Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בו זמנית Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52855
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

Introduction

Electroretinogram (ERG) הוא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן להשתמש כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית מופעלת על ידי אור. אות ERG מופקת בעיקר משינויי מתח שנגרמו על ידי זרמי רדיאלי (לאורך הציר של קולטני האור ותאים דו קוטביים) זורמים במרחב תאי ההתנגדות של הרשתית. אות ERG הראשונה נרשמה בשנת 1865 על ידי הולמגרן מפני שטח של עין דג 1. Einthoven וJolly 1,908 2 חילקו את תגובת ERG לתחילתה של אור לשלושה גלים שונים, נקראת a-, B-, וג-גלים, שכיום ידועים שישקפו בעיקר את הפעילות של קולטני האור, על תאים דו קוטביים, ואפיתל הפיגמנט תאים, בהתאמה 3-8. ניתן להקליט ERG מהעיניים של בעלי חיים או בני אדם (in vivo) בהרדמה, מהכנת עין מבודדת 9, על פני רשתית שלמה מבודדת (לשעבר vivo) 3,10-15 או על פני שכבות רשתית ספציפיות עם microelectrodes (מקומיERG) 4,16. מבין אלה, in vivo ERG הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד רשתית. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול לשמש למטרות אבחון או למעקב ההתקדמות של מחלות רשתית בבעלי חיים או חולים. עם זאת, בvivo הקלטות ERG לייצר אות מורכבת עם מספר מרכיבים חופפים, לעתים קרובות מזוהמות ברעש extraocular הפיזיולוגי (למשל, נשימה ופעילות לב).

ERG המקומי ניתן להשתמש כדי להקליט את האות על פני שכבות מסוימות של הרשתית אבל זה חודרני ביותר ויש לו את היחס הנמוך ביותר אות לרעש (SNR) בהשוואה לתצורות הקלטת ERG האחרות. ERG המקומי הוא גם תובעני מבחינה טכנית ודורש ציוד יקר (למשל, מיקרוסקופ וmicromanipulators). Transretinal ERG מהרשתית שלמה, מבודדת (לשעבר vivo ERG) מציע פשרה בין in vivo ושיטות ERG מקומיים המאפשרת יציב וHIGהקלטות h SNR מרשתית שלמה של בעלי חיים או בני אדם 17. לאחרונה, שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד לתפקד מוט וקולטי אור חרוט ברשתית של יונקים, קופים ובני אדם 18-20. בנוסף, בשל היעדר אפיתל הפיגמנט ברשתית vivo לשעבר, מרכיב ג-הגל החיובי של אות ERG מוסר ורכיב איטי שלילי בולט PIII מתגלה בvivo לשעבר ההקלטות. רכיב PIII האיטי הוכח מקורן את הפעילות של תאי גליה מולר ב21-23 הרשתית. לפיכך, לשעבר vivo שיטת ERG יכול לשמש גם כדי ללמוד תאי מולר ברשתית ללא פגע. גם מספר מחקרים הראו כי vivo לשעבר הקלטות ERG יכולים לשמש למדידת ריכוז של סוכנים תרופתיים סביב 24 הרשתית ולבדוק את הבטיחות ויעילות של תרופות 25-27.

מסחרי מרובים במערכות vivo זמינים ומשמש במעבדות רבות שלא בהכרח יש לי רקע אלקטרופיזיולוגיה נרחב. לעומת זאת, מכשירי vivo לשעבר לא היו זמינים עד לאחרונה 17 וכתוצאה מכך רק מעט מאוד מעבדות כיום מנצלות טכניקה רבת עוצמה זו. זה יהיה מועיל לבצע הקלטות vivo לשעבר ERG זמינים ליותר מעבדות במטרה לקדם את הידע שלנו על פיזיולוגיה והפתולוגיה ברשתית, ולפתח טיפולים חדשים למחלות מסנוורים. אנו מדגימים כאן מכשיר vivo לשעבר ERG פשוט ובמחיר סביר 17 ולהראות כיצד ניתן להשתמש בו בשילוב עם מספר מערכות vivo ERG הזמינים מסחרי בלהקליט איתות rod- ותיווך קונוס (a- וB-גלים) והפונקציה של תאי מולר (להאט PIII) מרשתית עכבר wild-type בשלמותה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי היו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים המחקרים המוסדית באוניברסיטת וושינגטון.

