Summary
Drug motstand mot målrettede therapeutics er utbredt og behovet for å identifisere resistensmekanismer - før eller etter klinisk debut - er avgjørende for guiding alternative kliniske forvaltningsstrategier. Her presenterer vi en protokoll til par avledning av multiresistent linjer in vitro med sekvensering for å fremskynde oppdagelsen av disse mekanismene.
Introduction
Detaljert molekylær karakterisering av kreft genomer av robuste sekvense teknologier og forbedret data analytiske verktøy har ført til oppdagelsen av viktige genetiske endringer i bestemte krefttyper 1,2. Utvikling av målrettet terapi rettet mot disse genetiske skader, slik som HER2, BCR-ABL, EGFR og ALK, har betydelig forbedret livskvalitet for pasientene 1,2. Men til tross for spesifisitet av denne tilnærmingen, har klinisk respons på de fleste enslige terapier vært sub-optimal som motstand til slutt fram. Nylig har betydelige fremskritt er gjort i å forstå molekylære grunnlaget for motstand til målrettede behandlingsformer. Forbløffende nok er det blitt klart at en fremtredende resistensmekanismen innebærer vedvarende mål / sti aktivitet. Som et eksempel på dette, androgen reseptor (AR) -rettet enzalutamide behandling av prostatakreft fører til anrikning av aktiverende mutasjoner i AR seg selv, opprettholde AR-signale outputca i nærvær av inhibitoren 3-5. Denne kunnskapen har ført til en aggressiv kampanje for å 1) utvikle tredje generasjons antagonister som kan fortsette å undertrykke både WT og mutant-AR-funksjonen i enzalutamide bestandig PCa 3 og 2) identifisere potensielle nedstrøms noder av AR signale som kan være målrettet for terapeutisk intervensjon . Tilsvarende motstand mot andre klasser hemmere som de rettet mot EGFR, BRAF og ABL ofte føre til mutasjoner som reaktivere opprinnelige addicting kinasereaksjonsveien en.
Med vissheten om at motstanden uunngåelig fremkommer i de fleste pasienter, utvikle tilnærminger til massedrap bringe disse mekanismene for lys vil tillate utvikling av effektive oppfølgingsbehandlinger. En tilnærming som blir mye brukt er å analysere genomikk av kliniske ildfaste svulster i forhold til behandlingsnaive eller -sensitive svulster å identifisere anrikninger / nedbryting av genetiske skader som kan være mottagelig for drug oppdagelse. Til tross for sitt løfte, er det to store forpliktelser i denne tilnærmingen som hindrer rask oppdagelse. For det første kan få rask tilgang til tumormateriale for genomisk avhør tjene som et betydelig hinder i å flytte fra terapi for å kurere. For det andre kan dekonvolvering av mylderet av genetiske lesjoner i motstandsdyktig innstillingen være utfordrende siden svulster kan presentere betydelig intra-tumor heterogenitet 6,7.
I lys av disse utfordringene, har det vært økt avhengighet av preklinisk oppdagelsen av resistensmekanismer. Denne tilnærmingen kan tillate identifisering av prominente resistensmekanismer før kliniske studier 1 som kan veilede alternative klinisk forvaltningstiltak i de pasienter som bærer disse mekanismene enten før behandling eller etter utbruddet av motstand.
En slik preklinisk oppdagelse verktøy som blir mye brukt er å bruke objektive funksjonelle RNAi skjermer. For eksamenpel Whittaker og kolleger påføres et genom-skala RNAi skjermen for å identifisere at NF1 tap formidler motstand mot RAF og MEK-hemmere gjennom vedvarende MAPK pathway aktivering 8. Disse funnene ble funnet å være klinisk relevant som tap-av-funksjon mutasjoner i NF1 ble observert i BRAF -mutant tumorceller som er egentlig motstandsdyktig mot RAF hemming og i melanom svulster resistente mot vemurafenib aktivering 8. Men til tross for suksessen med denne tilnærmingen har mange klinisk relevante mål er ofte ikke er identifisert, antagelig på grunn av tap-av-funksjon forspenningen fra denne tilnærmingen.
