agar-plate med 50 pg / ml kanamycin og inkuber O / N ved 37 ° C.
- Den følgende dag, inokulere 6 ml Super Broth (SB) eller LB kultur inneholdende 50 ug / ml kanamycin til en koloni fra LB agarskål og kultur O / N ved 37 ° C.
Merk: Colony PCR ved anvendelse av primerne 5'-Xmal-EmGFP og 3 'SacI-EmGFP kunne brukes til å identifisere positive kloner før miniprep. - Rense Dyre 2F-ZIF-EmGFP av miniprep og bekrefte plasmid ved DNA-sekvensering ved hjelp av T7 promoter (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').
2. Uttrykk og rensing
- Tine 50 mL av kjemisk kompetente BL21 E. coli-celler på is og bland forsiktig med 100 ng av PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid. Forvandle som beskrevet i trinn 1.7 til 1.8.
- Den følgende dag, inokulere 10 ml LB-medium inneholdende 50 ug / ml kanamycin med en enkelt koloni og vokse O / N ved 37 ° C med risting.
- Den følgende dag, fortynne 10 ml av O / N kultur i 1 liter LB-medium supplert med 50 ug / ml kanamycin, 0,2% glukose og 100 uM ZnCl2. Dyrk kulturen ved 37 ° C med risting til en optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) på 0,8 og indusere proteinekspresjon med 2 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Etter 6 timers vekst ved 37 ° C, høste cellene ved sentrifugering ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C.
Merk: Induksjons betingelser er svært variabel og avhenger av stabiliteten av proteinene som blir uttrykt. Overvåke OD 600 hvert 30 min til en OD 600 på 0,8 er nådd. - Cellepelleten suspenderes i 5 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 10 mM imidazol, pH 8,0). Lyse cellene på isen ved ultralyd med følgende innstilling: 50% effekt, 4 min prosess tid med 5 sek på / 10 sek av intervaller. Unngå overoppheting løsningen.
- Sentrifuger cellelysatet ved 25.000 xg i 30 min ved 4 ° C og overføre supernatanten til en frisk oppsamlingsrør. For best resultat, utføre alle følgende trinn ved 4 ° C.
- Kjør supernatant gjennom en kolonne pre-pakket med 1 ml ekvilibrert Ni-NTA slurry. Vask harpiksen med 20 ml vaskebuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 og 30 mM imidazol, pH 8,0).
- Eluere proteinet med 5 ml elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, og 300 mM imidazol, pH 8,0).
- Buffer bytte den eluerte protein med lagringsbuffer (50 mMTris-HCl, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 og 10% glycerol, pH 8,0) og konsentrere protein til i det minste 40 um ved anvendelse av en spinn-konsentrator ved sentrifugering i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bestem protein konsentrasjon av BCA eller Bradford assay. Bland 2 ul av rensede proteiner med 2 ul 2 × SDS-PAGE lasting fargestoff, koke ved 95 ° C i 10 min og deretter løse på 4% -20% Tris-Glysin SDS-PAGE for å vurdere protein renhet (figur 2).
3. Protein Storage
- Delmengde konsentrert protein, flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. For EmGFP fusjonsproteiner, dekke røret med aluminiumsfolie for å beskytte proteinet fra lys.
- Unngå gjentatt frysing og tining av proteinløsningen. Merk: Zif-fuserte proteiner er stabile under disse betingelser i minst en måned. Upassende eller> 4 måneders lagring kan føretil protein nedbør eller fotobleking av EmGFP.
4. Protein Transduksjon
- Oppretthold HeLa-celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C i en fullstendig fuktet atmosfære med 5% CO2.
Note: Celler passaged mer enn 30 ganger er ikke anbefalt for protein transduksjon. - Pre-coat en 24-brønns plate med 500 ul av 50 ug / ml poly-lysin i 30 til 60 minutter ved 25 ° C. Seed celler over på en 24-brønns plate ved en tetthet på 2 x 10 5 celler per brønn. Ved 24 timer etter tilsetningen, eller når cellene er mellom 80% -90% sammenflytende, fjernes mediet fra hver brønn og vask med 500 ul av forvarmet i serum-fritt DMEM (SFM).