1. הגדרה מחזיק זלוף והדגימה

  1. הכן את הפתרון לזלוף הרשתית טרי ביום של הניסוי. השתמש במים מזוקקים וללא יונים. השתמש באחד משלושת הפתרונות הבאים.
    1. הכן יקרבונט המכיל 'הפתרון (1 ליטר): 1 בקבוק איימס' איימס התקשורת ו1.9 גרם של NaHCO 3,
    2. הכן את הפתרון של לוק (מ"מ): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 3 NaHCO, 3.0 Na succinate, 0.5 גלוטמט Na, 0.02 EDTA, ו10.0 גלוקוז, ויטמיני ממ 0.1% ואמין חומצות
    3. פתרון HEPES שנאגר להכין רינגר (מ"מ): 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 גלוקוז, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pHמותאם ל7.5 עם ~ 5.8 מיליליטר של 1 M NaOH, להוסיף L-15 0.72 גר '/ בינוני תרבות L ליבוביץ. השתמש 20-50 מיקרומטר DL-AP4 ו50-100 מיקרומטר BaCl 2 לבודד את תגובת קולטי האור בכל מדיה זלוף.
  2. הכן את הפתרון לאלקטרודות 28 (מ"מ): 140.0 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3 HEPES, 0.01 EDTA ולהתאים את ה- pH ל7.4-7.5 עם NaOH. פתרון אלקטרודה ניתן לאחסן ב RT במשך כמה חודשים.
  3. להכין ולבדוק את בעל הדגימה.
    1. דבק נייר שחור / אפור מסנן על גבי הכיפות של חלק התחתון של בעל הדגימה (ראה איור 1 א). מורחים דבק אפוקסי 5 דקות שני מרכיבים בזהירות מסביב לקצוות של צמרות שטוחות של הכיפות. אם יש צורך, לעשות את זה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
    2. חכה עד שהדבק הוא (כ -4 דקות) כמעט יבשות ולחץ על נייר הסינון על הכיפות באמצעות פריט שטוח. נייר סינון דבק לפחות יום אחד לפני הניסוי.נייר סינון ניתן להשתמש מספר פעמים אבל יש להחליף אחרי חודש של הקלטות. השתמש 70% אתנול לנקות כיפות בזהירות מכל שאריות דבק לפני התקנת נייר ההחלפה.
    3. מלא את ערוצי אלקטרודה עם פתרון אלקטרודה מנסה להימנע מכל בועות אוויר ולדפוק אלקטרודות גלולה סגורות עם מתאם הברגה לערוצי אלקטרודה (ראה איורים 1 א 'וב'). חבר את החתיכות העליונה ותחתונים של בעל הדגימה עם ארבעה ברגים ולמלא את שורות זלוף עם פתרון אלקטרודה.
    4. מדוד את ההתנגדות ומתח בין המוביל של כל זוג האלקטרודה באמצעות מודד (איור 1). התנגדות צריכה להיות מתחת ל -100 Ωk והמתח מתחת ל -10 mV אם הערוצים ללא בועה ואלקטרודות נמצאות במצב טוב.
  4. יוצקים 400-700 מיליליטר של תקשורת זלוף בבקבוק הזכוכית. נפרד עוד 300 מיליליטר לשימוש בנתיחה של הרשתית ושלקרע אותו במקרר. הגדר את צינורות טפטוף בבלוק מחליף חום ולמקם את הבלוק שחומם מראש על צלחת החימום (ראה איור 1D).
  5. הקף את הבקבוק עם מכסה שיש לו קשרים ל- CO 2 / O 2 גז (אם לוק של איימס "או משמש) ולצינורות טפטוף (ראה איור 1D). מחממים את הבקבוק עם התקשורת עד 37 מעלות צלסיוס ולמקם אותו על צלחת החימום או על החלק העליון של יחידת גירוי האור באמבט מים מוגדר 37 - C 39 O 17.
    1. ראש קווי זלוף על ידי מילוי אותם עם תקשורת זלוף ליזום הזרימה מונעת כוח המשיכה.
      1. במערכת LKC, הנח את הבקבוק בחלק העליון של יחידת ממריץ 17 כדי לספק זרימה הכבידתית משמעותית שמותאמת לאחר מכן על ידי רגולטורי זרימת שיעור בלי שהושפע מרמת ההפחתה של פתרון זלוף בבקבוק במהלך הניסוי.
      2. במערכת Ocuscience, למקם את pבקבוק erfusion בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש ואת מקום קווי פלט זלוף ארוך מבעל הדגימה (ראה שלב 2.8) הרבה מתחת לרמתו של בעל הדגימה (ובקבוק זלוף) כדי להגדיל את כונן הכבידה של הפתרון. להגן על קווי פלט אלה ולחבר את המגן לקרקע של המגבר כדי למנוע צימוד של רעש האלקטרומגנטים לאות ERG.
  6. התאם את זלוף - 3 5 מיליליטר / דקה באמצעות רגולטורי ספיקה. חבר 2/95% גז 5% CO 2 O מגליל עם רגולטור נכון ולהתאים את קצב הזרימה על מנת להבטיח מבעבע קבועה של התקשורת בבקבוק באמצעות אבן אוויר.

הכנת 2. דוגמא

  1. להרכיב מכשירי נתיחה נקיים וחדים כולל microscissors ישר-להב, אחד או שתיים 45 o פינצטה, סכין גילוח ופיסת נייר סינון מלבני.
  2. יוצקים כ -200 מיליליטר של perfu הקרפתרון שיאון בצלחת פטרי גדולה כל כך שכל החלק התחתון של בעל הדגימה (כולל כיפות) יכול להיות שקוע בפתרון. צעד זה הופך להיות חשוב כאשר ההרכבה הרשתית על הכיפות (ראה שלב 2.6). למרות כמה פתרונות נועדו להיות רווי בcarbogen (5% CO 2/95% O 2), זה לא חיוני לצורך הנתיחה ולא נעשה בניסויים שתוארו כאן.
  3. לניסוי טיפוסי, לשמור על בעלי חיים ב12/12 שעות אפלים מחזור האור / וכהה להתאימם ל6-12 שעות לפני ההקלטות. להרדים את החיה משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם תחת אור אדום עמום ולעשות את כל ההליכים תחת אור אדום או IR העמום הבאים (השתמש למשל, מסנן אדום מול מקור מיקרוסקופ האור).
    1. משוך את העיניים החוצה באמצעות פינצטה ולשים אותם בתקשורת. מניחים עין אחת בכל פעם על פיסת נייר קטנה (למשל, כמה נייר סינון רגיל) ולעשות כהדליק כ ברמה של serrata אורה תוך החזקת עין עם פינצטה (זה נעשה מחוץ לפתרון כאן).
  4. לחתוך לאורך serrata אורה (או קרוב יותר לקו המשווה של העין) עם microscissors ולהסיר את הקרנית והעדשה. מניחים את כוס עין בתקשורת הקרה בצלחת פטרי הגדולה וחזור על אותו התהליך עם העין השנייה.
  5. לחתוך חתך קטן מהחלק העליון של כוס עין לכיוון עצב הראייה על ידי שמירה על המספריים בין הרשתית ולובן העין על מנת לשמור על הרשתית כשלמה ככל האפשר. אחיזה בלובן העין משני צידי החתך באמצעות שתי פינצטה ולמשוך את פינצטה אחד משני כדי לנתק את הרשתית.
    1. חותך את עצב הראייה ולנסות לבודד את הרשתית עם כמות מינימאלית של מגע פיזי אל פני השטח דיסטלי. הרשתית תהיה בעיקר לנתק באופן אוטומטי מהרשתית במהלך תהליך הנתיחה. חשוב יותר, כדי למנוע הפרעה מכאנית של הרשתית מאשר לבצענתיחה במהירות, בדרך כלל ניתן מודגרות רשתית לפחות 30 דקות בפתרון ללא השפעה משמעותית על מאפייני התגובה.
  6. הר הרשתית על הכיפות של בעל הדגימה (איור 1 ג). לטבול את החלק התחתון של בעל הדגימה בצלחת פטרי עם הרשתיות גזור. חלק את הרשתית, צד קולטי האור (המשטח הקמור של הרשתית המבודדת) כלפי מעלה, מעל לכיפה ולהרים את בעל הדגימה כך שהרשתית מצרפת על נייר הסינון. חזור על התהליך עבור הרשתית אחרת.
  7. ייבש את צלחת בעל בזהירות כדי למנוע crosstalk החשמלי בין הרשתיות כמו גם הסטת רעש ואות. יש בעל דגימת O- טבעות סביב כיפות חלק התחתונה כדי למנוע דליפת פתרון בין התחתית והחלקים העליונים של בעל, כמו גם לעזור לבידוד חשמלי של הצדדים קולטי האור ותא גנגליון של הרשתית בודדת. צרף את החלק העליון של בעל עם ארבעה ברגים (ראה איור 1) ולמלא את ערוצי זלוף עם פתרון זלוף באמצעות מזרק ומחט.
  8. העבר את בעל הדגימה ליד הבלוק מחליף החום ולחבר את קווי קלט והפלט זלוף לבעל הדגימה (1D איור). חבר את האלקטרודות למגבר ERG (אלקטרודות העליונה להתחבר לאדמה / מינוס הסיכה במגבר) ולצרף את יחידת ממריץ / שליטה בבעל הדגימה באמצעות מתאם או להחליק את כרית החימום ליחידת ממריץ תלוי באיזה in vivo משמשת מערכת ERG.

