Temporal Sporing av cellecyklusprogresjonen Bruke flowcytometrisystemer uten behov for synkronisering

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av bromdeoksyuridin (BrdU) opptak for å tillate den temporale sporing av celler som var i S-fasen ved et bestemt tidspunkt. Tilsetning av DNA-fargestoffer og antistoffmerking muliggjør detaljert analyse av skjebnen til S-fasen cellene på senere tidspunkt.

Abstract

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Introduction

Vurderingen av cellesyklus og endringer som oppstår i cellene under cellesyklusprogresjon er grunnleggende for å forstå mange aspekter av biologi, spesielt kreft biologi. Mange midler under utvikling for behandling av maligniteter ha betydelig effekt på cellesyklusprogresjon eller indusere celledød via cellesyklusavhengig-mekanismer. For å undersøke cellesyklus dynamikk eller celler i en bestemt fase av cellesyklusen, er det vanlig å synkronisere cellene. Imidlertid synkroniseringsmetoder kan ha skadelige effekter på cellene som blir studert, potensielt samvirkende oppnådde resultatene. ^En nylig bruk av fluorescensmerket proteiner som bare er til stede i bestemte faser av celler syklusen har tillatt analyse av cellesyklusutvikling i enkeltceller over tid ^2, men cellene som skal studeres trenger å bli genetisk manipulert til å uttrykke disse merkede proteiner, noe som begrenser deres anvendelse til systemer hvor det kan lesesily oppnådd.

Cellesyklus består av to aktive faser: syntese (S) fase, hvor DNA blir replikert og mitose (M) hvor celledelingen foregår. Disse fasene er adskilt av tre gap faser, ₀ G, G ₁ og G _2. G ₀ eller quiescence, er en hvilefase, hvor cellen har forlatt syklusen, G er _en hvor cellene øke i størrelse før DNA-replikasjon og G _2, hvor celleveksten fortsetter mellom fullføring av DNA-replikasjon, men før celledeling. Den progresjon gjennom cellesyklus styres av en rekke kontrollpunkter. G _en kontrollpost blir aktivert når miljøforholdene ikke er støttende for DNA-syntese og forhindrer inntreden i S-fasen. Intra-S fasen sjekkpunkt eller forsinkelse kan utløses av DNA skader som kan resultere i fastlåste replikering gafler. Under G ₂ gjengivelsen av det replikert DNA bekreftes og hvis skaden blir oppdaget deretter G ₂ </sub> sjekkpunkt aktiveres tillater DNA reparasjon før celledeling. Et siste sjekkpunkt under mitose sikrer at kromatider er riktig justert på mitotisk platen slik at celledelingen kan være fullført. ³ Aktivering av disse sjekkpunkter er vanligvis brukes til å synkronisere cellepopulasjoner. Cellesykluskontrollpunkter kan aktiveres av en rekke faktorer, men i kreft biologi de mest vanlige er påvisning av DNA-skade. Den DNA-skade responsen initiert av PI3-kinase-lignende kinaser ataxia telangiectasia og Rad3 relatert (ATR) og ataxia telangiectasia mutated (ATM) som aktiverer nedstrøms effektor kinaser Chk1 og Chk2, respektivt. ³ en rekke arrangementer aktiverer Chk1 inkludert fastlåste replikering gafler, DNA kryssbindinger, og ultrafiolett stråling skader mens Chk2 er primært aktiveres av dobbel tråd pauser.

Den vanlige metode for å studere effekten av endrede betingelser av lengden av cellesyklusen is å synkronisere cellene i en bestemt fase av cellesyklusen. ^1. Dette kan bli oppnådd via flere metoder. Celler kan separeres fysisk på grunnlag av størrelse, tetthet, side scatter (granularitet), og celleoverflate-ekspresjon markører. Mer praktisk, kan cellene bli synkronisert ved hjelp av kjemiske midler. Flere midler slik som thymidin, hydroksyurea og cytosinarabinosid kan brukes til å inhibere DNA-syntese i S-fasen av cellesyklus som resulterer i en akkumulering av celler i S-fasen som fortsetter etter sykling midlene er fjernet. Celler behandlet med nocodazol, som hindrer dannelsen av den mitotiske spindel, rest med en G ₂ – eller M-fase DNA-innhold. Eliminering av serum fra kulturmediet resulterer i akkumulering av celler i G ₀ fase. Den gjen tilsetning av næringsstoffer i kulturen serum gjen starter normal sykling av cellene. Men alle disse synkroniseringsmetoder forstyrre normal sykling og vekst av celler og kan Result i betydelig celledød.