I motsetning til en mindre forutinntatt verktøy for prekliniske funn av resistensmekanismer innebærer generering av resistente cellelinjer ved langvarig eksponering for forbindelse av interesse kombinert med NGS-baserte genomisk eller transcriptomic profilering. Denne tilnærmingen har blitt implementert av flere grupper for å identifisere spontantilbakevendende enkle nucleotide varianter eller uttrykk endringer som gjør motstand 5,9,10. For eksempel ble en tilbakevendende F876L mutasjon i AR nylig oppdaget i resistente kloner in vitro 3-5 og i xenografttumorer in vivo 5 før identifisering av denne mutasjonen i klinikken fire. Ganske nylig, Bhang og kolleger (2015) 11 brukes ClonTracer i to klinisk relevante modeller for å vise at flertallet av resistente kloner som oppstår ved langvarig eksponering for legemidlet var en del av en pre-eksisterende undergruppe som tyder på at de fleste funksjonelt relevant mutasjoner er sannsynligvis allerede eksisterende som blir valgt for under valget 11.
I motsetning til den genomiske profilering av tumorer diskutert tidligere kan denne metoden drar nytte av mindre heterogenitet som "homogene" resistente kloner ble brukt til analysen tilrettelegge for mer nøyaktig genetisk disseksjon av potensielle drivere. Furthermmalm, spennende, i tillegg til muligheten for å avdekke resistensmekanismer, denne metoden kan også anvendes for å identifisere cellulære virkningsmekanismer og mål av bioaktive små molekyler hvor denne informasjonen er imidlertid ikke kjent 10. Gitt de klare fordeler og flere bruksområder for denne tilnærmingen, her presenterer vi en protokoll detaljering vellykket gjennomføring av en slik preklinisk skjermen for å maksimere potensialet for klinisk relevante funn.
Protocol
1. Vurdere GI 50 for forbindelse (r) av interesse
- Generer vekstkurve (r) for cellelinjer av interesse for å vurdere riktig seeding tetthet. Plott celle nummer ved forskjellige tidspunkter etter seeding (dager 2, 4, 6 og 8) i forhold til dag 0. Dette vil gi en relativ vekst på cellelinjen av interesse og bør brukes til å vurdere den innledende seeding tetthet slik at løpet ikke er nådd i 96-brønners plater i løpet av 7 dager.
- Når vekstkurver er blitt bestemt, til frø passende antall celler i ikke-gjennomsiktige, klare bunn 96-brønners plater i 100 mL av cellemateriale vurdere GI 50. Seed antall celler basert på cellelinje som brukes, og bestemmes på 1,1. Vanligvis frø 3x10 tre celler for raskt voksende cellelinjer med en dobling-tid på ~ 24 timer, f.eks., HCT116.
- Forbered en analyse plate (dag-1). For analyseplaten, frø celler ved ønsket densitet i 100 ul kulturmedium in brønner skraverte i blått (figur 1). Wells markert i hvitt inneholder bare media.
- Utarbeide en styreplate (dag-1). For kontrollplaten, frø samme tetthet av celler som i trinn 1.2.1 i 100 ul kulturmedium i en separat 96-brønns plate. Denne "Day 0 'lesing vil hjelpe med å tolke cytostatisk / cytotoksiske natur av forbindelsene som blir analysert (figur 2).
- Den neste dag (dag 0), leser styreplaten. Stabillysende celleviabilitet reagens (cellTiter-Glo underlaget blandet med buffer i henhold til produsentens instruksjoner) til romtemperatur og bland forsiktig ved å vende innholdet for å oppnå en homogen løsning. Legg 80 pl av reagens til de 100 ul av celle / media blanding og riste innholdet i 30 minutter for å indusere cellelyse.
- Record luminescens med et luminometer satt til en eksponering på 0,1 til 1,0 sek og deteksjonsbølgelengde på 560 nm.
- Legg testforbindelser (forbindelserrenter) for å analysere plater (dag 0). Lage en 1: 4 seriefortynning av forbindelser i DMSO ved 200x sluttkonsentrasjon for totalt 10 konsentrasjoner (9 fortynninger inneholdende forbindelse og en DMSO bare, sammensatte plate). Som et innledende startpunkt, mål for en 200x laveste dose på 0,03 uM og en topp dose på 2,000 uM (sluttvolum 200 ul).
