Summary

متزامنة<em> فيفو السابقين</em> اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em> في الجسم الحي</em> نظام مخطط كهربية

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

مخطط كهربية (أرج) هي تقنية راسخة والتي يمكن استخدامها لتسجيل النشاط الكهربائي للشبكية العين الناجم عن الضوء. يتم إنشاء إشارة أرج أساسا من تغيرات الجهد الناجم عن التيارات شعاعي (على طول محور مبصرات وخلايا ثنائية القطب) المتدفقة في الفضاء خارج الخلية مقاوم للشبكية. وسجلت أول إشارة أرج في عام 1865 من قبل هولمغرين من سطح العين الأسماك 1. آينتهوفن وجولي 1908 2 تقسيم استجابة ERG إلى ظهور الضوء إلى ثلاث موجات مختلفة، ودعا أ، ب، ج-الأمواج، والتي هي معروفة الآن لتعكس أساسا على نشاط خلايا مستقبلة للضوء، ON خلايا ثنائية القطب، والظهارة الصبغية الخلايا على التوالي 3-8. أرج يمكن تسجيلها من عيون الحيوانات تخدير أو البشر (في الجسم الحي)، من إعداد معزولة العين عبر شبكية العين سليمة المعزولة (خارج الجسم الحي) 3،10-15 أو عبر طبقات الشبكية محددة مع الميكروية (المحليةأرج) 4،16. هذه، في الجسم الحي أرج حاليا الوسيلة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم وظيفة الشبكية. وهو أسلوب موسع التي يمكن استخدامها لأغراض التشخيص أو لمتابعة تطور أمراض شبكية العين في الحيوانات أو المرضى. ومع ذلك، في الجسم الحي تسجيلات أرج تنتج إشارة معقدة مع العديد من المكونات متداخلة، غالبا ما تكون ملوثة بسبب الضوضاء خارج العين الفسيولوجية (على سبيل المثال، في التنفس ونشاط القلب).

أرج المحلية يمكن استخدامها لتسجيل إشارة عبر طبقات محددة من شبكية العين ولكنه هو الأكثر الغازية ويحتوي على نسبة أدنى إشارة إلى الضوضاء (SNR) بالمقارنة مع تكوينات أخرى تسجيل أرج. أرج المحلي هو أيضا يتطلب تقنية عالية وتتطلب معدات مكلفة (على سبيل المثال، المجهر وmicromanipulators). Transretinal أرج من سليمة، وشبكية العين معزولة (خارج الحي أرج) تقدم حلا وسطا بين في الجسم الحي وطرق أرج المحلية السماح مستقرة والمهزومةالتسجيلات ح SNR من شبكية العين سليمة من الحيوانات أو البشر 17. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لدراسة قضيب والمخروط مبصرة وظيفة في الثدييات، الرئيسيات والإنسان شبكية العين 18-20. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم وجود الظهارة الصبغية في شبكية العين خارج الحي، تتم إزالة عنصر ج الموجة الإيجابية للإشارة أرج وكشف سلبي بطيئة مكون PIII بارز في خارج الحي التسجيلات. وقد تبين المكون PIII بطيء أن تنشأ من نشاط الخلايا الدبقية مولر في شبكية العين 21-23. وبالتالي، يمكن أن تستخدم أيضا خارج الحي طريقة أرج لدراسة الخلايا مولر في الشبكية سليمة. وقد أظهرت العديد من الدراسات يمكن أن تستخدم أيضا أن خارج الجسم الحي تسجيلات أرج لقياس تركيز كلاء الدوائية في جميع أنحاء شبكية العين 24 واختبار سلامة وفعالية الأدوية 25-27.

هم تجارية متعددة في أنظمة الجسم الحي المتاحة وتستخدم في العديد من المختبرات التي ليس لها بالضرورة خلفية الكهربية واسعة النطاق. في المقابل، والأجهزة فيفو السابقين لم تكن متاحة حتى وقت قريب 17 ونتيجة لذلك إلا عدد قليل جدا من المختبرات تجري حاليا الاستفادة من هذه التقنية قوية. وسيكون من المفيد لجعل التسجيلات خارج الحي أرج متاحة لمزيد من المختبرات من أجل المضي قدما معرفتنا علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض شبكية العين، وإلى تطوير علاجات جديدة للأمراض المسببة للعمى. علينا أن نظهر هنا جهاز بسيط وبأسعار معقولة خارج الحي أرج 17 وإظهار كيف يمكن أن تستخدم في تركيبة مع عدة متاحة تجاريا في أنظمة الجسم الحي أرج لتسجيل إشارات rod- وبوساطة مخروط (أ ب موجات) وظيفة خلايا مولر (بطيء PIII) من سليمة من النوع البري شبكية العين الماوس.

Protocol

وكانت جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة الدراسات الحيوانية المؤسسية في جامعة واشنطن. 1. إعداد الإرواء وعينة حامل <li style=";text-align:right;direction:…

Representative Results

سجلنا الردود فلاش من الظلام تكييفها البرية من نوع (WT) C57BL / 6 شبكية العين الماوس عن طريق اتباع البروتوكولات التجريبية المذكورة أعلاه وموضح في الشكل 1 باستخدام مختلف الحلول نضح القياسية (الشكل 2). ويبدو أن الطول الموجي استجابة وحركية وكذلك حساسية المست?…

Discussion

علينا أن نظهر هنا الخطوات الحاسمة للحصول على جودة عالية السابقين التسجيلات الحية أرج في وقت واحد من اثنين من شبكية العين الماوس المعزولة باستخدام المكونات في الجسم الحي نظام أرج جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين أرج محول. في هذه الدراسة نحن perfused لك…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY019312 وEY021126 (VJK)، EY002687 إلى قسم العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن، والبحوث للوقاية من العمى.

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

References

  1. Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Play Video

Cite This Article
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

View Video