Summary

Simultáneo<em> Ex vivo</em> Pruebas funcionales de dos retinas por<em> In vivo</em> Sistema Electrorretinograma

Published: May 06, 2015
doi:

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

Electrorretinograma (ERG) es una técnica bien establecida que puede utilizarse para registrar la actividad eléctrica de la retina provocado por la luz. La señal de ERG se genera principalmente por cambios de voltaje causadas por las corrientes radiales (a lo largo del eje de los fotorreceptores y células bipolares) que fluye en el espacio extracelular resistiva de la retina. La primera señal de ERG fue grabado en 1865 por Holmgren desde la superficie de un ojo de pez 1. Einthoven y Jolly 1908 2 dividen la respuesta ERG a la aparición de la luz en tres ondas diferentes, llamado a-, b-, y c-ondas, que ahora se conoce para reflejar principalmente la actividad de los fotorreceptores, células bipolares EN, y el epitelio de pigmento células, respectivamente 3-8. ERG se puede grabar desde los ojos de animales o humanos (in vivo) anestesiados, desde aislada preparación ojo 9, a través de la retina intacta aislada (ex vivo) 3,10-15 oa través de las capas de la retina específicas con microelectrodos (localERG) 4,16. De estos, in vivo ERG es actualmente el método más utilizado para evaluar la función de la retina. Es una técnica no invasiva que se puede utilizar con fines de diagnóstico o para seguir la progresión de enfermedades de la retina en animales o pacientes. Sin embargo, en vivo grabaciones ERG producen una señal compleja con varios componentes superpuestos, a menudo contaminados por el ruido extraoculares fisiológico (por ejemplo, la respiración y la actividad cardíaca).

ERG local se puede utilizar para grabar la señal a través de capas específicas de la retina, pero es el más invasivo y tiene la relación más baja de señal a ruido (SNR) en comparación con las otras configuraciones de grabación de ERG. ERG local también es técnicamente exigente y requiere equipos costosos (por ejemplo, microscopio y micromanipuladores). Transretinal ERG de la intacto, aislado retina (ex vivo ERG) ofrece un compromiso entre in vivo y métodos locales ERG permitiendo estable y higgrabaciones h SNR de retinas intactas de animales o seres humanos 17. Recientemente, este método ha sido utilizado con éxito para estudiar varilla y fotorreceptor cono función en retinas de mamíferos, primates y humanos 18-20. Además, debido a la ausencia de epitelio pigmentario de la retina ex vivo, se retira el componente de la onda c positivo de la señal de ERG y un componente prominente PIII lento negativo se revela en las grabaciones ex vivo. El componente lento PIII se ha demostrado que proceden de la actividad de las células gliales de Müller en la retina 21-23. Por lo tanto, ex vivo ERG método también podría ser usado para estudiar las células de Müller en la retina intacta. Varios estudios también han demostrado que los ex vivo grabaciones ERG se podrían utilizar para medir la concentración de agentes farmacológicos alrededor de la retina 24 y probar la seguridad y eficacia de los fármacos 25-27.

Comercial múltiple en sistemas in vivo están disponibles yutilizado en muchos laboratorios que no necesariamente tienen amplia experiencia electrofisiología. En contraste, los dispositivos ex vivo no han estado disponibles hasta hace poco 17 y como resultado sólo muy pocos laboratorios están tomando actualmente ventaja de esta técnica de gran alcance. Sería beneficioso para hacer grabaciones ex vivo ERG a disposición de más laboratorios con el fin de avanzar en nuestro conocimiento sobre la fisiología de la retina y la patología, y desarrollar nuevas terapias para enfermedades que causan ceguera. Se demuestra aquí una sencilla y asequible dispositivo ex vivo ERG 17 y mostrar cómo se puede utilizar en combinación con varios sistemas vivo ERG disponibles en el mercado para grabar en la señalización de varilla y el cono mediada (a- y b-ondas) y la función de las células de Müller (lento PIII) desde intactas las retinas de ratones de tipo salvaje.

Protocol

Todos los protocolos experimentales fueron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Comisión de Estudios de Animales institucional de la Universidad de Washington. 1. Configuración de la perfusión y de muestras Preparar la solución para perfusión retina fresco en el día del experimento. Utilice agua destilada y desionizada. Utilice una de las tres soluciones siguientes. Prepare Bicarbonato que contiene "…

Representative Results

Se registraron las respuestas de flash de tipo salvaje adaptada a la oscuridad (WT) C57BL / 6 retinas de ratones siguiendo los protocolos experimentales descritos anteriormente e ilustrados en la Figura 1 mediante el uso de diferentes soluciones de perfusión estándar (Figura 2). Las formas de onda y la cinética de respuesta, así como la sensibilidad de los fotorreceptores de varilla parecían similares en Ames y los medios de Locke (Figura 2A y B). …

Discussion

Estamos aquí demostrar los pasos críticos para la obtención de alta calidad ex grabaciones ERG vivo simultáneamente desde dos retinas de ratones aislados mediante el uso de componentes en vivo del sistema ERG, junto con un adaptador ex vivo ERG. En este estudio se perfundidos ambas retinas del animal con la misma solución (ya sea Ames ', Locke o de Ringer), pero también es posible para perfundir cada retina con una solución diferente, por ejemplo, para fines …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones EY019312 y EY021126 (VJK), EY002687 al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington, y por la investigación para prevenir la ceguera.

Materials

In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

References

  1. Armington, J. C. . The Electroretinogram. , (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Play Video

Cite This Article
Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

View Video