- Legg serielt fortynnet forbindelser som medium for å lage en forbindelse-medium blanding ved 10x sluttkonsentrasjon (sluttvolum 100 ul, mellomliggende plate). Oppbevar det sammensatte plate ved -20 ° C for bruk på dag 3 av analysen. Tilsett 10 pl av forbindelsen-medium blanding til celler in triplo, slik at den høyeste dose er 10 mikrometer (f.eks., Radene B, C og D, dag 0) (figur 1). Inkuber analyseplater i 3 dager ved 37 ° C. Kast mellomplaten (e) etter bruk.
- På dag tre, utarbeide en 400 mL 1x sammensatte-medium miks ved hjelp av sammensatte platene utarbeidet i 1.4. Invertere analyseplater for å fjerne media og tørk på autoclaved tørkepapir 2-3x å fjerne rester av media. Legg sammensatte / media (100 mL / brønn) til brønner skyggelagt i blått og tilsett 100 mL av media til perimeter brønner for å hindre fordamping (figur 1). Re-inkuber analyseplatene ved 37 ° C i ytterligere 3 dager.
- På dag 6 bedømme relative antallet levedyktige celler ved å utføre en luminescens lesning som beskrevet i trinn 1.3.
- Bruk dagen 0 lesing for å vurdere den statiske / giftig art av forbindelser. Giftige stoffer indusere apoptose mens cytostatika indusere cellesyklus arrest. Hvis forbindelsen er giftig (dag 6 avlesningen er under dag 0 lesing), vurdere å velge GI 50 og GI 50 x 5 konsentrasjoner for motstands analyser. Imidlertid, dersom forbindelsen induserer stasis (lik eller høyere enn d0 lesing), vurdere GI GI 100 og 100 x5 for motstands analyser (figur 2).
2. Sette opp resistens Analyser
- Hvis du arbeider viddha cellegift, frø celler ved en sammenfletting av 30-40% i 150 mm 2 vevskulturskåler (volum = 30 ml) for motstand analysen. Hvis du arbeider med en giftig middel, frø på en 70-80% samløpet.
- For cellelinjer som rommer en intakt mismatch reparasjon (MMR) mekanisme, inkubere cellene fra trinn 2.1 O / N ved 37 ° C med carcinogen N-etyl-N-nitrosourea (ENU). Behandle cellene med 30 ul av en stamløsning av 50 mg / ml ENU (sluttkonsentrasjon 50 ug / ml) for å forbedre genomisk instabilitet. For cellelinjer som har en defekt MMR (tabell 2 og 3), kan behandling med ENU eller andre kreftfremkallende ikke være nødvendig.
- For andre cellelinjer, bestemme MMR-mangel ved NCI kriterier som bruker mikro ustabilitet 12, eller basert på publiserte karakterisering ved hjelp av mikro ustabilitet analyser eller genomisk / epigenomic profilering av MMR gener 13-15.
- Behandle celler med testforbindelsen (e)interesse ved den konsentrasjon som bestemt i trinn 1,8. For svært giftige forbindelser som forårsaker celledød i en typisk tre-dagers levedyktighet assay 10 starte med en lav dose behandling (dvs., GI 50) og trinnvis øke konsentrasjonen (multipler av GI 50) av forbindelse hver 2-3 uker inntil robust motstand er observert. Etterfyll media og sammensatte hver 3 d.
- Når valget er blitt igangsatt, endring media / sammensatte blande hver 3-4 dager før resistente kloner dukke opp. Motstand ved definisjon oppstår når behandlede celler viser økt vekst / levedyktighet i løpet av medikamentbehandling i forhold til akutt behandling av DMSO-behandlede kontrollceller.
3. Isolere enkelt celle Clones
- Undersøke kultur rett med fasekontrastmikroskopi (forstørrelse 40x) for levedyktige klynger av celler.