Synkronisering av akutt lymfatisk leukemi cellene er spesielt utfordrende og disse cellene er ikke mottagelig for genetisk manipulasjon. Metoden som beskrives her muliggjør vurdering av cellesyklus dynamikk og studiet av celler i bestemte faser av cellesyklusen uten tradisjonell synkronisering eller genetisk modifisering. Denne metoden kan også være nyttig for andre celletyper hvor genetisk modifisering og synkroniserings tradisjonelle fremgangsmåter er ikke lett oppnås. Metoden er basert på veletablert bruk av bromdeoksyuridin (BrdU) innlemmelse, som har svært liten innvirkning på den kortsiktige vekst og spredning av celler. ⁴ Etablert BrdU protokoller dra nytte av inkorporering av BrdU inn nylig syntetisert DNA under S fasen . Dette markerer permanent celler som har vært i S-fasen i løpet av BrdU eksponering. Denne befolkningen kan identifiseres ved senere tidspunkter ved farging for BrdU incorporasjon og derved fungere som en synkronisert populasjon som kan følges og vurderes over tid tillater studiet av legemiddeleffekter på cellesyklus transitt. BrdU trenger å bli utsatt før antistoffarging, vanligvis oppnås etter DNase eller syrebehandling. ^6,7 ved hjelp av flow-cytometri for å detektere inkorporerte BrdU muliggjør inkludering av ytterligere markører. Det viktigste er bruk av fargestoffer for å måle DNA-innhold, slik at vurderingen av cellesyklus fasefordeling av cellene som var i S-fasen ved starten av studien. ⁸ Videre ytterligere overflate eller intracellulære antigener kan også bli undersøkt. ⁹ Disse kan forholde seg til celle syklus hendelser som Ki67 eller tilsynelatende urelaterte cellefunksjoner som apoptose markører som kløyvet caspase-3. De potensielle bruksområder er begrenset av fantasien til etterforskeren.

Protocol

Protokollen er beskrevet her anvender akutt lymfoblastisk leukemi-cellelinje NALM6 men kan anvendes på andre celletyper. 1. Solutions og reagenser Komplett RPMI Legg 56 ml kalvefosterserum (FCS) og 5,5 ml 200 mM L-glutamin til en 500 ml flaske med RPMI-1640 medium. BrdU Stock Solution Forbered 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS). BrdU Komplett RPMI Legg 6.2 mL av BrdU stamløsnin…

Representative Results

Metoden kan brukes for å oppnå et utvalg av informasjon. Noen søknader er beskrevet her. Vurdering av varigheten av cellesyklus For å bestemme den tid som kreves for celler til transitt gjennom cellesyklus, blir cellene høstet ved forskjellige tidspunkter etter den BrdU puls. Intervallene mellom vurderinger kan tilpasses de spesielle cellene som blir analysert. Hematopoetiske cellelinjer ble undersøkt hver time over en 24 timers periode i fravær av enhver …

Discussion

Evnen til å analysere cellesyklus er viktig for forståelsen av kreft biologi og virkningsmekanismen av begge legemidler og gener som påvirker celleproliferasjon og vekst. Mens det er en rekke analyser som angivelig måler celleproliferasjon, bare flertallet gi et mål som angir antall celler tilstede. Disse inkluderer analyser som måler celle nummer ved direkte visualisering og telling, metabolsk aktivitet eller ATP konsentrasjon. Den største fordelen med mange av disse metodene er at de er forholdsvis enkle å utf…

Materials

APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Referred to as Wash buffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fetal Bovine Serum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150cm2 vented Flasks	BD Biosciences	355001
Pipettes 25mL	Greiner	760180
Aersol Pipettes 200µL	Interpath	24700
Aersol Pipettes 1mL	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 incubator	Binder	C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128