3. הקלטות

  1. הגדר את הגדרות מגבר וגירוי באמצעות התוכנה של מערכת in vivo. הגדר את תדירות הרכישה לערך בין 1 kHz ו -10 ונמוך לעבור סינון 300 הרץ. אל תשתמש בסינון גבוה לעבור. השתמש 60 הרץ (או 50 הרץ באירופה) לחרוץ מסנן במידת צורך.
  2. שיא בסיס ללא גירוי ושנינות אורh גירוי עמום (למשל., אור הירוק של -35 dB או 0.3 מ"ר MCD -2) לבדיקת חיבור חשמלי טוב בין האלקטרודות ומדגם רשתית. חכה 10 - 20 דקות לפני תחילת איסוף הנתונים, כך שטמפרטורה ובתפקוד רשתית להגיע למצב יציב.
    1. בחר פרמטרים גירוי פי כל ניסוי ספציפי ולהתחיל איסוף הנתונים. לדוגמא, משתמשת באור ירוק מ -40 עד 0 dB או מ0.1 עד 1,000 מ"ר MCD -2 למשפחת תגובת scotopic. השתמש על 2 עד 3 יומן-יחידות בהירות הבזקים בהקלטות photopic בי מוטות צריכה להיות מורחק על ידי אור הרקע (3-30 CDM -2) או הבזק בדיקה (מ"ר על 1.3 Cd -2 = dB 1, ראה איור 3).
    2. עם זאת, יש לזכור כי ערכי עוצמת אור המדויקים עשויים להיות מעט תלויים בכיול המערכת ותנאי ניסוי שלך. ככלל אצבע, בעוצמות בקנה מידה על ידי 5-10 פי לעומת in vivo 17. כיסוי שחור עם פתחים מעל הרשתית (הכלולה במערכת המתאם המסחרית) ניתן להשתמש כדי להפחית את פיזור אור בבעל הדגימה ולהקל גירוי אחיד ושווה של שני הרשתיות על ידי כדור Ganzfeld של במסחר vivo מערכות.
      הערה: להקלטות מרשתית כהה מותאם, בעוצמות של הבזקי בדיקה המשמשים באקונומיקת ניסוי טיפוסית חלק זניח בלבד של פיגמנט, כך שחוסר ההתחדשות מונעת הרשתית היא לא בעיה. בנוסף, זה כבר הראה בעבר כי התחדשות פיגמנט החרוט עדיין יכולה להתרחש ברשתית המבודדת באמצעות תא מולר המחזור 20 החזותי.
  3. כניסויים יימשכו בדרך כלל בין 30 דקות עד כמה שעות, לפקח להיסחף בסיסיים, רמת רעש ויציבות תגובה במהלך הניסוי כשינויים באלה עלולים להצביע על בעיות טכניות.
    רעש מוגבר או ירידה: הערהאמפליטודות תגובת ד עשויה להצביע על בועות אוויר בערוצי זלוף או אלקטרודה, טמפרטורה נמוכה מדי או גבוהה, פתרון דליפה / שפך או עקירה של הרשתית.

4. ניקוי

  1. לנתק את בעל דגימה מקווי זלוף, לפתוח אותו ולשטוף את הרשתית מנייר הסינון. הסר את האלקטרודות ולשטוף אותם במים מזוקקים (לא משתמש באתנול). נקה את בעל הדגימה (כולל ערוצי זלוף) עם אתנול ו / או מים מזוקקים. צינורות סומק זלוף בזהירות עם> 70% אתנול.
  2. יש לשטוף את בקבוק זלוף עם מים מזוקקים (לא משתמש בחומרי ניקוי). אתנול יכול לשמש גם כדי לנקות את הבקבוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקלטנו תגובות הבזק מסוג wild-כהה מותאם (WT) C57BL / 6 רשתית עכבר ידי ביצוע פרוטוקולי הניסוי שתואר לעיל ושמודגמים באיור 1 על ידי שימוש בפתרוני זלוף סטנדרטיים שונים (איור 2). גל התגובה וקינטיקה כמו גם הרגישות של קולטני אור מוט הופיעו דומים באיימס 'והתקשורת של לוק (איור 2 א' וב '). מצד השני, תחת פתרון HEPES שנאגר רינגר (לא O CO 2/95% ביקרבונט או 5% 2) אמפליטודות התגובה היתה קטנה יותר באופן משמעותי. מצאנו גם כי בתנאים אלה יציבות ב-גל הייתה בסכנה. הוספת 40 APB מיקרומטר (DL-AP4) הוסר ב-גל חיובי ביעילות בכל שלוש התקשורת (איורים 2D-F). הסרת ב-הגל חשפה גל גדול איטי שלילי (איור 2 ד) שיוחס לפעילות תאי מולר 21. הוספת 100 &956 #; M של בריום בוטל רכיב זה, חושף את תגובת קולטי האור של אות ERG vivo לשעבר (איורים 2D-F). אנחנו יכולים להקליט עד 1 תגובות קולטי האור mV רוויות באיימס 'ולוק של אילו תגובות מקסימליים היו בדרך כלל סביב 200 μV תחת זלוף רינגר.

תגובות קולטי האור קון היו מבודדות בעבר על ידי מה שנקרא טכניקת הבזק הכפול שבו הבזק בדיקה בהיר להרוות את המוטות ואחריו הבזק בדיקה בתקופה שבי קונוסים החזירו המדינה הכהה המותאמות שלהם, אבל מוטות להישאר רוויות 19,29. כאן אנו מבודדים תגובות ERG בתיווך חרוט (המכיל את שני a- וב-גל) בתקשורת "איימס בתוספת של בריום 100 מיקרומטר, אך לא DL-AP4 על ידי שימוש בטכניקה כפולה הבזק (איור 3). בריום שימש כדי להסיר את רכיב גליה האיטי שהופיע כדי להפוך את החלק המאוחר של התגובות משתנים יותר במיוחד בשימוש חוזר ונשנה של brighהבזקים לא. אנחנו השתמשנו בפלאש בדיקה מתמיד כדי להרוות מוטות והבזקי מבחן משתנים 300 אלפיות שניים לאחר הבדיקה הבזק לעורר תגובות קונוס. משפחת תגובת קונוס שהושגה על ידי הפחתת בדיקה תגובת הבזק מהתגובות "הבזק הבדיקה + בדיקה 'מוצגת באיור 3.

איור 1
מילוי איור 1. שימוש בבעל דגימת vivo לשעבר ERG. (א) לערוצי אלקטרודה והרכבה של האלקטרודות. (ב) בדיקה של בעל דגימה שנאסף לפני הנתיחה על ידי מדידת ההתנגדות ומתח בין זוגות אלקטרודה. הרכבה (C) של הרשתית על נייר הסינון בבעל הדגימה. (ד) בעל הדגימה מחובר לקווי זלוף ומגבר ERG בסאי ERG המסחרייםגזע. זרימת זלוף הנתיב מסומן בחצים כחולים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
משפחות איור 2. Flash תגובה נרשמו מהרשתית כהה מותאם WT עכבר perfused עם של לוק (), איימס '(B), ובינוני HEPES שנאגר רינגר (C). ההבזקים נמסרו 3, 40, 130, 390 ו1,400 הפוטונים מיקרומטר -2 (מ-36 ל-9 dB או -3.6 ל-0.9 יומן (ס"מ Cd -2) אור ירוק (530 ננומטר)). עקבות שחורות בתגובות הצג (DF) נרשמו מרשתית ב( AC) לאחר תוספת של 40 מיקרומטר APB ו -100 מיקרומטר בריום. עקבות אדומות בתגובות הצג (ד) נרשמו מהרשתית ב() perfused עימו של לוק בתוספת APB מיקרומטר 40 אבל לא בריום. הבלעה מראה את התגובות לשלושת ההבזקים הקלושים ביותר בתקשורת של לוק מכילה APB ובריום. ההבזקים נע בין 7 ל -14,000 פוטונים מיקרומטר -2 (מ-32 עד 1 אור הירוק dB) ב( ד '), בין 3 ל -1,400 פוטונים מיקרומטר -2 (מ-36 ל-9 dB אור ירוק) ב( E), וממיקרומטר 7 ל -1,400 פוטונים -2 (מ-32 ל-9 dB אור ירוק) ב( F). ראה Vinberg et al. 2,014 17 וLyubarsky et al. 1,999 30 ו2004 31 לפרטים של המרת אנרגיה זוהרת photopic ניתנה בCd מ"ר -2 לפוטונים מיקרומטר -2. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עומס / 52,855 / 52855fig3.jpg "/>
בידוד איור 3. תגובות קונוס עם שיטת הבזק כפולה בעכבר WT. (א) תגובה לבדיקת הבזק (מיקרומטר 14,000 פוטונים -2 או 1 אור ירוק dB, שחור) ותגובה לבדיקת הבזק ואחריו הבזק מבחן (81,000 מיקרומטר פוטונים -2 או 9 אור dB ירוק, אדום). (ב) תגובות פלאש קון לבדוק הבזקים החל 360 ל81,000 פוטונים מיקרומטר -2 (-14 עד 10 אור הירוק dB) המבודדים על ידי הפחתת תגובת הבזק בדיקה מ" בדיקה + בדיקת פלאש "תגובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מדגימים כאן את השלבים הקריטיים להשגת הקלטות vivo ERG לשעבר באיכות גבוהה בו זמנית משתי רשתיות עכבר מבודדות באמצעות רכיבים במערכת vivo ERG יחד עם vivo לשעבר מתאם ERG. במחקר זה אנו perfused שני הרשתיות מבעלי החיים עם אותו הפתרון (או איימס ', לוק של או רינגר) אבל זה גם אפשרי לינקב כל רשתית עם למשל פתרון שונה, למטרות בדיקת סמים. הצעדים החשובים ביותר לקבלת נתונים באיכות גבוהה הם מיגון מרעש אלקטרומגנטים, לנתיחה זהירה של הרשתית, יציב וזרימת זלוף מהירה יחסית על ידי שימוש בבעל דגימה שהותקן מתקדם, וביצוע כל הליכי הכנת המדגם תחת אדום עמום (או IR) אור. השיטה המתוארת כאן מאפשרת שימוש מיידי של שני הרשתיות והשימוש הכפול של התקנת ERG in vivo לבצע in vivo לשעבר הקלטות ERG vivo.