- Marker tilfredsstillende kloner på bunnen av fatet med en tusjpenn. Plukk kloner som er av gjennomsnittlig størrelse (større kolonier kanstammer fra flere celler) og godt isolert fra andre kolonier. Plukk kloner hjelp av en av to tilnærminger som er skissert i trinn 3.3.
- Tilnærming 1: Ved hjelp av en Pipettor (figur 3)
- Fjern vekstmedier og skyll med 1 x PBS for å fjerne eventuelle flytende celler.
- Bruk svarte merker som guide for å 'plukke' kloner med pipette tips (festet til pipetten, P200 helst).
- Overfør kloner i 48-brønners plater med 200 pl friskt medium (med halv konsentrasjon av forbindelsen for å tillate optimal utvinning av celler).
- Tillate celler til å gjenopprette i 2-3 dager før du legger 200 mL frisk medie / ideelle sammensatte konsentrasjons.
- Fortsette å endre media / sammensatte hver 3-4 dager, og fortsette å utvide kloner.
- Tilnærming 2: Bruke Cloning plater (figur 3)
- Markere kloner som beskrevet i trinn 3.2.
- Plasser 3 mm kloning plater i en 10 cm vevskulturskål inneholder 5 ml 0,25% trypsin-EDTA i 2 min.
- Sug media fra fatet inneholder resistente kloner og klæ kloner med trypsin gjennomvåt kloning plater med sterile engangs tang.
- La i 1-2 minutter, avhengig av hvor lett kloner løft av platene, i en 37 ° C inkubator.
- Plukk opp kloning plater med steril pinsett og overfør til 48-brønners plater med 200 mL ferske media og halvparten konsentrasjon av sammensatte.
- Pipetter opp og ned forsiktig for å løsne cellene fra klonings plater og inkuberes O / N ved 37 ° C (la kloning plater i brønner).
- Den neste morgen, fjerne kloning plater fra 48-brønners plater og komplettere brønnene med 200 ul friskt medium / forbindelse (halv ideell forbindelse konsentrasjon).
- Tre dager senere, fylle media med den ideelle konsentrasjon av forbindelsen.
- Fortsett å endre medie / sammensatte hver 3-4 dager, og fortsette å utvide kloner.
4. Vurdere Grad av Resistance av Isolerte Clones
- Når 10-20 kolonier er utvidet, genererer GI 50 kurver som beskrevet i trinn 1 for å vurdere graden av resistens.
- Alltid inkludere populasjoner kontroll behandlet med DMSO i utvelgelsesprosessen. Det er svært sannsynlig at spekteret av motstanden kommer til å være stor (noen viser delvis mens andre viser fulle motstand). Samle noen få kloner fra hver av disse klassene som resistensmekanismen kan variere mellom de to gruppene.
5. Neste generasjons sekvense
- Spinne ned til 2 millioner celler (kontroll og resistente kloner) (500 x g i 5 min) i 15 ml koniske hetteglass både for gDNA og RNA-samling (derfor 2 x 2 millioner).
- Vask to ganger med 1 x PBS og fryse pellets i -80 ° C inntil de er klare for isolasjon.
- Bruk en kommersiell utvinning kit å isolere RNA eller gDNA henhold til produsentens protokoll.
- Sende inn prøver for neste generasjons sekvensebruker leverandørens protokoll 10.
6. Bioinformatikk analyse av prøver (hel-exome sekvensering)
- Preprocess sekvens data i henhold til en beste praksis DNA-seq rørledning 16.