- Til hver brønn, tilsett 250 mL av SFM inneholder 2 mikrometer av ZIF-EmGFP protein og 100 mikrometer ZnCI2. Inkuber cellene ved 37 ° C i 1 time. Merk: ZIF domener inn celler primarily gjennom macropinocytosis, 34 som er en energiavhengig mekanisme. Derfor må cellene bli inkubert ved 37 ° C for effektiv internalisering protein.
- Fjern mediet fra cellene, og vaskes tre ganger med 500 pl av kalsium- og magnesium-fri Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) supplert med 0,5 mg / ml heparin. Merk: Heparin er nødvendig for å fjerne overflate-bundet protein som kan komplisere nedstrøms analyser.
- (Valgfritt) Gjenta behandlinger opptil tre ganger for økt levering.
- Isolere behandlede celler umiddelbart etter heparin vaske ved spaltning med 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 2 min. Re-suspenfrittliggende celler i 0,5 ml DPBS supplert med 1% FBS.
- Måle fluorescensintensiteten av hver prøve ved strømningscytometri 35 ved hjelp av fluoresceinisotiocyanat (FITC) kanal (figur 3). Justere fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC) for å plassere bestanden avrenter på skalaen, slik at bestander med ulike egenskaper er løst fra hverandre.
- Samle 10 000 live-hendelser for hver prøve og analysere data ved hjelp av flowcytometri dataanalyse programvare. 36 Normal fluorescens fra HeLa celler behandlet med ZIF-EmGFP til disse cellene behandlet bare med SFM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To-finger ZIF-EmGFP fusjonsproteiner kan uttrykkes i E. coli med> 95% homogenitet og høyt utbytte (> 25 mg / ml) (figur 2). Generelt, en- og to-finger Zif-fusjonsproteiner som kan produseres i mengder som nesten er identiske med dem for villtype-modifisert protein. Men i noen sammenhenger, fem- og seks-finger ZIF fusjonsproteiner er ikke i stand til å bli produsert i rentene høye nok for nedstrøms applikasjoner.
Direkte påføring av to fingre Zif-EmGFP protein på HeLa-celler i 90 minutter ved 37 ° C fører til en doseavhengig økning i EmGFP fluorescens (figur 3A). Kritisk, er ingen fluorescens observert i fravær av Zif-domenet. Vi har tidligere observert at nesten 100% av cellene er fluorescerende etter behandling med kun 2 uM av to fingre Zif-EmGFP protein, og at HeLa-celler behandlet med Zif-fusjonsprotein er positive for EmGFP fluorescens ved proteinkonsentrasjoner så lavt som 0,25 uM (figur 3b).
Figur 1. Struktur og sekvens av zink-finger-protein. (Til toppen) Crystal struktur av en enkelt sink-finger (ZIF) domene. De sidekjeder av den konserverte Cys og His-rester koordinert med Zn2 + ioner er vist som staver (PDB ID: 2I13). 37 (bunn) Sekvens av Zif-domenet. Piler og sylindere indikere Β-ark og α-helix sekundære konstruksjoner, henholdsvis. De α-heliks DNA-bindingsrester som har blitt substituert med alanin er markert rosa. Positivt ladede rester spådd å megle celle intern er uthevet lyseblå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. SDS-PAGE av renset en-, to-, tre- og fire-finger ZIF-EmGFP fusjonsproteiner. ZIF-EmGFP fusjonsproteiner ble uttrykt i E. coli og renset ved hjelp av Ni-NTA-agarose Harpiksen. Eluert protein ble analysert med hensyn på renhet ved hjelp av SDS-PAGE ved anvendelse av en 4% -20% Tris-Glycin geler. Ingen signifikant degradering eller trunkeringer av ZIF-EmGFP fusjonsproteiner ble observert.
Figur 3. ZIF-mediert protein levering i HeLa celler. (A) fluorescensintensiteten av HeLa-celler behandlet med økende mengder av to fingre Zif-EmGFP protein. HeLa-celler ble behandlet med EmGFP protein alene overlapper helt med ubehandlede celler. (B) Normalisert fluorescensintensitet av HeLa-celler ble behandlet i rekkefølge med 2 uM of to-finger ZIF-EmGFP protein. Fluorescens-intensitet ble bestemt ved flow-cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er en trinn-for-trinn-protokoll for proteinlevering ved hjelp av celle-gjennomtrengelige sink-finger (Zif) domener presentert. ZIF domene ikke redusere aktiviteten av smeltet enzymatisk last 34; muliggjør for produksjon og rensing av proteiner i utbytter nesten identiske med de som ble observert med ikke-modifisert protein; og kan transportere proteiner og enzymer i en rekke celletyper med effektivitet som overskrider tradisjonelle cellepenetrerende peptid eller protein transduksjon domenesystemer. Sammen utgjør disse funnene indikerer den brede potensialet i ZIF-domener for formidling direkte protein levering i celler for et bredt spekter av bruksområder.
Maksimal protein levering ble tidligere oppnådd med kun en to-finger ZIF domene, til tross for at utvidet matriser av tre- og fire-finger ZIF domener bære større positiv ladning. Disse funnene tyder på at ZIF-mediert celleoppføring kan bli påvirket av andre enn kostnad, inc faktorerInkl protein stabilitet eller conformational stivhet. Zif domene-mediert proteinlevering ble også funnet å være energiavhengig og således krever at alle celler behandlet med proteinet bli inkubert ved 37 ° C. Gjennom bruken av lavmolekylære inhibitorer av forskjellige endocytiske trasé, macropinocytosis, og i mindre grad caveolin avhengig endocytose, ble bestemt til å være hovedveier for Zif-mediert cellelinjen. 34 Spesielt, i motsetning til andre protein overføringssystemer, Zif domenene i stand til effektivt å unnslippe endosomer å mediere høye nivåer av cytosolisk levering av smeltet makromolekylært last, understreker den potensielle av disse domener for å oppnå robust proteinlevering.
I vår erfaring, er det seeding tetthet av celler et avgjørende skritt for å oppnå høye nivåer av protein transduksjon. Vi anbefaler å behandle celler når de når 80% -90% confluency og tidligere observert at celler seeded på> 95% confluency showet sub-transduksjon optimal kapasitet, mens cellene sådd ut ved lav tetthet (<50%) er utsatt for protein-indusert toksisitet. Viktigere, for celletyper med høy avløsning tendenser, cellekulturplater pre-belagt med poly-lysin anbefales. Poly-lysin letter cellebinding gjennom elektrostatiske interaksjoner med negativt ladede celle-overflate komponenter. Selv om α-heliks DNA-bindingsrester fra hver Zif domene har blitt fjernet for å eliminere enhver potensiell for DNA gjenkjenning, cystein og histidinrester som koordinere med Zn2 + ioner for å stabilisere domenet fold ΒΒα Zif forblir intakt. Derfor anbefaler vi at enhver lagring buffer suppleres med minst 100 mikrometer av ZnCI2 å opprettholde protein integritet.
Selv om Zif domenet ble tidligere vist å levere proteiner og enzymer i en rekke forskjellige celletyper, kan effektiviteten av Zif levering også være avhengig av både macromolecular last og protein konsentrasjon. For eksempel kan celler som ble behandlet med to fingre Zif-luciferase-fusjonsprotein ble observert å vise maksimale luminescens når de ble behandlet med 0,5 pM protein med redusert aktivitet ved høyere konsentrasjoner, mens celler behandlet med to fingre EmGFP oppviste en doseavhengig økning i fluorescens intensitet opptil 8,0 pM protein, og ved påfølgende protein behandlinger. Vi anbefaler derfor å vurdere celle gjennomtrengende evne til hver unike ZIF domene fusjon på tvers av en rekke konsentrasjoner.
Til slutt, men ennå ikke påvist, forventer vi at ZIF domene levering er en svært fleksibel plattform, i stand til å levere et variert utvalg av makromolekyler i cellene. For eksempel kan det være mulig for både DNA og RNA til å bli kjemisk funksjonalisert på overflaten av Zif domene via en hydrolyserbar bindingsmiddel, eller transient transfektert inn i celler ved innkapsling av Zif-domener. I tillegg, efficiency av ZIF protein levering kunne bli ytterligere forsterket av rasjonelle design innsats fokusert på overflateladning optimalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (DP1CA174426 til Carlos F. Barbas) og ShanghaiTech University, Shanghai, Kina (til JL). Molekylære grafikk ble generert ved hjelp PyMol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
