Introduction
Électrorétinogramme (ERG) est une technique bien établie qui peut être utilisé pour enregistrer l'activité électrique de la rétine provoquée par la lumière. Le signal est généré ERG principalement par les variations de tension provoquées par les courants radiaux (selon l'axe des photorécepteurs et les cellules bipolaires) circulant dans l'espace extracellulaire résistif de la rétine. Le premier signal ERG a été enregistrée en 1865 par Holmgren de la surface d'un œil de poisson 1. Einthoven et Jolly 1908 2 divisés la réponse ERG à l'apparition de la lumière en trois vagues différentes, appelé A, B, et C-ondes, qui sont maintenant connu pour refléter principalement l'activité des photorécepteurs, les cellules bipolaires ON, et l'épithélium pigmentaire cellules, respectivement 8.3. ERG peut être enregistrée dans les yeux des animaux anesthésiés ou humains (in vivo), de la préparation des yeux isolé 9, à travers la rétine isolée intacte (ex vivo) 3,10-15 ou à travers les couches de la rétine spécifiques avec des microélectrodes (localERG) 4,16. Parmi ceux-ci, in vivo ERG est actuellement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la fonction rétinienne. Il est une technique non invasive qui peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour suivre la progression de maladies de la rétine chez les animaux ou patients. Cependant, in vivo enregistrements ERG produisent un signal compliqué avec plusieurs composants qui se chevauchent, souvent contaminés par le bruit extraoculaire physiologique (par exemple, la respiration et l'activité cardiaque).
ERG local peut être utilisé pour enregistrer le signal à travers des couches spécifiques de la rétine, mais il est le plus invasive et présente le plus faible rapport signal-sur-bruit (SNR) par rapport aux autres configurations d'enregistrement ERG. ERG local est aussi techniquement exigeante et nécessite un équipement coûteux (par exemple, un microscope et micromanipulateurs). Transretinal ERG de la intacte, la rétine isolée (ex vivo ERG) offre un compromis entre les méthodes in vivo et ERG locales permettant stable et higenregistrements h SNR de rétines intactes d'animaux ou les humains 17. Récemment, cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la fonction des bâtonnets et des cônes photorécepteurs dans les rétines de mammifères, les primates et les droits de 18-20. En outre, en raison de l'absence de l'épithélium pigmentaire de la rétine ex vivo, la composante c-onde positive du signal ERG est retiré et un composant PIII lente négative importante est révélée dans les enregistrements ex vivo. La composante lente PIII a été démontré que provenir de l'activité des cellules gliales de Müller dans la rétine 21-23. Ainsi, ex vivo ERG procédé pourrait également être utilisé pour étudier les cellules de Müller dans la rétine intacte. Plusieurs études ont également montré que les ex vivo enregistrements ERG pourraient être utilisés pour mesurer la concentration d'agents pharmacologiques autour de la rétine 24 et de tester l'innocuité et l'efficacité des médicaments 25-27.
Multiple commercial dans des systèmes in vivo sont disponibles etutilisée dans de nombreux laboratoires qui ne disposent pas nécessairement vaste expérience en électrophysiologie. En revanche, ex vivo dispositifs ont pas été disponible jusqu'à récemment 17 et par conséquent que très peu de laboratoires sont en cours avantage de cette technique puissante. Il serait bénéfique de faire des enregistrements ex vivo ERG disponible pour plusieurs laboratoires afin de faire progresser nos connaissances sur la physiologie et la pathologie de la rétine, et de développer de nouvelles thérapies pour les maladies cécitantes. Nous démontrons ici un dispositif simple et abordable ex vivo ERG 17 et montrons comment il peut être utilisé en combinaison avec plusieurs systèmes vivo ERG disponibles dans le commerce pour enregistrer dans la signalisation de bâtonnet et le cône médiation (A et B-ondes) et la fonction de les cellules de Müller (ralentir PIII) de rétines de souris de type sauvage intacte.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux étaient en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel Animal Studies à l'Université de Washington.
1. Configuration de perfusion et porte-échantillon
- Préparer la solution pour perfusion rétine frais sur le jour de l'expérience. Utilisez de l'eau distillée et déminéralisée. Utilisez l'une des trois solutions suivantes.
- Préparez-contenant Bicarbonate de la solution (1 L): 1 bouteille de Ames Ames des médias et de 1,9 g de NaHCO 3,
- Préparer la solution de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinate, 0,5 Na glutamate, 0,02 EDTA, et 10,0 glucose, 0,1% de vitamines MEM et amino acides
- Préparer une solution de Ringer tamponnée par HEPES (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, MgCl 2 2,0, CaCl 2 1,0, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajusté à 7,5 avec de ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, ajouter 0,72 g / L du milieu de culture Leibovitz L-15. Utilisez 20-50 uM DL-AP4 et 50 - 100 uM BaCl 2 pour isoler la réponse du photorécepteur avec tout support de perfusion.
- Préparer la solution pour les électrodes 28 (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl 2 2,4, CaCl 2 1,2, 3, HEPES 0,01 EDTA et ajuster le pH à 7/4 à 7/5 avec du NaOH. Electrode de solution peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs mois.
- Préparer et tester le porte-échantillon.
- Collez papier filtre noir / gris sur le dessus des dômes de la partie inférieure du porte-échantillon (voir la figure 1A). Étaler à deux composants 5 min de la colle époxy soigneusement autour des bords des sommets plats des dômes. Si nécessaire, le faire en vertu de la dissection microscope.
- Attendez jusqu'à ce que la colle est presque à sec (environ 4 min) et appuyez sur le papier filtre sur les dômes en utilisant un objet plat. Colle de papier filtre, au moins un jour avant l'expérience. Lepapier filtre peut être utilisé plusieurs fois, mais doit être remplacé après un mois d'enregistrements. Utilisez 70% d'éthanol pour nettoyer soigneusement dômes de tout résidu de colle avant d'installer le papier de remplacement.
- Remplissez les canaux d'électrode avec une solution d'électrode en essayant d'éviter les bulles d'air et vissez électrodes de pellets clos avec un adaptateur fileté dans les canaux d'électrodes (voir les figures 1A et B). Connecter les pièces supérieure et inférieure du porte-échantillon avec quatre vis et remplir les lignes de perfusion avec une solution de l'électrode.
- Mesure de la résistance et de la tension entre les conducteurs de chaque paire d'électrodes à l'aide d'un multimètre (figure 1B). La résistance doit être inférieure à 100 #k et la tension en dessous de 10 mV si les canaux sont sans bulles et les électrodes sont dans de bonnes conditions.
- Verser 400 à 700 ml de milieu de perfusion dans la bouteille en verre. Encore 300 ml séparée à utiliser dans la dissection des rétines et sdéchira dans un réfrigérateur. Réglez la tubulure de perfusion dans le bloc de l'échangeur de chaleur et placez le bloc préchauffé sur la plaque de chauffage (voir figure 1D).
- Joindre la bouteille avec un bouchon qui a des connexions de CO 2 / O 2 gazeux (si Ames »ou Locke est utilisé) et pour tubulure de perfusion (voir figure 1D). Préchauffer la bouteille avec les médias à 37 o C et le placer sur la plaque chauffante ou sur le dessus de l'unité de stimulation lumineuse dans un bain d'eau réglé à 37-39 o C 17.
- Premier Les lignes de perfusion par remplissage des médias de perfusion pour initier l'écoulement par gravité.
- Dans le système LKC, placer la bouteille sur le dessus de l'unité de stimulateur 17 pour fournir un écoulement gravitationnel significatif qui est ensuite ajustée par les régulateurs de débit sans être affectée par le niveau d'abaissement de la solution de perfusion dans le flacon pendant l'expérience.
- Dans le système Ocuscience, placez le pbouteille de erfusion l'intérieur de la cage de Faraday afin de minimiser le bruit et les placer à long perfusion lignes de sortie de la porte-échantillon (voir l'étape 2.8) bien en dessous du niveau du support de spécimen (et une bouteille de perfusion) pour augmenter entraînement gravitationnelle de la solution. Protégez ces lignes de sortie et connecter le blindage à la terre de l'amplificateur pour éviter le couplage du bruit électromagnétique au signal ERG.
- Premier Les lignes de perfusion par remplissage des médias de perfusion pour initier l'écoulement par gravité.
- Ajustez la perfusion de 3 - 5 ml / min en utilisant les régulateurs de débit. Connectez 5% de CO 2/95% O 2 du gaz d'un cylindre avec régulateur approprié et ajuster le débit pour assurer bouillonnement constant des médias dans la bouteille par une pierre à air.
Préparation de l'échantillon 2.
- Assemblez instruments de dissection propres et nettes, y compris microciseaux lame droite, un ou deux 45 o pince à épiler, une lame de rasoir et une pièce rectangulaire de papier filtre.
- Pour environ 200 ml de froid perfusion de solution dans une grande boîte de Petri de sorte que toute la partie inférieure du porte-échantillon (y compris les dômes) peut être immergé dans la solution. Cette étape devient important lors du montage des rétines sur les dômes (voir l'étape 2.6). Bien que certaines solutions sont conçues pour être saturée avec du carbogène (5% de CO2 / 95% d'O 2), ce ne soit pas essentiel aux fins de dissection et n'a pas été fait dans les expériences décrites ici.
- Pour une expérience typique, garder les animaux dans les 12/12 heures cycle d'obscurité / lumière et l'obscurité, de les adapter pour les 6 - 12 heures avant les enregistrements. Euthanasier l'animal par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale sous faible lumière rouge et de faire toutes les procédures suivantes sous la lumière rouge ou IR dim (utiliser par exemple, filtre rouge en face de la source de lumière du microscope).
- Tirez les yeux en utilisant une pince à épiler et les mettre dans les médias. Placez un œil à la fois sur un petit morceau de papier (par exemple, du papier régulier du filtre) et de faire enallumé environ sur le niveau de ora serrata tout en maintenant l'œil avec des pincettes (cela se fait en dehors de la solution ici).
- Coupez le long de l'ora serrata (ou plus près de l'équateur de l'œil) avec microciseaux et retirez la cornée et le cristallin. Placez la tasse d'oeil dans les médias froid dans la grande boîte de Pétri et répétez la même procédure avec l'autre œil.
- Couper une petite incision du haut de l'œilleton vers le nerf optique en gardant les ciseaux entre la rétine et la sclérotique afin de garder la rétine aussi intact que possible. Tenue de la sclère des deux côtés de l'incision à l'aide de deux pinces à épiler et tirer la pince à une distance l'une de l'autre pour détacher la rétine.
- Couper le nerf optique et essayer d'isoler la rétine avec un montant minimum de contact physique à la surface distale. RPE sera principalement détacher automatiquement à partir de la rétine au cours du processus de dissection. Il est plus important d'éviter la perturbation mécanique de la rétine que pour effectuer ladissection rapidement, généralement rétines peut être incubée au moins 30 min dans la solution sans effets significatifs sur les propriétés de réponse.
- Monter les rétines sur les dômes de support de l'échantillon (figure 1C). Immerger la partie inférieure du porte-échantillon dans la boîte de Pétri avec les rétines disséqués. Faites glisser la rétine, côté photorécepteur (la surface convexe de la rétine isolée) vers le haut, au-dessus du dôme et soulever le porte-échantillon de telle sorte que la rétine se fixe sur le papier filtre. Répétez la procédure pour l'autre rétine.
- Séchez soigneusement la plaque de support pour empêcher la diaphonie électrique entre les rétines ainsi que le bruit et le signal manœuvre. Porte-échantillons a joints toriques autour des dômes de partie inférieure pour empêcher solution déversement entre la parties inférieure et supérieure du titulaire ainsi que pour aider à l'isolation électrique des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires de la rétine côtés individuels. Fixez la partie supérieure de la porte avec les quatre vis (voir la figure 1B) et remplir les canaux de perfusion avec une solution de perfusion en utilisant une seringue et une aiguille.
- Transférer le porte-échantillon à côté du bloc de l'échangeur de chaleur et de connecter les entrée et sortie perfusion lignes au support de spécimen (figure 1D). Raccorder les électrodes à l'amplificateur ERG (électrodes supérieures relient à la terre / moins broche dans l'amplificateur) et fixer l'unité stimulateur / contrôle sur le porte-échantillon en utilisant un adaptateur ou faites glisser le coussin chauffant dans l'unité de stimulateur selon le in vivo ERG système est utilisé.
3. Enregistrements
- Configurer les paramètres de l'amplificateur et de relance en utilisant le logiciel du système in vivo. Réglez la fréquence d'acquisition d'une valeur comprise entre 1 et 10 kHz et filtrage passe-bas à 300 Hz. Ne pas utiliser le filtrage passe-haut. Utilisez 60 Hz (ou 50 Hz en Europe) Notch Filter si nécessaire.
- Fiche de référence sans la stimulation lumineuse et d'esprith stimulation dim (ex., le feu vert de -35 dB ou 0,3 mCd sm -2) pour tester bonne connexion électrique entre les électrodes et l'échantillon rétine. Attendez de 10 - 20 min avant de commencer la collecte de données de telle sorte que la température et la fonction rétinienne atteignent un état stable.
- Choisissez les paramètres de stimulation selon l'une expérience spécifique et commencer la collecte des données. Par exemple, utiliser le feu vert de -40 à 0 dB ou de 0,1 à 1,000 mCd sm -2 pour une famille de réponse scotopique. Utilisez environ 2 à 3 log-unités lumineux clignote en enregistrements photopiques où tiges doivent être réprimées par la lumière de fond (3-30 Cdm -2) ou un flash de la sonde (environ 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, voir Figure 3).
- Cependant, rappelez-vous que les valeurs d'intensité lumineuse exactes pourraient être quelque peu dépendant de votre étalonnage du système et les conditions expérimentales. En règle générale, les intensités d'échelle en baisse de 5 à 10 fois par rapport à in vivo 17. Une housse noire avec des ouvertures au-dessus des rétines (inclus dans le système d'adaptateur commerciale) peut être utilisé pour réduire la dispersion de la lumière dans le support d'échantillon et de faciliter la stimulation homogène et égale des deux rétines par la sphère de la publicité in vivo systèmes de Ganzfeld.
NOTE: Pour les enregistrements de la rétine adaptée à l'obscurité, les intensités des bouffées de test utilisées dans un agent de blanchiment expérience typique seulement une fraction négligeable du pigment de sorte que l'absence de régénération conduit RPE-est pas un problème. En outre, il a été montré précédemment que cône pigment régénération peut encore avoir lieu dans la rétine isolée par l'intermédiaire de la cellule Müller cycle visuel 20.
- Comme expériences durent habituellement de 30 minutes à plusieurs heures, de surveiller la dérive de référence, le niveau de bruit et la stabilité de réponse lors de l'expérience que les changements de ceux-ci pourraient indiquer des problèmes techniques.
NOTE: Augmentation du bruit ou de la diminutionamplitudes d de réponse peuvent indiquer des bulles d'air dans les canaux de perfusion ou électrodes, température trop basse ou haute, solution de fuite / déversement ou de déplacement de la rétine.
4. Nettoyage
- Détachez le porte-échantillon à partir des lignes de perfusion, l'ouvrir et vider les rétines du papier filtre. Retirez les électrodes et les rincer avec de l'eau distillée (ne pas utiliser de l'éthanol). Nettoyer le porte-échantillon (y compris les canaux de perfusion) avec de l'éthanol et / ou de l'eau distillée. Rincer soigneusement tubulure de perfusion avec> 70% d'éthanol.
- Rincer la bouteille de perfusion avec de l'eau distillée (ne pas utiliser de détergents). L'éthanol peut également être utilisé pour nettoyer la bouteille.
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Representative Results
Nous avons enregistré les réponses flash de type sauvage adaptés à l'obscurité (WT) C57BL / 6 rétines de souris en suivant les protocoles expérimentaux décrits ci-dessus et illustrés dans la Figure 1 en utilisant différentes solutions de perfusion classiques (Figure 2). Les formes d'ondes et de la cinétique de réponse ainsi que la sensibilité des photorécepteurs à bâtonnets semblent similaires à Ames »et les médias de Locke (Figure 2A et B). D'autre part, dans une solution de Ringer tamponnée par HEPES (pas d'bicarbonate ou 5% de CO2 / 95% d'O 2) les amplitudes de réponse étaient significativement plus petits. Nous avons également constaté que dans ces conditions la stabilité b-ondes a été compromise. Ajout de 40 uM APB (DL-AP4) enlevé positif onde b efficacement dans les trois médias (Figures 2D-F). Retrait de l'onde b révélé une grande vague négative lent (figure 2D) qui a été attribué à Müller activité des cellules 21. Ajout de 100 &# 956; M de baryum aboli cette composante, révélant la réponse du photorécepteur du signal ex vivo ERG (Figures 2D-F). Nous pourrions enregistrer jusqu'à 1 réponses photoréceptrices mV saturés à Ames »et Locke alors que les réponses maximales étaient généralement autour de 200 mV sous perfusion de Ringer.
Cône réponses photoréceptrices ont été isolés auparavant par technique dite de double flash où une sonde flash lumineux saturant les tiges est suivie par un flash de test à un moment où les cônes ont restauré leur état adapté à l'obscurité, mais tiges restent saturés 19,29. Ici, nous avons isolé les réponses ERG cônes médiation (contenant à la fois a et b-ondes) dans les médias Ames complétées avec 100 uM de baryum mais pas DL-AP4 en utilisant la technique de double flash (Figure 3). Baryum a été utilisé pour supprimer la composante gliale lente qui semblait faire la dernière partie des réponses les plus variables en particulier lors de l'utilisation répétitive de bright clignote. Nous avons utilisé un flash de la sonde constante pour saturer tiges et variables clignote de test 300 ms après le flash de la sonde pour obtenir des réponses de cône. Une famille de réponse du cône obtenu en soustrayant réponse flash de sonde de la sonde + 'Flash' essai réponses est représenté en figure 3B.
Figure 1. Utilisation du porte-échantillon ex vivo ERG. (A) de remplissage de canaux d'électrode et de montage des électrodes. (B) Test du porte-échantillon assemblé avant dissection par mesure de la résistance et de la tension entre les paires d'électrodes. (C) de montage de la rétine sur le papier filtre dans le porte-échantillon. (D) Le porte-échantillon connecté à la ligne de perfusion et dans l'amplificateur ERG ERG sy commercialetige. Le chemin d'écoulement de perfusion est indiqué par des flèches bleues. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
familles de réponse 2. Flash Figure enregistrées à partir de rétines adaptés à l'obscurité WT souris perfusés avec (l'Un) de Locke, Ames (B) et de la sonnerie (C) moyenne tamponnée HEPES. Les flashs livrés 3, 40, 130, 390 et 1400 um -2 photons (de -36 à -9 dB ou -3,6 à -0,9 log (Cd sm -2) lumière verte (530 nm)). Traces noires dans (DF) montrent des réponses enregistrées à partir de rétines dans (AC) après addition de 40 uM et 100 uM APB baryum. Traces rouges dans (d) montrent les réponses enregistrées à partir de la rétine dans (A) perfusé avec de Locke supplémenté avec 40 uM APB mais pas baryum. L'encart montre les réponses aux trois plus obscures clignote dans les médias Locke contenant APB et le baryum. Les flashs allaient de 7 à 14 000 photons um -2 (-32 à 1 dB lumière verte) dans (D), de 3 à 1.400 photons um -2 (-36 à -9 dB feu vert) (E), et de 7 à 1.400 photons pm -2 (-32 à -9 dB feu vert) à (F). Voir Vinberg et al. 2014 17 et Lyubarsky et al., 1999 30 et 2004 31 pour les détails de la conversion de l'énergie lumineuse photopique donnée dans Cd sm -2 à photons pm -2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Isolation des réponses de cône avec la méthode de double flash dans WT souris. (A) Une réponse à sonder flash (14.000 photons pm -2 ou 1 dB feu vert, noir) et une réponse à sonder éclair suivie d'un flash test (81.000 photons pm -2 ou 9 dB lumière verte, rouge). (B) Cône réponses flash pour tester clignote allant de 360 à 81 000 photons pm -2 (-14 à 10 dB lumière verte) isolées en soustrayant la réponse sonde flash de la " sonde + flash de test "réponse. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous démontrons ici les étapes critiques pour l'obtention de haute qualité ex vivo enregistrements ERG simultanément à partir de deux rétines de souris isolées en utilisant des composants in vivo du système ERG avec un ex vivo ERG adaptateur. Dans cette étude, nous avons perfusé les deux rétines de l'animal avec la même solution (soit Ames ', Ringer Locke ou) mais il est également possible de perfuser chaque rétine avec une solution différente, par exemple, à des fins de dépistage de drogues. Les étapes les plus importantes pour obtenir des données de haute qualité sont blindage du bruit électromagnétique, dissection minutieuse de la rétine, stable et débit de perfusion relativement rapide en utilisant un porte-échantillon sur mesure avancée, et d'effectuer toutes les procédures de préparation des échantillons en vertu rouge sombre (ou IR) lumière. La méthode décrite ici permet une utilisation immédiate des deux rétines et à double usage d'une installation in vivo ERG pour effectuer in vivo et ex vivo enregistrements ERG.
_content "> L'ex vivo ERG porte-échantillon intégré personnalisé récemment conçu par nous 17, et maintenant disponible dans le commerce, améliore SNR par efficace isolation électrique des parties proximale et distale de la rétine et optimise le flux de perfusion dessus de la rétine (taux de change élevé de la solution .) L'absence des fréquences lentes composantes de bruit dans le signal ex vivo ERG permet l'analyse quantitative, même à partir des réponses de très petites Cependant, nous avons constaté que ex vivo l'enregistrement est plus sensible aux interférences de bruit sur la ligne électrique d'alimentation (60 Hz aux Etats-Unis;. 50 Hz en Europe) que des expériences in vivo. Ce bruit couplé au signal principalement par le biais de la ligne de perfusion, et il pourrait être principalement éliminés par blindage (et la terre) tous les composants de perfusion (bouteille, tube) résidant à l'extérieur de la cage ou Ganzfeld sphère Faraday . En outre, parfois 60 Hz bruit couplé au signal ex vivo ERG à travers l'échangeur de chaleur et ce bruit pourrait également être éliminé par terre. </ P>Nous démontrons comment retirer des composantes spécifiques de signal de blocage en ajoutant ERG pharmacologiques dans le cours de l'expérience de perfusion permettant la dissection de la fonction de différents types de cellules dans le même rétine / expérience avec trois milieux de perfusion physiologique différent (figure 2). Une étude récente a montré que le choix des médias de perfusion affecte photorécepteur physiologie dans les enregistrements de cellules individuelles 32. Ici nous avons utilisé Ames », Locke et« médias HEPES-Ringer 'pour enregistrer les réponses flash adaptés à l'obscurité, en l'absence et la présence de réactifs pharmacologiques destinées à isoler la composante de photorécepteur du signal ERG (Figure 2). solutions de bicarbonate tamponnée donné grandes amplitudes A et B-ondes, jusqu'à 1 mV. Photoréceptrices dim Flash réponses au titre de milieu de Locke avec des bloqueurs contenaient forme d'onde de récupération compliquée (voir l'encadré de la figure 2D) qui n'a pas été vu avec AmesR17; ou perfusion de Ringer. Lorsque l'utilisation d'ex vivo ERG devient adapté par plusieurs laboratoires, il serait utile d'utiliser les mêmes supports de perfusion et des méthodes normalisées pour isoler les différentes composantes de signal. À ce stade, il semble que l'option la plus polyvalente est le milieu de l'Ames, car il donne A et B-ondes amplitudes stables et grands. En outre, la réponse du photorécepteur, sur le plan pharmacologique isolé dans cette solution, qui semble avoir une forme d'onde simple, qui rappelle celle enregistrée à partir de photorécepteurs simples (Figure 2E). Pourtant, certaines questions restent ouvertes à propos de l'existence d'autres composantes de signal ERG observés dans des conditions in vivo. Par exemple, dans nos ex vivo des conditions d'enregistrement, nous ne voyons pas les potentiels oscillatoires éminents, 100 - 150 Hz vagues oscillantes qui sont généralement observés dans la phase ascendante de la b-ondes d'une réponse vivo dans ERG. Il est ainsi possible que la fonction de la rétine interne dans notre ex vivo ex vivo b-ondes impliqués viable sur la fonction cellulaire bipolaire. Les études futures devraient résoudre si des modifications dans les protocoles expérimentaux présentés ici (dissection, perfusion, etc.) nous permettrait d'enregistrer des potentiels oscillatoires sous conditions ex vivo.
Fonction Cone est vital pour notre vision. Toutefois, l'enquête de cônes est entravée par leur petite taille et de la rareté en particulier chez la souris rétine 33. Isolation de la fonction de cône est encore plus compliquée dans souris enregistrements ERG parce que leurs M-cônes et les bâtonnets ont des sensibilités spectrales presque identiques 30. Les protocoles standard de profiter de la différence de plusieurs unité logarithmique entre bâtonnets et des cônes sensibilités en utilisant la lumière de fond en forme de tige supprimer. Cependant, la lumière de fond constante est connu pour désensibiliser tiges 34,35 et affecter la fonction de cône éventuellement par la modulation du couplage de jonction de l'écart entre les cônes et les bâtonnets <sup> 36,37. Ainsi, il est difficile de trouver une intensité lumineuse de fond qui est assez brillant pour garder tiges saturées sans affecter cônes. Ici, nous démontrons une méthode de double flash alternative qui profite à la fois de la sensibilité plus faible et plus rapides cinétique de récupération de cônes 19,29,30. De cette façon, il est plus facile d'isoler des réponses vraiment adapté à l'obscurité à médiation cône. Nous avons remarqué que, dans Ames »ou les solutions de Locke sans tous les bloqueurs, les détails de la forme d'onde de récupération ont été quelque peu affectées au cours de l'expérience par l'utilisation de sondes et de test lumineux clignote. Cela complique l'analyse soustractive pour isoler les réponses du cône. Cependant, l'élimination du composant de baryum gliales a permis de stabiliser la queue de la réponse indiquant que la variabilité est due au composant de cellule Müller. De cette manière, il a été possible d'obtenir des réponses entraîné de cône adapté à l'obscurité chez des souris WT (Figure 3). Cône de réponses isolés par flash doubletechnique de souris WT est apparu plus faible par rapport à ceux enregistrés à partir de souris WT en utilisant la lumière de fond pour supprimer l'activité de tige 17,37. Cette différence peut être expliquée par un effet bien caractérisé la lumière de fond que lentement (en 10 min) améliore amplitudes de réponse de cône probablement due à l'élimination de la suppression de la tige médiation de cône réponses 37-39.
En résumé, la méthode démontré ici rend ex vivo des enregistrements électrophysiologiques possibles pour étudier la fonction de la rétine. Dans l'avenir, nous espérons que beaucoup d'autres laboratoires seront adapter cette méthode puissante pour étudier la physiologie et la pathologie de la rétine humaine et animale et de faire progresser notre compréhension de la fonction rétinienne et de développer de meilleures thérapies pour les maladies cécitantes.
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Disclosures
Université Washington à St. Louis a conclu un accord de licence avec Xenotec, Inc. et peut recevoir des redevances de la vente de l'adaptateur ex vivo.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH subventions EY019312 et EY021126 (VJK), EY002687 au Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles à l'Université de Washington, et par la recherche pour prévenir la cécité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
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