Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.
Abstract
This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.
Introduction
De beoordeling van de celcyclus eigenschappen en veranderingen die optreden in cellen tijdens de celcyclus is essentieel voor het begrijpen van vele aspecten van de biologie, in het bijzonder kanker biologie. Vele middelen in ontwikkeling voor de behandeling van maligne aandoeningen ingrijpende effecten op celcyclusprogressie en celdood induceren via celcyclus afhankelijke mechanismen. Om celcyclus dynamics of cellen te bestuderen in een bepaalde fase van de celcyclus, is het gebruikelijk om cellen te synchroniseren. Echter synchronisatiemethode kunnen nadelige effecten hebben op de cellen bestudeerd, potentieel verwarrende resultaten verkregen. 1 Onlangs het gebruik van fluorescent gelabelde eiwitten die alleen aanwezig op bepaalde stadia van de cyclus cellen hebben het mogelijk analyse van de celcyclus in individuele cellen in de tijd 2, maar de cellen te bestuderen moeten genetisch worden gemanipuleerd om deze gemerkte eiwitten tot expressie, beperkt het gebruik ervan tot systemen waarop dit kan worden gelezenily bereikt.
De celcyclus bestaat uit twee actieve fasen: de synthese (S) fase, waarin DNA wordt gerepliceerd en mitose (M), waar de celdeling plaatsvindt. De fasen worden gescheiden door drie spleet fasen G 0, G 1 en G2. G 0 of rust, een rustfase waarin de cel cyclus heeft verlaten, G 1 is waar de cellen in omvang toenemen voorafgaand aan DNA-replicatie en G 2 waarbij celgroei verder tussen de voltooiing van DNA-replicatie maar vóór de celdeling. Het doorlopen van de celcyclus wordt geregeld door een aantal checkpoints. De G 1 checkpoint wordt geactiveerd wanneer milieu-omstandigheden zijn niet ondersteunend van DNA-synthese en voorkomt toegang tot de S-fase. Het intra-S-fase checkpoint of vertraging kan worden veroorzaakt door DNA-schade die kan leiden tot stilstand gekomen replicatie vorken. Tijdens G 2 de trouw van de gerepliceerde DNA wordt bevestigd en als er schade dan wordt gedetecteerd de G 2 </sub> checkpoint wordt geactiveerd waardoor DNA-reparatie voor celdeling. Een laatste checkpoint tijdens de mitose zorgt ervoor dat chromatids correct zijn uitgelijnd op de mitotische plaat zodat celdeling met succes kan worden afgerond. 3 Activering van deze controleposten wordt vaak gebruikt om celpopulaties te synchroniseren. Celcyclus kan worden geactiveerd door een aantal factoren, maar in kankerbiologie de meest voorkomende is detectie van DNA schade. De DNA schade respons wordt geïnitieerd door de PI3-kinase-kinases ataxia telangiectasia en Rad3 verwante (ATR) en ataxia telangiectasia gemuteerd (ATM) de stroomafwaartse effector kinases Chk1 en Chk2 activeren resp. 3 een reeks gebeurtenissen activeert Chk1 inclusief stilstand replicatievorken, DNA verknopingen en ultraviolette straling beschadiging tijdens Chk2 wordt hoofdzakelijk geactiveerd door dubbelstrengige breuken.
De gebruikelijke methode voor het bestuderen van het effect van veranderde condities op de lengte van de celcyclus is om de cellen te synchroniseren in een bepaalde fase van de celcyclus. 1 Dit kan via verscheidene werkwijzen. Cellen kunnen fysisch gescheiden worden op basis van grootte, densiteit, zijwaartse verstrooiing (korreligheid) en expressie aan het celoppervlak markers. Meer praktisch kunnen cellen worden gesynchroniseerd door chemische middelen. Diverse middelen zoals thymidine, hydroxyurea en cytosinearabinoside kan worden gebruikt om DNA-synthese te remmen in de S-fase van de celcyclus resulteert in een accumulatie van cellen in de S fase die cycling voortgezet nadat de middelen worden verwijderd. Cellen behandeld met nocodazole, die de vorming van de mitotische spoel, aanhouding wordt gevormd met een G 2 – of M-fase DNA gehalte. Verwijdering van serum uit het kweekmedium resulteert in de accumulatie van cellen bij G 0 fase. De hernieuwde toevoeging van nutriënten in de kweek serum opnieuw start de normale cyclus van de cellen. Echter, al deze synchronisatiemethode hindert tijdens fietsen en de groei van cellen en kan Result in significante celdood.
Synchronisatie van acute lymfatische leukemie cellen is bijzonder uitdagend en deze cellen zijn niet vatbaar voor genetische manipulatie. De hier beschreven methode laat de beoordeling van de celcyclus dynamiek en het onderzoek van cellen in bepaalde fasen van de celcyclus zonder de traditionele synchronisatie of genetische modificatie. Deze werkwijze kan ook nuttig zijn voor andere celtypen indien de genetische modificatie en traditionele synchronisatieprocedures zijn niet gemakkelijk verwezenlijkt. De methode is gebaseerd op de reeds lang bestaande gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) integratie, die zeer weinig invloed op de groei op korte termijn en de proliferatie van cellen heeft. 4 Opgericht BrdU protocollen profiteren van de incorporatie van BrdU in nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S-fase . Dit markeert permanent cellen bij blootstelling BrdU in de S-fase te zijn geweest. Deze populatie kan op latere tijdstippen worden geïdentificeerd door kleuring BrdU incorporatie en daarmee fungeren als een gesynchroniseerde bevolking die kunnen worden gevolgd en beoordeeld in de tijd het toelaat de studie van de effecten van geneesmiddelen op de celcyclus transit. BrdU blootgesteld dient te worden vóór antilichaamkleuring, gewoonlijk bereikt na DNase of zuurbehandeling. 6,7 behulp van flow cytometrie op te sporen opgenomen BrdU maakt de opneming van bijkomende markers. Het belangrijkste is de toepassing van kleurstoffen om DNA gehalte te meten, waardoor de beoordeling van de celcyclus faseverdeling van de cellen die aan het begin van het onderzoek waren in de S-fase. 8 bovendien extra oppervlak of intracellulaire antigenen kunnen ook worden bestudeerd. 9 Die kunnen betrekking hebben op celcyclus gebeurtenissen zoals Ki67 of schijnbaar niets cel functies zoals apoptose markers zoals gesplitst caspase-3. De toepassingsmogelijkheden worden beperkt door de verbeelding van de onderzoeker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om de celcyclus analyse is belangrijk voor het begrijpen van kankerbiologie en het werkingsmechanisme van beide geneesmiddelen en genen die de celproliferatie en groei beïnvloeden. Hoewel er een groot aantal assays die naar verluidt meten celproliferatie, de meeste geven slechts een maatregel die het aantal cellen aanwezig aangeeft. Deze omvatten testen die het aantal cellen door directe visualisatie en tellen, metabole activiteit of ATP concentratie te meten. Het belangrijkste voordeel van veel van deze w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).
Materials
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75-mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25mL | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200µL | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1mL | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G., Banfalvi, G. . Methods Mol Biol. 761, 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