- Kart alle leser referere menneskelige genom GRCh37 hjelp BWA 17. Konvertere ukomprimerte SAM formatert justeringer i komprimert BAM-format med Samtools 18. Sorter justeringer av koordinere med Samtools. Legg lese grupper som bruker Picard. (For kommandoer bestemt BWA, Samtools og Picard, se Supplerende tekst 1, linjer 1-4)
- Mark alle duplikater leser ved hjelp av MarkDuplicates kommandoen fra Picard verktøysett 19. Hovedsiden denne filen med Samtools. (Supplerende tekst 1, linjer 5-6)
- For å minimere feilaktige baser på tvers av alle lyder, omstille leser lokalt på områder som huser små innskudd eller slette ved hjelp av en Indel realigner 20. (Supplerende tekst 1, linjer 7-8)
- For ytterligere å forbedre accuracy av variant kall, empirisk rekalibrere basen kvalitetspoeng ved hjelp av en base kvalitetsscore rekalibrering verktøyet. Basen kvalitet kalibreringsverktøy bør ikke bare riktig innledende kvalitetspoeng, men også ta hensyn til samvariasjon av flere funksjoner, blant annet lese gruppen, maskin syklus, grunnstilling, og dinukleotid kontekst (tidligere + dagens baser). Generere rekalibrert BAM med Picard PrintReads. (For spesifikke kommandoer for dette trinnet, se Supplerende tekst 1, linjer 9-10)
- Gjenta trinn 6.1.1 gjennom 6.1.4 (Supplerende tekst 1, linjer 1-10) for hver prøve sekvensert.
- Identifisere enkelt nukleotidvariasjon (SNV) i hver klone med paret variant ringer tool19, 21-23. For hver klone sekvensert, løpe sammen variant ringer via foreldre klone som matchet "normal". (Supplerende tekst 1, linje 11)
- Filter tilbakevendende, varianter av høy kvalitet og forberede for annotering med en variant merknad verktøyet 24. Deprioritize variants ikke er felles for alle resistente kloner. (Se R-skript i Tilleggs Text 2)
- Kommentere varianter med en merknad verktøy 25, 26. Mange variant merknadsverktøy har en medfølgende web app slik at data lastes opp og behandles av en ekstern server.
- Bruk en funksjonell innvirkning prediksjon verktøyet 27-29 å prioritere disse variantene spådd av å ha høy funksjonell effekt. Som variant merknader, flere verktøy er tilgjengelige for funksjonell innvirkning prediksjon gjennom et webgrensesnitt.
Representative Results
Å maksimere potensialet for å oppdage viktige funksjonelle driverne av motstand, velg enkelt celle kloner for ekspansjon, fenotypetesting og sekvensering. Som illustrert i figur 4A, HCT116-celler ble behandlet i en lengre periode med cytotoksisk forbindelse # 1 førte til spontan veksten av resistente kloner som fortsatte å vokse i løpet av behandlingen (stiplede sorte sirkler). Disse kloner ble plukket ved hjelp av metode 1 fremhevet i figur 3, og deretter ekspanderes for fenotypisk analyse. Som vist i figur 4B, resistente kloner 1-3 alle viste en betydelig motstand til forbindelse # 1 og dens nære analog forbindelse # 2 (større levedyktighet / vekst), mens alle kloner viste følsomhet overfor et ubeslektet cytotoksisk forbindelse VELCADE. Etter bekreftelse av fenotypisk resistens, ble gDNA isolert og sendt inn for hel-exome sekvense analyse. Bioinformatikk ble brukt til å begrense i på de strukturelle varianter somer 1) tilbakevendende og 2) har potensial for funksjonell effekt (figur 5A). Strukturelle varianter som møtte disse to kriteriene ble bekreftet av en uavhengig sekvense verktøy. Som illustrert i figur 5B, en heterozygot missense mutasjon som ble identifisert ved hjelp av hel-exome sekvensering ble bekreftet ved bruk av Sanger-sekvenseringsmetode (øvre panel, WT sekvens; nedre panel, mutant sekvens). Følgende sekvens bekreftelse, den parentale cellelinje opprinnelig brukt for motstanden analysen var genetisk konstruert for å uttrykke den muterte cDNA til funksjonelt bekrefter rollen av mutasjonen. Som illustrert i figur 6, mens overekspresjon av WT cDNA mislyktes i å gi resistens, tvunget ekspresjon av mutant cDNA betydelig overdratt fenotypisk resistens til forbindelse # 1, og bekrefter den funksjonelle rollen til denne strukturelle variasjoner som en driver for motstand. Alle reagenser anvendt for dette eksperiment er angitt i tabell 1 trong>.
Figur 1. Oppsett av analyse og kontrollplater. Blå skygge, sammensatte behandlings brønner. Hvit skygge, medium bare. Forbindelsene blir fortynnet i serie 1: 4 og administreres i tre paralleller (BD og EG). 2 Forbindelsene kan anvendes per plate.
Figur 2. Representative levedyktighet kurver. Rød stiplet linje representerer dag 0 avlesning. X-aksen indikerer økende doser av forbindelsen til høyre og y-aksen representerer levedyktighet i forhold til DMSO-kontrollbrønner. GI 100 = dose som ble brukt til å oppnå 100% veksthemming; GI 50 = dose som ble brukt til å redusere levedyktigheten til 50% DMSO-kontroll.
_upload / 52879 / 52879fig3.jpg "/>
Figur 3. To tilnærminger for å plukke resistente kloner for ekspansjon. Approach 1- bruk pipetten til å plukke opp og overføre veldefinerte kloner til 48-brønners plater. Tilnærming 2- bruk trypsin-gjennomvåt kloning plater å løfte kloner og overføre til 48-brønners plater.
Figur 4. Bekreftelse av motstanden oppnådd for HCT116 kloner til sammensatte # 1 in vitro. (A) Forbindelse # 1-resistente HCT116 kloner dukket opp etter kontinuerlig treukers utvalg. (B) Levedyktighet av kontroll- og resistente kloner ble testet etter 72 timers behandling med forskjellige forbindelser. Forbindelse # 2 er en nær analog av forbindelse # 1. VELCADE ble anvendt som en kontroll cytotoksisk middel. Data er vist som gjennomsnitt + standardavvik for tre biologiske replikater.
Figur 5. Identifisering av en unik, tilbakevendende mutasjon (enkelt nukleotid-varianter, SNVs) i A-genet i forbindelse # 1-resistente kloner. HCT116 (A) Arbeidsflyt å identifisere SNVs til stede i alle resistente kloner og antatt å ha en høy funksjonell innvirkning av MutationAssessor. (B) Bekreftelse av mutasjon i genet En av Sanger-sekvensering.
Figur 6. Re-uttrykket av muterte genet A konferert motstand til sammensatte # 1 in vitro. Levedyktighet av konstruerte HCT116 cellelinjer ble testet etter 72 timers behandling med sammensatte # 1. HCT116-WT eller mutante cellelinjer som stabilt uttrykker WT eller muterte cDNA av genet A, henholdsvis. Data er vist som gjennomsnitt + standardavvik of tre biologiske replikater.
| Sample Name | Aminosyre | Primær Tissue | Zygosity | |
| C-33-A | p.E768fs * 44 | cervix | Heterozygot | |
| C-33-A | p.S860 * | cervix | Heterozygot | |
| CML-T1 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| CP66-MEL | p.C822F | hud | Heterozygot | |
| CTV-en | p.0? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| EFO-27 | p.Q130fs * 2 | eggstokk | Heterozygot | |
| EFO-27 | s.? | eggstokk | Heterozygot | |
| p.E467K | bryst | Heterozygot | ||
| J-RT3-T3-5 | p.R711 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| LNCaP | s.? | prostata | Homozygot | |
| LoVo | s.? | tykktarmen | Homozygot | |
| MOLT-13 | p.R711 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NALM-6 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NCI-H630 | p.R680 * | tykktarmen | Heterozygot | |
| SKUT-en | p.L787fs * 11 | endometrium | Homozygot | |
| SKUT-1B | pl787fs * 11 | endometrium | Homozygot | |
| SUP-T1 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
Tabell 1. MSH2 -mutated cellelinjer. Aminosyresubstitusjon cellelinje (sample navn), er avstamning av opprinnelse og zygosity indikert.
| Sample Name | Aminosyre | Primær Tissue | Zygosity | |
| CCRF-CEM | p.R100 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Heterozygot | |
| CCRF-CEM | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Heterozygot | |
| CW-2 | p.Y130fs * 6 | tykktarmen | Homozygot | |
| DU-145 | s.? prostata | Homozygot | ||
| GR-ST | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| HCT-116 | p.S252 * | tykktarmen | Homozygot | |
| IGROV-en | p.S505fs * 3 | eggstokk | Homozygot | |
| MN-60 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NCI-SNU-en | p.R226 * | mage | Homozygot | |
| P30-OHK | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| PR-Mel | s.? | hud | Homozygot | |
| REH | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot | ||
| SK-OV-3 | p.0? | eggstokk | Homozygot | |
| SNU-1544 | p.S2L | tykktarmen | Heterozygot | |
| SNU-1 746 | p.E523K | tykktarmen | Homozygot | |
| SNU-324 | p.C233R | bukspyttkjertelen | Heterozygot | |
| SNU-324 | p.V384D | bukspyttkjertelen | Heterozygot | |
| SNU-478 | p.V384D | bukspyttkjertelen | Heterozygot | |
Tabell 2. MLH1 -mutated cellelinjer. Aminosyresubstitusjon cellelinje (sample navn), er avstamning av opprinnelse og zygosity indikert.
Discussion
Valg av cellelinje (r): Karakterisering av genetisk tilstand og genomiske ustabilitet
Utvilsomt den mest kritiske faktoren i vellykket avdekke klinisk relevante resistensmekanismer er den første cellen linjevalg. To faktorer bør vurderes. Først tar sikte på å velge cellelinje (r) av samme avstamning / subtype husing de definerende genetiske egenskaper av sykdommen (f.eks., BRAF V600E i melanom). Avhør av offentlig tilgjengelige transcriptomic og mutasjonsdata for begge cellelinjer 30-32 og primær / metastase svulster for en rekke indikasjoner 33,34 vil lette utvelgelsesprosessen. Selv om identifisering av cellelinjer med klinisk relevante genetiske forandringer er ideell, i noen tilfeller kan dette ikke være mulig på grunn av mangel på tilgjengelige cellelinjer eller gjennomførbart på grunn av faktorer som vanskeligheter og lengden av filtreringsprosessen.
35. Basert på den kosmiske database, flere kandidatcellelinjer eksisterer med mangel på en av to vanlige MMR muterte gener, MSH2 eller MLH1 (tabell 2 og 3). Alternativt, hvis cellelinjer av interesse ikke eksisterer bærer defekter i MMR, akutt behandling med DNA reaktive fysiske eller kjemiske mutagener slik som alkyleringsmiddel N-etyl-N -nitrosourea (ENU) kan brukes til å forbedre genomiske ustabilitet. Selv om begge tilnærmingene kan betydelig finneshorten tid til å oppnå resistente kloner og oppfølging sekvensering, bør strengere funksjonell testing utføres på kandidatgener som et større antall ikke-fungerende, passasjer mutasjoner er sannsynlig å dukke opp. SNVs kan være ordnet for å maksimere sjansene for å identifisere funksjonelt relevante mutasjoner. For det første, velger de mutasjoner som er tilbakevendende i uavhengige kloner vil øke sannsynligheten for disse mutasjonene er førere av motstand. Ved tilbakevendende mutasjoner ikke er identifisert, med fokus på SNVs som passer virkningsmekanismen av stoffet (for eksempel medikamentet mål eller en kjent nedstrøms effektor av stoffet target) kan være meningsfylt. Til syvende og sist, er gullstandarden alltid eksperimentell evaluering av motstand givende aktivitet av kandidat SNVs av ektopisk cDNA uttrykk for narkotika sensitive foreldre celler.
DNA vs RNA sekvense
Når resistente kloner er blitt generert, DNA og / eller RNAkan bli sekvensert, avhengig av behovet. DNA-sekvensering, enten exome eller hel-genomsekvensering, vil tillate identifisering av kimlinje og somatiske varianter, for eksempel SNPs, indels og kopiere antall varianter. Mens mer kostnadsvennlig exome sekvense fokuserer på å generere lyder fra kjente kodende områder, vil hel-genomsekvense genererer sekvensdata for hele genomet som kan lette identifikasjonen av mutasjoner i ikke-kodende elementer slik som forsterkere eller mirnas 36. Men siden genekspresjon data ikke blir målt i løpet av DNA-sekvensering, er det vanskelig å forutsi hvilken mutasjon (er) er sannsynlig å være en funksjonell driver. I denne forbindelse, sekvensering av RNA, men mer kostbart, har denne fordel. Det faktum at mutasjonen ringer er bare utføres på uttrykt RNA arter øker sannsynligheten for at mutasjon av interesse kan være en funksjonell driver. I tillegg til at en mer fokusert undersøkelse av mutasjoner for oppfølging funksjonell testing, RNA sekvense ogsåhar den ekstra fordelen av å være i stand til å identifisere genekspresjon endringer, alternativ spleising og nye kimære RNA-arter, inkludert genfusjoner som også kan tjene som potente førere av motstand.
