Цинк-пальцев доменов по своей природе клеточных проницаемой и способны опосредовать доставку белка в широком диапазоне типов клеток млекопитающих. Здесь подробная шаг за шагом протокол для реализации технологии цинк-пальцем для внутриклеточной доставки белков представлена.
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Высокоэффективные и универсальные стратегии доставки белка имеют решающее значение для многих фундаментальных исследований и терапевтического применения. Прямые поставки очищенных белков в клетках является одним из самых безопасных и простых способов для достижения этой цели. 1,2 В отличие от стратегий, которые полагаются на экспрессию генов из нуклеиновых кислот, 3-5 поставка белок не представляет никакого риска инсерционного мутагенеза, не зависит от сотовая транскрипции / трансляции техника и позволяет для немедленного эффекта. Тем не менее, отсутствие простых и обобщению методов наделяя активности клеток проникающим на белки обычно смешивает их непосредственное вступление в клетках. Современные методы, способствующие внутриклеточной доставки белка основаны на использовании природного происхождения или 6-8-клеток, направленных проникающих пептидов, 9-12 наддувом трансдукции доменов, 13,14 наночастиц 15 и липосомы, 16 вирусоподобные частицы 17,18 </SUP> и полимерные микросфер материалы. 19 К сожалению, многие из этих подходов мешает низких сотовых ставок поглощения, 20,21 плохую стабильность, 22 случайного типа клеток специфичности, 23 низкая эндосомные свойств эвакуации 24 и токсичность. 25 Кроме того, многие белок трансдукции технологии уменьшить биологическую активность доставленного белков. 14
Наша лаборатория ранее показали, что цинк-пальцем нуклеазу (ZFn) белки – химерные эндонуклеаз рестрикции, состоящее из блока программируемого Cys 2 -Его 2 цинк-пальцев ДНК-связывающего белка и области расщепления рестриктазой Фоки 26-28 – по сути своей Cell- проницаемой. 29 Это удивительное клеток проникающим деятельность было показано, что внутреннее свойство специально разработанный области цинк-пальцев, ДНК-связывающий платформы, которая возникла в качестве мощного инструмента для целенаправленного геном ENинженерии, 30-32 и считается результатом созвездии шесть положительно заряженных остатков на поверхности белка. В самом деле, несколько ДНК-связывающих белков, в том числе с-июне и N-ДЭК, как было показано, обладают врожденной способностью пересекать клеточные мембраны. 33 Совсем недавно в нашей лаборатории расширен на этих результатах, и показано, что клетки-проникающей активность цинковых палец (ZIF) домены могут быть использованы для внутриклеточной доставки белков. Генетическая слияние либо одно- или двумя пальцами ZIF доменов в специфических белковых грузов привело к поглощению эффективности, превышающие многие традиционные системы доставки пептидных клеток проникающим. 34 В частности, ЗИФ-опосредованной доставки не поставить под угрозу деятельность плавленого ферментативной груза и способствовало высокие уровни цитозольного доставки. В совокупности эти данные показывают потенциал области ZIF для облегчения эффективного и легкое доставку белков, и, возможно, более разнообразные типы макроМолекулы, в клетки.
Здесь подробная шаг за шагом протокол о том, как реализовать ZIF технологии для доставки белка в клетках млекопитающих представлена. Ранее мы построили набор одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти- и шести пальцев ZIF домены, которые не обладают способностью связывать ДНК, в связи с заменой каждого из ДНК-связывающих остатков α-спиральные, но способных доставлять белки в клетках 34 (Рис 1). Производство и трансдукция Изумрудного GFP (EmGFP) в HeLa клеток, используя два пальца ZIF домен описано. Этот протокол является расширяемым почти любого белка, способного растворимого выражения в кишечной палочки и практически любой млекопитающих типа клеток. Ожидаемые результаты предоставляются и стратегии для максимизации производительности этой системы также обсуждается.
Здесь шаг за шагом протокол для доставки белка с помощью мобильного проницаемым цинка палец (ZIF) домены представлена. Домен ЗиФ не снизить активность плавленого ферментативной груза 34; позволяет для производства и очистки белков урожайности почти идентичны тем, которые наблюдаю?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DP1CA174426 Карлоса Ф. Barbas) и ShanghaiTech университета, Шанхай, Китай (до JL). Молекулярные графика были получены с использованием PyMOL.
XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
SacI | New England Biolabs | R0156L | |
Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |