Introduction
Electrorretinograma (ERG) es una técnica bien establecida que puede utilizarse para registrar la actividad eléctrica de la retina provocado por la luz. La señal de ERG se genera principalmente por cambios de voltaje causadas por las corrientes radiales (a lo largo del eje de los fotorreceptores y células bipolares) que fluye en el espacio extracelular resistiva de la retina. La primera señal de ERG fue grabado en 1865 por Holmgren desde la superficie de un ojo de pez 1. Einthoven y Jolly 1908 2 dividen la respuesta ERG a la aparición de la luz en tres ondas diferentes, llamado a-, b-, y c-ondas, que ahora se conoce para reflejar principalmente la actividad de los fotorreceptores, células bipolares EN, y el epitelio de pigmento células, respectivamente 3-8. ERG se puede grabar desde los ojos de animales o humanos (in vivo) anestesiados, desde aislada preparación ojo 9, a través de la retina intacta aislada (ex vivo) 3,10-15 oa través de las capas de la retina específicas con microelectrodos (localERG) 4,16. De estos, in vivo ERG es actualmente el método más utilizado para evaluar la función de la retina. Es una técnica no invasiva que se puede utilizar con fines de diagnóstico o para seguir la progresión de enfermedades de la retina en animales o pacientes. Sin embargo, en vivo grabaciones ERG producen una señal compleja con varios componentes superpuestos, a menudo contaminados por el ruido extraoculares fisiológico (por ejemplo, la respiración y la actividad cardíaca).
ERG local se puede utilizar para grabar la señal a través de capas específicas de la retina, pero es el más invasivo y tiene la relación más baja de señal a ruido (SNR) en comparación con las otras configuraciones de grabación de ERG. ERG local también es técnicamente exigente y requiere equipos costosos (por ejemplo, microscopio y micromanipuladores). Transretinal ERG de la intacto, aislado retina (ex vivo ERG) ofrece un compromiso entre in vivo y métodos locales ERG permitiendo estable y higgrabaciones h SNR de retinas intactas de animales o seres humanos 17. Recientemente, este método ha sido utilizado con éxito para estudiar varilla y fotorreceptor cono función en retinas de mamíferos, primates y humanos 18-20. Además, debido a la ausencia de epitelio pigmentario de la retina ex vivo, se retira el componente de la onda c positivo de la señal de ERG y un componente prominente PIII lento negativo se revela en las grabaciones ex vivo. El componente lento PIII se ha demostrado que proceden de la actividad de las células gliales de Müller en la retina 21-23. Por lo tanto, ex vivo ERG método también podría ser usado para estudiar las células de Müller en la retina intacta. Varios estudios también han demostrado que los ex vivo grabaciones ERG se podrían utilizar para medir la concentración de agentes farmacológicos alrededor de la retina 24 y probar la seguridad y eficacia de los fármacos 25-27.
Comercial múltiple en sistemas in vivo están disponibles yutilizado en muchos laboratorios que no necesariamente tienen amplia experiencia electrofisiología. En contraste, los dispositivos ex vivo no han estado disponibles hasta hace poco 17 y como resultado sólo muy pocos laboratorios están tomando actualmente ventaja de esta técnica de gran alcance. Sería beneficioso para hacer grabaciones ex vivo ERG a disposición de más laboratorios con el fin de avanzar en nuestro conocimiento sobre la fisiología de la retina y la patología, y desarrollar nuevas terapias para enfermedades que causan ceguera. Se demuestra aquí una sencilla y asequible dispositivo ex vivo ERG 17 y mostrar cómo se puede utilizar en combinación con varios sistemas vivo ERG disponibles en el mercado para grabar en la señalización de varilla y el cono mediada (a- y b-ondas) y la función de las células de Müller (lento PIII) desde intactas las retinas de ratones de tipo salvaje.
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Protocol
Todos los protocolos experimentales fueron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Comisión de Estudios de Animales institucional de la Universidad de Washington.
1. Configuración de la perfusión y de muestras
- Preparar la solución para perfusión retina fresco en el día del experimento. Utilice agua destilada y desionizada. Utilice una de las tres soluciones siguientes.
- Prepare Bicarbonato que contiene "solución (1 L): 1 botella de Ames Ames medios de comunicación y 1,9 g de NaHCO 3,
- Preparar la solución de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 EDTA, y 10,0 glucosa, 0,1% de vitaminas MEM y amino ácidos
- Solución de Ringer tamponada con HEPES Preparar (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl 2, 10,0 glucosa, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado a 7,5 con ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, añadir 0,72 g / L de medio de cultivo Leibovitz L-15. Utilice 20 - 50 M DL-AP4 y 50 - 100 mM BaCl 2 para aislar la respuesta de los fotorreceptores con cualquier medio de perfusión.
- Preparar la solución para los electrodos 28 (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl 2, 3, HEPES 0,01 EDTA y ajustar el pH a 7.4 a 7.5 con NaOH. Solución de electrodo se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.
- Preparar y poner a prueba el soporte de la muestra.
- Pegue el papel de filtro negro / gris en la parte superior de las cúpulas de la parte inferior del soporte de la muestra (ver Figura 1 A). Spread de dos componentes 5 min pegamento epoxi cuidadosamente alrededor de los bordes de las tapas planas de las cúpulas. Si es necesario, hacerlo bajo microscopio de disección.
- Espere hasta que el pegamento es casi seco (unos 4 minutos) y pulse el papel de filtro en las cúpulas utilizando un elemento plano. Papel de filtro pegamento al menos un día antes del experimento. Lospapel de filtro se puede utilizar varias veces, pero debe ser reemplazado después de un mes de grabaciones. Utilice etanol al 70% para limpiar cuidadosamente las cúpulas de cualquier residuo de pegamento antes de instalar el papel de sustitución.
- Llenar los canales de electrodos con una solución de electrodo tratando de evitar las burbujas de aire y el tornillo electrodos de pellets cerrados con un adaptador roscado en los canales de los electrodos (ver figuras 1A y B). Conecte las piezas superior e inferior del soporte de la muestra con cuatro tornillos y llenar las líneas de perfusión con solución de electrodo.
- Medir la resistencia y la tensión entre los conductores de cada par de electrodos con un multímetro (Figura 1B). La resistencia debe ser inferior a 100 Ωk y la tensión por debajo de 10 mV si los canales son sin burbujas y los electrodos están en buenas condiciones.
- Verter 400 a 700 ml de medio de perfusión en la botella de vidrio. Separar otros 300 ml a utilizar en la disección de las retinas y sla rompió en una nevera. Ajuste el tubo de perfusión en el bloque intercambiador de calor y coloque el bloque precalentado en la placa de calefacción (ver Figura 1D).
- Incluya la botella con una tapa que tiene conexiones a CO 2 / O 2 gas (si se utiliza de Ames o Locke) y para la tubería de perfusión (ver Figura 1D). Precaliente la botella con los medios de comunicación a 37 o C y colocarlo en la placa de calentamiento o en la parte superior de la unidad de estimulación de la luz en el baño de agua a 37-39 ° C 17.
- Primer de las líneas de perfusión llenándolos de medios de perfusión para iniciar el flujo por gravedad.
- En el sistema de LKC, colocar la botella en la parte superior de la unidad estimuladora 17 para proporcionar un flujo gravitacional significativo que se ajusta entonces por los reguladores de caudal sin ser afectado por el nivel de reducción de la solución de perfusión en la botella durante el experimento.
- En el sistema Ocuscience, coloque el perfusion botella dentro de la jaula de Faraday con el fin de minimizar el ruido y colocar líneas de salida largo de perfusión desde el portamuestras (véase el paso 2.8) muy por debajo del nivel del soporte de la muestra (y la botella de perfusión) para aumentar la unidad gravitatoria de la solución. Proteja estas líneas de salida y conectar el blindaje a tierra del amplificador para evitar el acoplamiento del ruido electromagnético a la señal de ERG.
- Primer de las líneas de perfusión llenándolos de medios de perfusión para iniciar el flujo por gravedad.
- Ajuste la perfusión de 3-5 ml / min mediante el uso de reguladores de caudal. Conecte 5% de CO 2/95% O 2 gas de un cilindro con regulador adecuado y ajustar el caudal para garantizar burbujeo constante de los medios de comunicación en la botella a través de un difusor de aire.
Preparación 2. Muestra
- Ensamble instrumentos de disección limpias y afiladas incluyendo micro tijeras con filo recto, uno o dos de 45 o pinzas, cuchillas de afeitar y una pieza rectangular de papel de filtro.
- Vierta aproximadamente 200 ml de perfu fríaSion solución en una gran placa de Petri de modo que toda la parte inferior del soporte de muestra (incluyendo las cúpulas) se puede sumergir en la solución. Este paso es importante cuando el montaje de las retinas de las cúpulas (véase el paso 2.6). Aunque algunas soluciones están diseñadas para ser saturado con carbógeno (5% de CO2 / 95% de O 2), esto no es esencial para los fines de disección y no se hizo en los experimentos descritos aquí.
- Para un experimento típico, mantener a los animales en 12/12 horas ciclo de oscuridad / luz y la oscuridad-adaptarlos por 6 - 12 horas antes de las grabaciones. La eutanasia a los animales por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical bajo tenue luz roja y hacer todos los siguientes procedimientos previstos en luz roja o infrarrojos dim (utilizar por ejemplo, el filtro rojo delante de la fuente de luz del microscopio).
- Tire de los ojos mediante el uso de pinzas y los puso en los medios de comunicación. Coloque un ojo a la vez en un pequeño pedazo de papel (por ejemplo, un poco de papel de filtro regular) y hacer comoiluminado aproximadamente en el nivel de ora serrata mientras sostiene el ojo con unas pinzas (esto se hace fuera de la solución aquí).
- Corte a lo largo de la ora serrata (o más cerca del ecuador del ojo) con micro tijeras y retire la córnea y el cristalino. Coloque el ocular en los medios de frío en la gran placa de Petri y repita el mismo procedimiento con el otro ojo.
- Cortar una pequeña incisión de la parte superior de la copa para el ojo hacia el nervio óptico manteniendo las tijeras entre la retina y la esclerótica con el fin de mantener la retina tan intacto como sea posible. Grip la esclerótica de ambos lados de la incisión mediante el uso de dos pinzas y tire de las pinzas de distancia el uno del otro para separar la retina.
- Cortar el nervio óptico y tratar de aislar a la retina con una mínima cantidad de contacto físico con la superficie distal. RPE será principalmente separar automáticamente de la retina durante el proceso de disección. Es más importante para evitar la perturbación mecánica de la retina que para realizar ladisección rápidamente, generalmente retinas se puede incubar al menos 30 min en la solución sin efectos significativos sobre las propiedades de respuesta.
- Montar las retinas de las cúpulas del portamuestras (Figura 1C). Sumergir la parte inferior del portamuestras en la placa de Petri con las retinas disecadas. Deslizar la retina, lado fotorreceptor (la superficie convexa de la retina aislada) hacia arriba, por encima de la cúpula y levantar el soporte de la muestra de modo que la retina se fija en el papel de filtro. Repita el procedimiento para el otro retina.
- Secar la placa de soporte con cuidado para evitar la diafonía eléctrica entre las retinas así como el ruido y la señal de derivación. Portamuestras tiene juntas tóricas alrededor de la parte inferior cúpulas para evitar derrame de solución entre la parte inferior y superior del soporte, así como para ayudar a la separación galvánica de los fotorreceptores y células ganglionares lados de las retinas individuales. Coloque la parte superior del soporte con los cuatro tornillos (véase la Figura 1B) y llenar los canales de perfusión con solución de perfusión utilizando una jeringa y una aguja.
- Transferir el portamuestras junto al bloque intercambiador de calor y conectar las líneas de entrada y salida de perfusión en el soporte de la muestra (Figura 1D). Conectar los electrodos al amplificador ERG (electrodos superiores conectan al suelo / menos pasador en el amplificador) y adjuntar la unidad estimulador / control en el soporte de la muestra mediante el uso de un adaptador o deslice la almohadilla eléctrica en la unidad estimulador dependiendo de la in vivo se utiliza el sistema ERG.
3. Grabaciones
- Configure los ajustes del amplificador y de estímulo mediante el uso de software del sistema en vivo. Ajuste la frecuencia de adquisición a un valor entre 1 y 10 kHz y de paso bajo filtrando a 300 Hz. No utilizar el filtrado de paso alto. Utilice 60 Hz (o 50 Hz en Europa) muesca filtro si es necesario.
- La línea de base de registro y sin estimulación de la luz y el ingenioh tenue estimulación (por ejemplo., luz verde de -35 dB o 0,3 mCd sm -2) para probar la buena conexión eléctrica entre los electrodos y muestra de retina. Espere 10 a 20 min antes de iniciar la recogida de datos de manera que la temperatura y la función de la retina llegan a un estado estable.
- Elija los parámetros de estímulo de acuerdo con cualquier experimento específico y comenzar la recolección de datos. Por ejemplo, utilice la luz verde de -40 hasta 0 dB o de 0,1 hasta 1000 mCd sm -2 para una familia respuesta escotópica. Utilice cerca de 2 a 3 log-unidades más brillantes destellos en grabaciones fotópicas donde las barras tienen que ser suprimida por la luz de fondo (3-30 Cdm -2) o un flash de la sonda (aproximadamente 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, ver Figura 3).
- Sin embargo, recuerde que los valores de intensidad de luz exactas podrían ser algo dependiente de la calibración del sistema y de las condiciones experimentales. Como regla general, las intensidades de escala hacia abajo por 5 a 10 veces en comparación con in vivo 17. Una cubierta de negro con aberturas por encima de las retinas (incluidos en el sistema de adaptador comercial) se puede utilizar para reducir la dispersión de luz en el soporte de la muestra y facilitar la estimulación homogénea e igualitaria de ambas retinas por la esfera Ganzfeld del comercial en vivo sistemas.
NOTA: Para grabaciones de retina adaptada a la oscuridad, las intensidades de destellos de prueba utilizados en un experimento típico blanqueador sólo una fracción insignificante del pigmento de modo que la falta de regeneración RPE-impulsado no es un problema. Además, se ha demostrado previamente que la regeneración pigmento cono todavía puede tener lugar en la retina aislado a través del ciclo celular Müller visual 20.
- Como experimentos duran típicamente de 30 min hasta varias horas, controlar la deriva de la línea de base, nivel de ruido y la estabilidad de respuesta durante el experimento como cambios en estos podrían indicar problemas técnicos.
NOTA: El aumento o disminución de ruidoamplitudes de respuesta d pueden indicar burbujas de aire en los canales de perfusión o electrodos, demasiado baja o alta temperatura, solución de fugas / derrames o desplazamiento de la retina.
4. Limpieza
- Separe el soporte de la muestra de las líneas de perfusión, abrirla y vaciar las retinas del papel de filtro. Retire los electrodos y enjuague con agua destilada (no utilizar etanol). Limpiar el soporte de la muestra (incluyendo los canales de perfusión) con etanol y / o agua destilada. Tubo de perfusión Flush cuidadosamente etanol con> 70%.
- Enjuague la botella de perfusión con agua destilada (no usar detergentes). El etanol puede ser también utilizado para limpiar la botella.
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Representative Results
Se registraron las respuestas de flash de tipo salvaje adaptada a la oscuridad (WT) C57BL / 6 retinas de ratones siguiendo los protocolos experimentales descritos anteriormente e ilustrados en la Figura 1 mediante el uso de diferentes soluciones de perfusión estándar (Figura 2). Las formas de onda y la cinética de respuesta, así como la sensibilidad de los fotorreceptores de varilla parecían similares en Ames y los medios de Locke (Figura 2A y B). Por otra parte, en virtud de solución de Ringer tamponada con HEPES (sin bicarbonato o 5% de CO 2/95% O 2) las amplitudes de respuesta fueron significativamente más pequeño. También se encontró que en estas condiciones se vio comprometida la estabilidad de la onda b. Adición de 40 M APB (DL-AP4) eliminó onda b positivo de manera eficiente en los tres medios (Figuras 2D-F). La eliminación de la onda b reveló una gran onda negativa lenta (Figura 2D) que ha sido atribuido a la actividad de células Müller 21. Adición de 100 y# 956; M de bario abolió este componente, revelando la respuesta de los fotorreceptores de la señal ex vivo ERG (figuras 2D-F). Podríamos grabar hasta 1 respuestas fotorreceptoras mV saturadas en Ames y Locke mientras que las respuestas máximas eran por lo general alrededor de 200 mV bajo perfusión de Ringer.
Respuestas fotorreceptoras Cono se han aislado previamente por la llamada técnica de doble flash donde un flash brillante sonda saturar las varillas es seguido por un destello de prueba en un momento en conos han restaurado su estado adaptado a la oscuridad pero varillas permanecen saturada 19,29. Aquí hemos aislado respuestas ERG cono mediada (que contiene tanto a- y b-onda) en los medios de Ames suplementado con 100 mM de bario pero no DL-AP4 mediante el uso de la técnica de doble flash (Figura 3). El bario se utiliza para quitar el componente glial lento que apareció para hacer la última parte de las respuestas más variables especialmente durante el uso repetitivo de bright parpadea. Se utilizó un flash sonda constante para saturar varillas y destellos de prueba variables 300 milisegundos después de que el flash de la sonda para obtener respuestas de cono. Una familia respuesta cono obtenido restando sonda respuesta flash desde las respuestas de la sonda de prueba + Flash 'se muestra en la Figura 3B.
Figura 1. El uso de portamuestras ex vivo ERG. (A) de llenado de los canales de los electrodos y el montaje de los electrodos. (B) Pruebas del portamuestras ensamblado antes de la disección mediante la medición de la resistencia y el voltaje entre los pares de electrodos. (C) Montaje de la retina en el papel de filtro en el soporte de la muestra. (D) El soporte de la muestra conectado a las líneas de perfusión y amplificador de ERG en el SY ERG comercialtallo. La trayectoria del flujo de perfusión se indica mediante flechas azules. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura familias de respuesta 2. flash grabadas en la retina adaptados a la oscuridad WT ratón perfundidos con Locke (A), Ames (B), y tamponada con HEPES Ringer (C) medio. Los destellos entrega 3, 40, 130, 390 y 1.400 fotones m -2 (-36 a -9 dB o -3,6 a -0,9 log (sm Cd -2) luz verde (530 nm)). Huellas negras en (DF) muestran respuestas grabadas en la retina en (AC) después de la adición de 40 mM APB y 100 mM de bario. Rastros rojos en (D) muestran respuestas grabadas desde la retina en (A) perfundido con de Locke suplementado con 40 mM APB pero no de bario. El recuadro muestra las respuestas a las tres destellos más débiles en los medios de Locke que contienen APB y bario. Los destellos varió de 7 a 14 000 fotones m -2 (-32-1 dB luz verde) en (D), de 3 a 1.400 fotones m -2 (-36 a -9 dB luz verde) en (E), y de 7 a 1.400 fotones m -2 (-32 a -9 dB luz verde) en (F). Ver Vinberg et al. 2014 17 y Lyubarsky et al. 1999 30 y 2004 31 para los detalles de la conversión de energía luminosa fotópica dada en Cd sm -2 a fotones micras -2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Aislamiento de las respuestas de cono con método de doble flash de ratón WT. (A) Una respuesta a la sonda flash (14.000 fotones m -2 ó 1 dB luz verde, negro) y una respuesta a la sonda de destello seguido de un destello de prueba (81000 fotones m -2 ó 9 dB luz verde, rojo). (B) las respuestas de flash Cono para probar destellos que van desde 360 a 81.000 fotones m -2 (-14 a 10 dB luz verde) aislado restando la respuesta de flash sonda de la " sonda de prueba + flash "de respuesta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estamos aquí demostrar los pasos críticos para la obtención de alta calidad ex grabaciones ERG vivo simultáneamente desde dos retinas de ratones aislados mediante el uso de componentes en vivo del sistema ERG, junto con un adaptador ex vivo ERG. En este estudio se perfundidos ambas retinas del animal con la misma solución (ya sea Ames ', Locke o de Ringer), pero también es posible para perfundir cada retina con una solución diferente, por ejemplo, para fines de pruebas de drogas. Los pasos más importantes para la obtención de datos de alta calidad están escudando de ruido electromagnético, una cuidadosa disección de la retina, constante y flujo de perfusión relativamente rápida mediante el uso de un portamuestras avanzada hecha a la medida, y la realización de todos los procedimientos de preparación de muestras bajo tenue roja (o IR) ligero. El método aquí descrito permite el uso inmediato de ambas retinas y de doble uso de una instalación in vivo ERG para realizar in vivo y ex vivo grabaciones ERG.
_content "> El vivo portamuestras costumbre construido ex-ERG diseñada recientemente por nosotros 17, y ahora disponible en el mercado, mejora la SNR por eficiente aislamiento eléctrico de los extremos proximal y distal partes de la retina y optimiza el flujo de perfusión por encima del (tipo de cambio alto solución retina .) La ausencia de los componentes de ruido de frecuencias lentas en señal ex vivo ERG permite el análisis cuantitativo, incluso desde muy pequeñas respuestas Sin embargo, encontramos que la grabación ex vivo es más propenso a la interferencia de ruido en la línea de alimentación de CA (60 Hz en los EE.UU.;. 50 Hz en Europa) que en experimentos in vivo. Este ruido acoplado a la señal principalmente a través de la línea de perfusión, y que podría ser removidos principalmente por el blindaje (y a tierra) todos los componentes de perfusión (botella, tubo) que reside fuera de la jaula o Ganzfeld esfera Faraday . Además, a veces 60 Hz ruido acoplado a la señal ex vivo ERG través del intercambiador de calor y este ruido también podría ser removido mediante conexión a tierra. </ P>Se demuestra cómo eliminar componentes específicos de señales ERG mediante la adición de bloqueadores farmacológicos en la perfusión durante el experimento lo que permite la disección de la función de diferentes tipos de células en la misma retina / experimento con tres medios de perfusión fisiológica diferente (Figura 2). Un estudio reciente mostró que la elección de los medios de perfusión afecta la fisiología de los fotorreceptores en grabaciones de células individuales 32. Aquí hemos utilizado Ames, Locke y 'medios HEPES-Ringer' para registrar las respuestas de flash adaptados a la oscuridad en ausencia y presencia de reactivos farmacológicos destinados a aislar el componente de fotorreceptores de la señal ERG (Figura 2). Soluciones de bicarbonato de búfer dieron grandes amplitudes A y B de onda, hasta 1 mV. Fotorreceptoras tenue respuestas flash en medio de Locke con bloqueadores contenían complicada forma de onda de recuperación (ver recuadro de la Figura 2D) que no fue visto con AmesR17; o la perfusión de Ringer. Cuando el uso de ex vivo ERG queda adaptado por más laboratorios que sería útil usar los mismos medios de perfusión y métodos estándar para aislar los diferentes componentes de la señal. En este punto, parece que la opción más versátil es el medio de Ames porque da a- y b-onda amplitudes estables y grandes. Además, la respuesta de los fotorreceptores, aislado farmacológicamente en esta solución, parece tener una forma de onda sencilla que recuerda a la registrada de fotorreceptores individuales (Figura 2E). Sin embargo, algunas preguntas abiertas permanecen sobre la existencia de otros componentes de la señal ERG observados en condiciones in vivo. Por ejemplo, en nuestros ex vivo condiciones de grabación no vimos prominentes potenciales oscilatorios, 100 - 150 Hz ondas oscilantes que se observan normalmente en la fase ascendente de la onda b de un vivo en respuesta ERG. Por tanto, es posible que la función de la retina interna en nuestra ex vivo ex vivo b-ondas implicados viable SOBRE función de la célula bipolar. Los estudios futuros deben resolver si las modificaciones en los protocolos experimentales se muestran aquí (disección, la perfusión etc.) nos permitiría registrar los potenciales oscilatorios en condiciones ex vivo.
Función Cono es vital para nuestra visión. Sin embargo, la investigación de los conos se ve obstaculizada por su pequeño tamaño y la escasez especialmente en la retina del ratón 33. El aislamiento de la función de cono se complica aún más en ratón grabaciones ERG porque sus M-conos y bastones tienen sensibilidades espectrales casi idénticas 30. Protocolos estándar aprovechan la diferencia de varios de log-unidad entre conos y bastones sensibilidades utilizando la luz de fondo de vara supresión. Sin embargo, constante luz de fondo se conoce para desensibilizar varillas 34,35 y afectar la función del cono posiblemente a través de la modulación de acoplamiento de unión brecha entre conos y bastones <sup> 36,37. Por lo tanto, es difícil encontrar un fondo intensidad de la luz que es lo suficientemente brillante como para mantener las varillas saturadas sin afectar conos. Aquí se demuestra un método de doble flash alternativo que aprovecha tanto la menor sensibilidad y la cinética de recuperación más rápidos de conos 19,29,30. De esta manera es más fácil de aislar las respuestas de cono mediada verdaderamente adaptada a la oscuridad. Nos dimos cuenta de que en Ames o soluciones de Locke sin ningún tipo de bloqueadores, los detalles de la forma de onda de recuperación se vieron afectados en cierta medida durante el transcurso del experimento por el uso de sonda y brillantes destellos de prueba. Esto complica el análisis de sustracción para aislar las respuestas de cono. Sin embargo, la eliminación de la componente glial por bario ayudó a estabilizar la cola de las respuestas que indican que la variabilidad se debe a la componente de células Müller. De esta manera fue posible obtener respuestas de cono impulsado adaptada a la oscuridad en ratones WT (Figura 3). Respuestas del Cono aisladas por doble parpadeotécnica a partir de ratones WT apareció más pequeño en comparación con los registrados a partir de ratones WT mediante el uso de luz de fondo para suprimir la actividad varilla 17,37. Esta diferencia puede explicarse por un efecto bien caracterizado de la luz de fondo que lentamente (dentro de 10 min) aumenta la amplitud de la respuesta de cono probablemente debido a la eliminación de la supresión mediada por varilla de respuestas de cono 37-39.
En resumen, el método ha demostrado aquí hace posibles los registros electrofisiológicos ex vivo para estudiar la función de la retina. En el futuro, esperamos que muchos más laboratorios se adaptarán este poderoso método para estudiar la fisiología y la patología de la retina de los animales y humanos y para avanzar en nuestra comprensión de la función de la retina y desarrollar mejores terapias para enfermedades que causan ceguera.
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Disclosures
Universidad de Washington en St. Louis tiene un acuerdo de licencia con Xenotec, Inc. y puede recibir una regalía por la venta del adaptador ex vivo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones EY019312 y EY021126 (VJK), EY002687 al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington, y por la investigación para prevenir la ceguera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
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