Introduction
Elektroretinogrammet (ERG) er en veletablert teknikk som kan brukes til å registrere den elektriske aktiviteten i retina utløst av lys. ERG signal genereres i hovedsak av spenningsendringer forårsaket av radiale strømmer (langs aksen av fotoreseptorene og bipolare celler) som strømmer i den resistive ekstracellulære rom av netthinnen. Den første ERG signal ble registrert i 1865 av Holmgren fra overflaten av en fisk øye 1. Einthoven og Jolly 1908 2 delt ERG respons på angrep av lys i tre forskjellige bølger, kalt A-, B- og C-bølgene, som nå er kjent for å reflektere hovedsakelig aktiviteten av fotoreseptorer, ON bipolare celler, og pigment epitelet -celler, henholdsvis 3-8. ERG kan tas opp fra øynene til bedøvede dyr eller mennesker (in vivo), fra isolerte øye forberedelse 9, over isolert intakt retina (ex vivo) 3,10-15 eller i bestemte netthinnen lag med mikroelektroder (lokalERG) 4,16. Av disse er in vivo ERG i dag den mest brukte metoden for å vurdere retinal funksjon. Det er en ikke-invasiv teknikk som kan brukes for diagnostiske formål eller for å følge progresjonen av retinale sykdommer i dyr eller pasienter. Men in vivo ERG opptak produsere et komplisert signal med flere overlappende komponenter, ofte forurenset av extraocular fysiologiske støy (f.eks, pust og hjerteaktivitet).
Lokal ERG kan brukes til å registrere signalet i bestemte lag av netthinnen, men det er mest invasiv og har den laveste signal-til-støy-forhold (SNR) i forhold til de andre ERG opptaks konfigurasjoner. Lokal ERG er også teknisk krevende og krever kostbart utstyr (f.eks mikroskop og micromanipulators). Transretinal ERG fra intakt, isolert retina (ex vivo ERG) tilbyr et kompromiss mellom in vivo og lokale ERG metoder slik at stabil og HiGh SNR opptak fra intakte netthinne av dyr eller mennesker 17. Nylig har denne metoden vært brukt med hell for å studere stang og kjegle fotoreseptor funksjon i pattedyr, primater og mennesker netthinne 18-20. I tillegg, på grunn av fravær av pigment epitelet i ex vivo hinnen, blir den positive C-bølgekomponent av ERG signal fjernet og en fremstående negativ langsom PIII komponent er åpenbart i den ex vivo-opptak. Den langsomme PIII komponenten har vist seg å stamme fra aktiviteten av Muller gliaceller i retina 21-23. Dermed kan ex vivo ERG metoden også brukes til å studere Muller celler i intakt hinnen. Flere studier har også vist at ex vivo ERG opptakene kunne brukes til å måle konsentrasjonen av farmakologiske midler rundt retina 24 og teste sikkerhet og effekt av legemidler 25-27.
Multiple kommersiell in vivo systemer er tilgjengelig ogbrukes i mange laboratorier som ikke nødvendigvis har omfattende elektrobakgrunn. I kontrast, har ex vivo-enheter ikke vært tilgjengelig inntil nylig 17 og som et resultat bare svært få laboratorier drar nytte av dette kraftige teknikken. Det ville være gunstig å foreta ex vivo ERG opptak tilgjengelig for flere laboratorier for å fremme vår kunnskap om retinal fysiologi og patologi, og for å utvikle nye behandlingsformer for blendende sykdommer. Vi viser her en enkel og rimelig ex vivo ERG-enheten 17, og viser hvordan det kan brukes i kombinasjon med flere kommersielt tilgjengelige in vivo ERG-systemer for å registrere og stempelstang kjegle-mediert signalisering (A- og B-bølger), og funksjonen av Müller celler (bremse PIII) fra intakte villtype mus netthinne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøksprotokoller var i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av den institusjonelle Animal Studies Utvalget ved Washington University.
1. Sette opp Perfusjons og Specimen Holder
- Forbered løsning for netthinnen perfusjon frisk på dagen for forsøket. Bruke destillert og deionisert vann. Bruk én av følgende tre løsninger.
- Forbered Bikarbonat holdig Ames 'løsning (1 L): 1 flaske Ames' media og 1,9 g NaHCO3,
- Forbered Lockes oppløsning (i mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO3, 3,0 Na-succinat, 0,5 Na-glutamat, 0,02 EDTA, og 10,0 glukose, 0,1% MEM vitaminer og amino- syrer
- Forbered HEPES-bufret Ringer-løsning (i mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl2, 10,0 glukose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHjustert til 7,5 med ~ 5,8 ml 1 M NaOH, tilsett 0,72 g / liter kulturmedium Leibovitz L-15. Bruk 20 - 50 mikrometer DL-AP4 og 50-100 mikrometer bacl 2 for å isolere fotoreseptoren respons med noen perfusjon media.
- Klargjør for løsning elektroder 28 (i mm): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 3 HEPES, 0,01 EDTA og justere pH til 7,4 til 7,5 med NaOH. Elektrode løsning kan lagres ved romtemperatur i flere måneder.
- Utarbeide og teste prøveholderen.
- Lim svart / grå filterpapiret på toppen av kupler av prøveholder sin nedre del (se figur 1A). Spredt to-komponent 5 min epoxylim nøye rundt kantene av de flate topper av kupler. Hvis det er nødvendig, gjør det under disseksjon mikroskop.
- Vent til limet er nesten tørt (ca. 4 minutter) og trykk på filterpapir på domer ved hjelp av en flat gjenstand. Lim filterpapir minst en dag før eksperimentet. Denfilter papir kan brukes flere ganger, men bør skiftes etter en måned med innspillinger. Bruk 70% etanol for å rengjøre kupler nøye fra limrester før du installerer ny papir.
- Fyll elektrode kanaler med elektroden løsning prøver å unngå luftbobler og skru pellets elektroder som følger med en gjenget adapter i elektrodekanalene (se figur 1A og B). Koble den øvre og nedre deler av prøveholderen med fire skruer og fylle perfusjon linjer med elektroden løsning.
- Mål motstanden og spenningen mellom ledningene til hvert elektrodeparet bruker et multimeter (figur 1B). Motstand bør være under 100 Ωk og spenningen under 10 mV dersom kanalene er boble-fri, og elektrodene er i god stand.
- Hell 400-700 ml perfusjon medier i glassflaske. Separat en annen 300 ml for å bli brukt i disseksjon av netthinnen og srev den i kjøleskap. Sett Perfusjonsslangen i varmeveksleren blokken og plasser forvarmet blokk på varmeplaten (se figur 1D).
- Omslutte flasken med et lokk som har forbindelser til CO 2 / O 2 gass (hvis Ames 'eller Lockes brukes) og for perfusjon rør (se figur 1D). Forvarm flaske med media til 37 o C og plasser den på varmeplaten eller på toppen av lyset stimulering enhet i vannbad satt til 37-39 o C 17.
- Prime perfusjon linjene ved å fylle dem med perfusjon media for å sette i gang alvoret-drevet flow.
- I LKC system, plasserer flasken på toppen av stimulator enheten 17 for å gi en betydelig gravitasjonsstrømning som deretter justeres ved flow regulatorer uten å påvirkes av den senke nivået av perfusjon oppløsningen i flasken i løpet av eksperimentet.
- I Ocuscience system, plasser perfusion flaske inne i Faraday-bur for å redusere støy og å plassere lange perfusjon utgangslinjer fra prøveholderen (se trinn 2.8) godt under nivået til prøveholderen (og perfusjon flaske) for å bedre gravitasjons kjøring av løsningen. Skjerme disse utgangsledninger og koble skjermingen til forsterkerens bakken for å hindre kobling av elektromagnetisk støy til ERG signal.
- Prime perfusjon linjene ved å fylle dem med perfusjon media for å sette i gang alvoret-drevet flow.
- Juster perfusjon til 3-5 ml / min ved hjelp av flow regulatorer. Koble 5% CO 2/95% O 2 gass fra en sylinder med riktig regulator og justere flow rate for å sikre jevn boblende av media i flasken gjennom en luft stein.
2. Prøvepreparering
- Montere rene og skarpe disseksjon instrumenter inkludert straight-Bladed microscissors, en eller to 45 o pinsett, barberblad og et rektangulært stykke filterpapir.
- Hell ca 200 ml kaldt perfusion oppløsning i en stor petriskål slik at hele bunndelen av prøveholderen (inkludert domer) kan dyppes i oppløsningen. Dette trinnet blir viktig ved montering netthinne på kupler (se trinn 2.6). Selv om noen løsninger er utviklet for å bli mettet med karbogen (5% CO2 / 95% O 2), er dette ikke avgjørende for disseksjon formål og er ikke gjort i eksperimentene som beskrives her.
- For et typisk eksperiment, holde dyr i 12/12 timer mørk / lys syklus og mørke tilpasse dem for 6-12 timer før den planlagte opptakene. Avlive dyret ved CO 2 innånding fulgt ved halshugging er svakt rødt lys og gjøre alle disse prosedyrene er svakt rødt eller IR-lys (bruk f.eks rødt filter foran mikroskopet lyskilde).
- Trekk øynene ut ved hjelp av pinsett og legg dem i media. Plasser ett øye av gangen på et lite stykke papir (f.eks noen vanlig filterpapir) og gjøre somtent omtrent på nivå med ora serrata mens du holder øye med pinsett (dette gjøres utenfor løsningen her).
- Skjær langs ora serrata (eller nærmere ekvator i øyet) med microscissors og fjerne hornhinnen og linsen. Plasser øyet cup i kulden media i stor petriskål og gjenta den samme prosedyren med det andre øyet.
- Skjær et lite snitt fra toppen av øyet cup mot synsnerven ved å holde saksen mellom netthinnen og sclera for å holde netthinnen så intakt som mulig. Grip sclera fra begge sider av snittet ved hjelp av to pinsett og trekk pinsett bort fra hverandre for å løsne netthinnen.
- Skjær synsnerven og prøver å isolere retina med et minimum av fysisk kontakt til den distale overflaten. RPE vil for det meste løsner automatisk fra netthinnen under disseksjon prosessen. Det er viktigere å unngå mekanisk forstyrrelse av netthinnen enn å utføredisseksjon raskt, vanligvis netthinner kan inkuberes i minst 30 minutter i løsning uten signifikant effekt på responsegenskaper.
- Monter netthinne på kupler av prøveholderen (figur 1C). Dyppe den nederste delen av prøven holderen i petriskål med dissekert netthinne. Skyv retina, fotoreseptoren side (den konvekse overflaten av den isolerte retina) oppover, over kuppelen og løfte prøveholderen slik at netthinnen festes på filterpapiret. Gjenta prosedyren for den andre netthinnen.
- Tørk innehaveren plate nøye for å forhindre elektrisk crosstalk mellom netthinne samt støy og signal skifting. Prøveholderen har O-ringer rundt den nederste delen kupler for å hindre løsning søl mellom bunn- og toppdeler av holderen, samt å bidra til elektrisk isolering av fotoreseptoren og ganglion celle sider av de enkelte netthinner. Fest den øverste delen av holderen med de fire skruene (se figur 1B) og fylle perfusjon kanaler med perfusjon løsning ved hjelp av en sprøyte og en kanyle.
- Overfør prøveholderen ved siden av varmeveksleren og koble inngangs- og utgangs perfusjon linjer til prøveholderen (figur 1D). Koble elektrodene til ERG forsterkeren (topp elektroder koble til bakken / minus pin i forsterkeren) og fest stimulator / styreenheten på prøveholderen ved hjelp av en adapter eller skyv varmeputen inn i stimulator enhet avhengig av hvilken in vivo ERG system brukes.
3. Recordings
- Konfigurer forsterker og stimulanse innstillinger ved hjelp av in vivo systemets programvare. Still oppkjøpet frekvensen til en verdi mellom 1 og 10 kHz og low-pass filtrering til 300 Hz. Ikke bruk høypassfiltrering. Bruk 60 Hz (eller 50 Hz i Europa) hakk filter om nødvendig.
- Post baseline uten lys stimulering og viddh dim stimulering (f.eks., grønt lys fra -35 dB eller 0,3 cm -2 MCD) for å teste for god elektrisk forbindelse mellom elektrodene og retina prøven. Vent i 10 - 20 min før du starter datainnsamlingen slik at retinal temperatur og funksjon nå en stabil tilstand.
- Velg stimulanse parametere i henhold til noen bestemt eksperiment og starte datainnsamling. Eg, bruke grønt lys fra -40 opp til 0 dB eller fra 0,1 opptil 1000 MCD sm -2 for en scotopic respons familie. Bruk ca 2 til 3 log-enheter lysere blinker i photopic innspillinger hvor stenger må undertrykt av bakgrunnslys (3-30 CDM -2) eller en sonde flash (ca 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, se figur 3).
- Men husk at de eksakte lysintensitet verdier kan være noe avhengig av systemkalibrering og eksperimentelle forhold. Som en tommelfingerregel, skala intensiteter nede ved 5-10 ganger i forhold til in vivo 17. En svart deksel med åpninger ovenfor netthinne (inkludert i kommersielt adaptersystem) kan brukes til å redusere lysspredning i prøveholderen og lette ensartet og lik stimulering av både netthinner ved ganzfeld sfære av den kommersielle in vivo systemer.
NB: For opptak fra mørketilpasset retina, intensiteter av test blinker som brukes i et typisk forsøk blekemiddel bare en ubetydelig brøkdel av pigment, slik at mangelen på RPE-drevet regenerering er ikke et problem. I tillegg har det tidligere blitt vist at konusen pigment regenerering kan fremdeles finne sted i den isolerte retina via Müller cellesyklus visuelle 20.
- Som forsøk varer vanligvis fra 30 minutter opp til flere timer, overvåker basislinjedrift, støynivå og respons stabilitet under forsøket som endringer i disse kan tyde på tekniske problemer.
MERK: Økt støy eller reduksjond respons amplituder kan tyde på luftbobler i perfusjon eller elektrode kanaler, for lav eller høy temperatur, løsning lekkasje / søl eller forskyvning av netthinnen.
4. Rengjøring
- Løsne prøveholder fra perfusjon linjer, åpne den og skylle netthinne fra filterpapiret. Fjern elektrodene og skyll dem med destillert vann (ikke bruk etanol). Rens prøveholder (inkludert perfusjon kanaler) med etanol og / eller destillert vann. Flush Perfusjonsslangen nøye med> 70% etanol.
- Skyll perfusjon flaske med destillert vann (ikke bruk vaskemidler). Etanol kan også brukes til å rense flasken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har registrert flash svar fra mørkeadapterte villtype (WT) C57BL / 6 mus netthinne ved å følge de eksperimentelle protokoller som er beskrevet ovenfor og illustrert i figur 1 ved bruk av forskjellige standard perfusjon oppløsninger (figur 2). Svar kurver og kinetikk samt følsomheten stang fotoreseptorene dukket opp like i Ames 'og Lockes medier (Figur 2A og B). På den annen side, i henhold til HEPES-bufret Ringers oppløsning (uten bikarbonat eller 5% CO2 / 95% O 2) respons amplitudene var betydelig mindre. Vi fant også at i disse forholdene stabilitet b-bølgen ble kompromittert. Legge til 40 mikrometer APB (DL-AP4) fjernet positiv b-bølge effektivt i alle tre medier (Tall 2D-F). Fjerning av b-bølgen avdekket en stor treg negativ bølge (figur 2D) som har blitt tilskrevet Müller celleaktivitet 21. Tilsette 100 &# 956; M av barium avskaffet denne komponenten, avslører fotoreseptor respons av ex vivo ERG signal (Tall 2D-F). Vi kunne ta opp til 1 mV mettede fotoreseptorlidelser responser i Ames 'og Lockes mens maksimums svarene var typisk rundt 200 uV henhold Ringer perfusjon.
Cone fotoreseptorlidelser svar har blitt isolert tidligere av såkalt dobbel blits teknikk der en lys probe flash mette stengene er etterfulgt av en test flash i en tid da kjegler har restaurert sin mørke-tilpasset tilstand, men stenger forbli mettet 19,29. Her har vi isolert kjegle-mediert ERG svar (inneholder både a- og b-bølge) i Ames 'media supplert med 100 mikrometer av barium, men ikke DL-AP4 ved hjelp dobbel blits teknikk (figur 3). Barium ble brukt for å fjerne den langsomme glial komponent som så ut til å gjøre siste del av svarene mer variable spesielt ved gjentatt bruk av brighT blinker. Vi brukte en konstant sonde flash å mette stenger og variable test blinker 300 msek etter sonden blits for å lokke fram kjegle svar. En konus respons familie oppnådd ved å subtrahere probe flash respons fra 'sonde + test flash-responser er vist i figur 3B.