_content "> vivo לשעבר בעל דגימת ERG שהותקן נועד לאחרונה על ידי 17, ועכשיו זמין באופן מסחרי, משפר את יחס האות לרעש על ידי בידוד חשמלי יעיל של הפרוקסימלי וחלקים הדיסטלי של הרשתית ומייעלת את זרימת זלוף מעל הרשתית (שער החליפין גבוה פתרון .) היעדרות של רכיבי רעש בתדר האיטי באות vivo לשעבר ERG מאפשרת ניתוח כמו גם מתגובות קטנות מאוד עם זאת, מצאנו כי הקלטת vivo לשעבר היא נוטה יותר להפרעות של רעש קו AC-הכח (60 הרץ בארה"ב;. 50 הרץ באירופה) מאשר בvivo ניסויים. רעש זה מצמידים את האות בעיקר באמצעות קו זלוף, וזה יכולים להיות בעיקר הוסרו על ידי מגן (והארקה) כל רכיבי זלוף (בקבוק, צינורות) המתגורר מחוץ לתחום כלוב פאראדיי או Ganzfeld . בנוסף, לפעמים 60 הרץ רעש מצמידים את אות ERG vivo לשעבר דרך מחליף החום ורעש זה יכול גם להסיר על ידי הארקה. </ P>

אנו מדגימים כיצד להסיר רכיבי אות ERG ספציפיים על ידי הוספת חוסמי תרופתיים לזלוף במהלך הניסוי מאפשר לנתיחה של הפונקציה של סוגי תאים שונים באותו הרשתית / ניסוי עם שלוש תקשורת שונה פיזיולוגית זלוף (איור 2). מחקר שנערך לאחרונה הראה כי הבחירה של תקשורת זלוף משפיעה פיזיולוגיה קולטי האור בהקלטות תא בודדת 32. כאן אנו משמשים "לוק של, ו'איימס תקשורת 'HEPES-רינגר להקליט תגובות הבזק כהות מותאמת בהעדר והנוכחות של חומרים כימיים תרופתיים נועדו לבודד את מרכיב קולטי האור של אות ERG (איור 2). פתרונות שנאגרו ביקרבונט נתנו אמפליטודות a- וב-גל גדול יותר, עד 1 mV. תגובות הבזק קולטי האור עמומים תחת בינוני של לוק עם חוסמי הכילו צורת גל התאוששות מסובכת (ראה הבלעה של איור 2 ד) שלא ראה עם AmesR17; או זלוף רינגר. כאשר השימוש בvivo לשעבר ERG הופך מותאם על ידי מעבדות יותר יהיה זה מועיל להשתמש באותו כלי התקשורת זלוף ושיטות סטנדרטיים לבודד את רכיבי אות שונים. בשלב זה נראה שהאופציה צדדי ביותר היא המדיום 'איימס כי זה נותן לי אמפליטודות a- וב-גל יציב וגדולה. בנוסף, תגובת קולטי האור, פרמקולוגית מבודד בפתרון זה, נראה שיש לי צורת גל פשוט מזכיר שנרשם מקולטני אור יחיד (איור 2E). ובכל זאת, כמה שאלות פתוחות יישארו על קיומם של רכיבי אות אחרים ERG נצפו בתנאי in vivo. לדוגמא, בתנאים שלנו הקלטת vivo לשעבר לא ראו פוטנציאל oscillatory בולט, 100 - 150 הרץ גלי נדנוד שנצפו בדרך כלל בשלב של העלייה ב-גל in vivo תגובת ERG. יתכן אפוא שפונקצית הרשתית הפנימית בvivo לשעבר שלנו vivo לשעבר ב-גלים גדולים מעורבים קיימא על תפקוד תאים דו קוטבי. מחקרים עתידיים צריכים לפתור אם שינויים בפרוטוקולים הניסוי שמוצגים כאן (לנתיחה, וכו 'זלוף) תאפשר לנו להקליט פוטנציאלי oscillatory בתנאי vivo לשעבר.

פונקצית קון היא חיונית לחזון שלנו. עם זאת, חקירה של קונוסים הקשו על ידי גודלם הקטן ומחסור במיוחד בעכבר רשתית 33. בידוד של פונקצית קונוס מסתבך עוד יותר בהקלטות ERG עכבר כי יש לי M-קונוסים והמוטות שלהם רגישויות רפאים כמעט זהות 30. פרוטוקולים סטנדרטיים לנצל את הבדל יומן-יחידת מספר בין רגישויות מוט וחרוטים באמצעות אור רקע דיכוי-מוט. עם זאת, לאור רקע יציב ידוע להוריד את רמת רגישות מוטות 34,35 ולהשפיע על תפקוד קונוס אולי דרך אפנון של צימוד junctional פער בין מוטות קונוסים <sup> 36,37. לפיכך, קשה למצוא עוצמת אור רקע שהיא בהיר מספיק כדי לשמור על מוטות רוויות מבלי להשפיע על קונוסים. כאן אנו מדגימים שיטת הבזק כפולה חלופית שמנצלת הן את הרגישות וקינטיקה התאוששות מהירה יותר של קונוסים 19,29,30 נמוכות יותר. בדרך זו קל יותר לבודד תגובות בתיווך חרוט באמת-כהות מותאמות. שם לב שבאיימס "או הפתרונות של לוק ללא כל חוסמי, הפרטים של צורת גל ההתאוששות הושפעו במידה מסוימת במהלך הניסוי על ידי השימוש בהבזקי בדיקה ובדיקה בהירים. זה מסובך ניתוח החיסור כדי לבודד את תגובות קונוס. עם זאת, הסרת רכיב גליה ידי בריום עזרה לייצב את הזנב של התגובות המצביעות על כך ההשתנות הייתה בשל מרכיב תא מולר. בדרך זו ניתן היה להשיג את תגובות מונעים חרוט כהות מותאמות בעכברי WT (איור 3). תגובות קונוס מבודדים על ידי הבזק כפולטכניקה מעכברי WT הופיעה קטנה יותר בהשוואה לאלו שנרשמו מעכברי WT באמצעות אור הרקע לדכא פעילות מוט 17,37. הבדל זה יכול להיות מוסבר על ידי השפעה מאופיינת היטב של אור הרקע שלאט (תוך 10 דקות) משפרת אמפליטודות תגובת חרוט כנראה בשל הסרת הדיכוי בתיווך המוט של תגובות קונוס 37-39.

לסיכום, השיטה הוכיחה כאן עושה הקלטות אלקטרו vivo לשעבר ניתן ללמוד את הפונקציה של הרשתית. בעתיד, אנו מקווים שעוד רבות מעבדות תהיה להתאים שיטה זו עוצמה ללמוד הפיסיולוגיה ופתולוגיה של רשתית בעלי חיים ובני אדם ולקדם את ההבנה של תפקוד רשתית שלנו ולפתח טיפולים טובים יותר למחלות מסנוורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס הסכם רישיון עם Xenotec, Inc. ועשויה לקבל תמלוגים ממכירת מתאם vivo לשעבר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY019312 מענקים וEY021126 (VJK), EY002687 למחלקת העיניים ומדעים חזותיים באוניברסיטת וושינגטון, ועל ידי מחקר למניעת עיוורון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Tags

Neuroscience גיליון 99 אלקטרופיזיולוגיה electroretinogram ERG, רשתית קולטי האור מוט קונוס גל ב-גל בדיקות סמים
בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinberg, F., Kefalov, V.… More

Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter