Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme
Summary
Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.
Abstract
This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.
Introduction
hücre döngüsü ilerlemesi sırasında hücre döngüsü özellikleri ve hücrelerde meydana gelen değişikliklerin değerlendirilmesi biyolojisi, özellikle kanser biyolojisi birçok yönünü anlamak için esastır. Malignitelerin tedavisi için geliştirilmesinde bir çok madde, hücre döngüsü ilerlemesi üzerinde derin etkilere sahip ya da hücre devre bağımlı-mekanizmalar yoluyla hücre ölümüne neden olmaktadır. Hücre döngüsünün belirli fazında hücre döngüsü dinamikleri veya hücreleri incelemek için, bu hücrelerin senkronize olağandır. Ancak senkronizasyon yöntemleri potansiyel sonuçlar elde karıştırıcı, çalışılan hücreleri üzerinde zararlı etkileri olabilir. 1 zamanla tek hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin son hücrelerin döngüsünün belirli aşamalarında sadece mevcut floresan isim levhası proteinlerin kullanılmasına izin var analizi 2, bununla birlikte, bu hücreler, genetik olarak okunabilir sistemlere kullanımlarını sınırlayan, bu etiketlenmiş proteinlerin sentezlenmesi için manipüle edilmesi ihtiyacı incelenecekily elde etti.
(S) faz DNA çoğaltılır ve mitoz (M) burada hücre bölünmesi gerçekleşir: hücre döngüsü, iki aktif aşamadan oluşmaktadır. Bu fazlar, üç boşluk fazlar, G 0, G1 ve G2 ile ayrılır. Hücreler boyutu önceden hücre büyümesi DNA replikasyonu tamamlanması arasındaki fakat hücre bölünmesi öncesinde devam DNA replikasyonu ve G 2 artırmak nerede G 0 ya da sessizlik, hücre döngüsünü terk etti bir dinlenme aşamasıdır, G 1'dir. hücre döngüsü yoluyla ilerleme kontrol noktaları bir dizi tarafından kontrol edilir. Çevre koşulları, DNA sentezinin destekleyici değildir ve S fazına girişi önler G 1 kapısı aktive edilir. içi S fazı kapısı veya gecikme durdu çoğaltma çatal yol açabilir DNA hasarı ile tetiklenebilir. Hasar G 2 sonra tespit edilirse G 2 Sırasında çoğaltılan DNA sadakat onaylanır ve </sub> Denetim noktası bölümü hücre DNA tamir önce izin aktive edilir. Mitoz sırasında son bir kontrol noktası o hücre bölünmesi başarıyla tamamlandı böylece kromatidler doğru mitotik plakada hizalanmış olduğunu garanti eder. Bu kontrol noktalarında 3 aktivasyonu yaygın hücre popülasyonlarının eşitlemek için kullanılır. Hücre döngüsü kontrol noktası, bir dizi faktöre göre ancak en yaygın DNA hasarının tespiti, Kanser biyolojisinde etkinleştirilebilir. DNA hasar cevabı (ATR) ile ilgili PI3-kinaz benzeri kinazlar ataksi telenjiektazi ve RAD3 tarafından başlatılan ve ataksi telenjiektazi (ATM) sırasıyla aşağı efektör kinazları CHK1 ve Chk2 aktive olduğu mutasyona uğramış. 3 olaylar bir dizi durdu dahil CHK1 aktive çoğaltma çatal, DNA çapraz bağlarının ve ultraviyole radyasyon hasarı Chk2 öncelikle çift iplikli kırılmalara tarafından aktive ediliyor.
hücre döngüsü i uzunluğuna değiştirilmiş koşullarının etkisini incelemek için her zamanki yöntemis hücre döngüsü belirli bir aşamasında hücreleri senkronize etmek. 1. Bu çeşitli yöntemler ile elde edilebilir. Hücreler fiziksel boyutu, yoğunluk, yan dağılım (parçalı) ve hücre yüzey ifadesi belirteçleri dayalı ayrıştırılır edilebilir. Daha pratik hücreleri kimyasal yollarla senkronize edilebilir. Örneğin timidin, hidroksiüre ve sitosin arabinosid gibi çeşitli ajanlar ajanlar çıkarıldıktan sonra bisiklet devam S fazında hücrelerin birikimiyle sonuçlanır hücre döngüsünün S fazında DNA sentezini inhibe etmek için de kullanılabilir. Veya M-fazı DNA içeriğinin – Hücreler G 2 mitotik iğ oluşumunu tutuklama önler nokodazolun ile işlemden geçirildi. G 0 aşamasında hücrelerin birikimi kültür ortamı sonuçlarından serum ortadan kaldırılması. kültür, serum içindeki besinlerin yeniden eklenmesi hücrelerinin normal bisiklet yeniden başlatır. Ancak, bu senkronizasyon yöntemlerinin tüm hücrelerin normal bisiklet ve büyüme ile müdahale ve resul edebilirsinizönemli bir hücre ölümü t.
Akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin Senkronizasyon özellikle zor olduğu ve bu hücreler genetik manipülasyon için uygun değildir. Burada tarif edilen yöntem, hücre döngüsü dinamiklerinin değerlendirme ve geleneksel senkronizasyon veya genetik değişiklik yapılmadan hücre döngüsünün belirli aşamalarında hücreleri çalışmasına izin verir. Bu yöntem, aynı zamanda genetik modifikasyon ve geleneksel senkronizasyon işlemleri kolayca elde olmayan diğer hücre türleri için yararlı olabilir. yöntem hücrelerin kısa vadeli büyüme ve çoğalması üzerinde çok az etkiye sahiptir bromodeoksiüridin (BrdU) Kuruluş, uzun kurulan kullanımına dayanmaktadır. 4 Kuruldu BrdU protokolleri S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine BrdU dahil yararlanmak . Bu kalıcı BrdU maruziyeti sırasında S fazında yapılmış olan olarak hücreleri işaretler. Bu popülasyon BrdU incorpor için boyama daha sonra zaman noktalarında tespit edilebilirtirme ve böylece takip ve hücre döngüsü transit uyuşturucu etkileri çalışma izin zamanla değerlendirilebilir senkronize nüfus olarak hareket ederler. BrdU genellikle DNase veya asit tedaviden sonra elde önce antikor boyama maruz kalması gerekir. 6,7 dahil BrdU ek markörler dahil sağlayan tespit etmek için akış sitometrisi kullanılarak. En önemli çalışma başlangıcında S fazında olan hücrelerin, hücre döngüsü faz dağılımının değerlendirilmesini sağlayan DNA içeriğini ölçmek için boyalar kullanılmasıdır. 8 Ayrıca ek yüzey ya da hücre içi antijenler de incelenebilir. 9 Bu Böyle Ki67 gibi hücre döngüsü olaylarla ilgili ya da bölünmüş kaspaz-3 gibi apoptoz belirteçlerinin olarak görünüşte ilgisiz hücre özellikleri olabilir. potansiyel uygulamalar araştırmacı hayal gücü ile sınırlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre döngüsü analiz yeteneği kanseri biyoloji anlaşılması ve hücre çoğalmasını ve büyümesini etkileyen iki ilaç ve gen hareket mekanizması için çok önemlidir. Bildirildi hücre çoğalmasını ölçmek deneylerinde bir sayıda olsa da, çoğunluğu sadece Halen mevcut hücreleri gösteren bir ölçü sağlar. Bu doğrudan görselleştirme ve sayma, metabolik aktivite veya ATP konsantrasyonu ile hücre sayısını ölçmek deneyleri içermektedir. Bu yöntemlerin çoğu temel avantajı, koşullar ya …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).
Materials
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25mL | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200µL | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1mL | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G., Banfalvi, G. . Methods Mol Biol. 761, 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