Figur 1. Anvendelse av ex vivo ERG prøveholderen. (A) Fylling av elektrode kanaler og montering av elektrodene. (B) Testing av den sammenstilte prøveholderen før disseksjonen ved å måle motstanden og spenningen mellom elektrodeparene. (C) Montering av netthinnen på filterpapiret i prøveholderen. (D) prøveholderen forbundet til perfusjon linjer og ERG forsterker i kommersielle ERG systammen. Perfusjon strømningsbanen er angitt med blå piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Flash respons familier er tatt opp fra mørke tilpassede WT mus netthinne perfuserte med Lockes (A), Ames '(B), og HEPES-bufret Ringer (C) medium. De blinker levert 3, 40, 130, 390 og 1400 fotoner mikrometer -2 (-36 til -9 dB eller -3,6 til -0,9 log (Cd sm -2) grønt lys (530 nm)). Svarte spor i (DF) viser svarene er tatt opp fra netthinne i (AC) etter tilsetning av 40 mikrometer APB og 100 mikrometer barium. Røde spor i (d) Vis svar spilt inn fra netthinnen i (A) perfusert med Lockes supplert med 40 mikrometer APB men ikke barium. Det innfelte viser svarene på de tre dimmest blinker i Lockes medier som inneholder APB og barium. Blinker varierte fra 7 til 14 000 um fotoner -2 (-32 til 1 dB grønt lys) i (D) fra 3 til 1400 um fotoner -2 (-36 til -9 dB grønt lys) i (E), og fra 7 til 1400 um fotoner -2 (-32 til -9 dB grønt lys) i (F). Se Vinberg et al. 2014 17 og Lyubarsky et al. 1999 30 og 2004 31 for detaljer om konvertering photopic lysende energi gitt i Cd sm -2 til fotoner mikrometer -2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
belastning / 52855 / 52855fig3.jpg "/>
Figur 3. Isolering av kjegle svar med dobbel flashmetoden i WT mus. (A) en reaksjon for å probe flash (14000 fotoner um -2 eller 1 dB grønt lys, sort) og et svar å sondere flash etterfulgt av en test flash (81000 fotoner mikrometer -2 eller 9 dB grønt lys, rød). (B) Cone flash svar å teste blinker som spenner fra 360 til 81000 fotoner mikrometer -2 (-14 til 10 dB grønt lys) isolert ved å trekke sonden flash respons fra " sonde + test flash "respons. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser her de viktige skritt for å oppnå høy kvalitet ex vivo ERG opptak samtidig fra to isolerte mus netthinne ved hjelp in vivo ERG systemkomponenter sammen med en ex vivo ERG adapter. I denne studien perfusert vi både netthinner fra dyret med den samme oppløsning (enten Ames ', Lockes eller Ringers), men det er også mulig å perfuse hver netthinnen med en annen løsning for eksempel for medikamenttestformål. De viktigste trinnene for å få data av høy kvalitet er skjerming mot elektromagnetisk støy, forsiktig disseksjon av netthinnen, jevn og relativt rask perfusjon flyt ved hjelp av en avansert spesialbygd prøveholder, og utfører alle prosedyrer for prøveopparbeidelse er svakt rødt (eller IR) lys. Metoden er beskrevet her tillater umiddelbar bruk av både netthinner og doble bruken av en in vivo ERG oppsett for å utføre in vivo og ex vivo ERG opptak.
_content "> Den spesialbygde ex vivo ERG prøveholder nylig utviklet av oss 17, og nå er kommersielt tilgjengelige, øker SNR ved effektiv elektrisk isolering av den proksimale og distale deler av netthinnen og optimaliserer perfusjon strømning over retina (høy oppløsning kursen .) Fravær av de langsomme frekvensstøykomponentene i ex vivo ERG signal tillater kvantitativ analyse selv fra svært små reaksjoner Men vi fant ut at ex vivo-opptak er mer utsatt for forstyrrelser fra AC-strømlinjestøy (60 Hz i USA;. 50 Hz i Europa) enn in vivo-forsøk. Denne støyen er koplet til signalet hovedsakelig gjennom perfusjon linje, og det kan stort sett fjernes ved skjerming (og jordings) perfusjon alle komponentene (flaske, tubing) bosatt utsiden av Faraday-bur eller ganzfeld sfære . I tillegg, av og til 60 Hz støy koblet til ex vivo ERG signal gjennom varmeveksleren, og denne støyen kan også fjernes ved jording. </ P>Vi viser hvordan du fjerner spesifikke ERG signalkomponenter ved å legge farmakologiske blokkere i perfusjonslinjen under forsøket slik disseksjon av funksjon av ulike celletyper i samme retina / eksperiment med tre forskjellige fysiologiske perfusjon media (figur 2). En fersk studie viste at valg av perfusjon media påvirker fotoreseptor fysiologi i encellete opptak 32. Her brukte vi Ames ', Lockes og' HEPES-Ringer "media til å ta opp mørke-tilpasset flash responser i fravær og nærvær av farmakologiske reagenser ment å isolere fotoreseptor komponent av ERG signal (figur 2). Bikarbonat-bufret løsninger ga større A- og B-bølgeamplitudene, opp til 1 mV. Fotoreseptorlidelser dim flash svar henhold Locke medium med blokkere inneholdt komplisert utvinning bølgeform (se innfelt i figur 2D) som ikke ble sett med AmesR17; eller Ringer perfusjon. Når bruk av ex vivo ERG blir tilpasset av flere laboratorier ville det være nyttig å bruke de samme perfusjon medier og standard metoder for å isolere ulike signalkomponenter. På dette punktet ser det ut til at den mest allsidige alternativet er Ames 'medium fordi det gir stabile og store A- og B-bølgeamplitudene. I tillegg fotoreseptoren respons, isolerte farmakologisk i denne løsningen, synes å ha en enkel bølgeform som minner om det som registreres fra enkle fotoreseptorer (figur 2e). Likevel, noen åpne spørsmål gjenstår om eksistensen av andre ERG signalkomponenter observert under in vivo forhold. For eksempel, i våre ex vivo opptaksforhold vi ikke se fremtredende oscillasjon potensialer, 100-150 Hz oscillerende bølger som vanligvis observert i den stigende fasen av b-bølge av en in vivo ERG respons. Det er således mulig at den indre hinnen funksjon i vår ex vivo ex vivo b-bølger innblandet levedyktig PÅ bipolar celle funksjon. Fremtidige studier bør avgjøre om endringer i forsøksprotokoller vises her (disseksjon, perfusjon etc.) vil tillate oss å spille inn oscillasjon potensialer henhold ex vivo forhold.
Cone funksjon er avgjørende for vår visjon. Imidlertid undersøkelse av kjegler er hemmet av sin lille størrelse og knapphet spesielt i mus 33 netthinnen. Isolering av kjegle funksjon blir ytterligere komplisert i muse ERG opptak fordi deres M-kjegler og stenger har nesten identiske spektrale følsomhet 30. Standardprotokoller dra nytte av flere log-enhet forskjellen mellom stang og kjegle følsomhet ved hjelp av stang-undertrykke bakgrunnslys. Imidlertid er stødig bakgrunn lys kjent for å desensitize stenger 34,35 og påvirke kjegle funksjon eventuelt gjennom modulering av gap junctional kobling mellom stenger og kjegler <sup> 36,37. Dermed er det vanskelig å finne en bakgrunn lysintensitet som er sterke nok til å holde stavene mettede uten å påvirke kjegler. Her viser vi en alternativ dobbel blits metode som utnytter både lavere følsomhet og raskere restitusjon kinetikk av kjegler 19,29,30. På denne måten er det lettere å isolere helt mørke-tilpasset kjegle medierte responser. Vi la merke til at i Ames 'eller Lockes løsninger uten blokkering, ble detaljene i utvinningen bølgeformen noe påvirket i løpet av eksperimentet ved anvendelse av lyse probe og test blinker. Dette kompliseres subtraksjon analyse for å isolere de kjegle svar. Imidlertid fjerner glial komponent ved barium bidro til å stabilisere halen av svarene som indikerer at variasjonen skyldes til møllen cellekomponenten. På denne måten var det mulig å få mørke-tilpasset kjegle-drevet responser i WT mus (figur 3). Cone svar isolert av dobbel blitsteknikk fra WT mus dukket opp mindre i forhold til de som er registrert fra WT mus ved hjelp av bakgrunnslyset for å undertrykke stang aktivitet 17,37. Denne forskjellen kan forklares ved en godt karakterisert effekt bakgrunnslys som langsomt (innen 10 min) forbedrer membranens respons amplituder sannsynligvis på grunn av fjerning av stav-mediert suppresjon av koniske responser 37-39.
Oppsummert omfatter fremgangsmåten vist her muliggjør ex vivo elektrofysiologiske opptak for å studere funksjonen av netthinnen. I fremtiden håper vi at mange flere laboratorier vil tilpasse seg dette kraftig metode for å studere fysiologi og patologi av dyr og mennesker netthinnen og å fremme vår forståelse av netthinnefunksjon og utvikle bedre behandling for blendende sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Washington University in St. Louis har en lisensavtale med Xenotec, Inc. og kan motta en royalty fra salg av ex vivo adapter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd EY019312 og EY021126 (VJK), EY002687 til Institutt of Ophthalmology og Visual Sciences ved Washington University, og ved forsknings å hindre blindhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