Bioinformatikk rørledning
Eksempel kommandoer er gitt for illustrasjon formål, men mer detaljert dokumentasjon og tutorials er tilgjengelige fra Broad Institute 16 og bør leses nøye før du begynner NGS analyse. Følgende kommandoer er designet for en UNIX shell miljø på et system der alle verktøy og referansedata er forhåndsinstallert. Disse kommandoene også anta FASTQ filer som inneholder parvise end sekvens leser fra to prøver, som heter "foreldre" og "bestandig", er mottatt fra leverandøren og plassert i "data" katalogen. I de fleste tilfeller er disse kommandoene skal tilpasses eller optimalisert for et bestemt program som bruker ekstra kommandolinje argmenter (for eksempel legge "-t 8" til BWA kommandoen tillater flertrådet drift over 8 prosessorkjerner). Les grupper (som tildeler justeringer til biologiske prøver), må ofte legges til BAM filer selv om det bare er en prøve per bam-fil, for å oppfylle krav filformat for visse verktøy. Les gruppe parametere RGID, RGSM, RGPL, RGPU, og RGLB kan være vilkårlige strenger som beskriver prøvenavnet, sekvense plattform og bibliotek strategi.
In vitro vs in vivo-analyser
Selv om flere resistensmekanismer som er identifisert ved in vitro valg har blitt verifisert til å være klinisk relevant, eksisterer det en mulighet for at mekanismene ikke kan tjene som relevante eller dominerende mekanismer klinisk resistens. En årsak til dette kan være en avgjørende rolle for mikro-miljøet i å drive motstand mot terapi, en komponent som er blottet i forsøksprotokollen / setup discussed hittil. Faktisk har flere studier vist at anti-kreftmidler som er i stand til å drepe tumorceller er uten virkning når tumorcellene blir dyrket i nærvær av stromale celler impliserer medfødte resistensmekanismer som er tillagt av stroma 37,38. Identifisere slike stromaceller-indusert ervervet resistensmekanismer, kan man vurdere å utføre in vitro co-kultur eller in vivo tumor motstand analyser. Siden den tidligere analysen er ganske komplisert, har mange tydd til generering av medikamentresistente tumorxenografter å adressere den potensielle rolle av stroma i kjøremotstanden. Slike studier har avdekket begge identiske 5 og unike 39 resistensmekanismer i forhold til in vitro-seleksjon, noe som tyder på at stroma kan faktisk spiller en rolle i den sistnevnte. Imidlertid må man være oppmerksom på hvor lang tid det kan ta å generere slike resistente svulster og kompleksiteten i oppfølgingen genomisk analyse-complexities på grunn av intra-tumor molekylære og celle heterogenitet.
Target identifikasjon
I tillegg til å avdekke medikamentresistensmekanismer, kan dette NGS-baserte genomisk profilering metode også anvendes for å identifisere cellulære mål av kjemiske sonder. Historisk sett har flere objektive metoder blitt brukt til å identifisere de cellulære virkningsmekanismer og mål med lav molekylvekt kjemikalier med biologiske aktiviteter, inkludert affinitetsrensing kombinert med kvantitative proteomikk, gjær genomiske metoder, RNAi screening, og beregnings slutning tilnærminger 40. Som en forlengelse til belysning av legemiddelresistensmekanismer som bruker NGS-baserte genomisk eller transcriptomic profilering av fenotypisk resistente cellepopulasjoner, identifisering av unike gjentatte enkelt nukleotidvariasjoner (SNVs) eller uttrykk endringer som gjør motstand kan tilby innsikt i funksjonelle cellulære mål av forbindelser. Thans er basert på ideen om at et delsett av resistensmekanismer som observeres kan medføre tilbakevendende mutasjoner i gener som koder for den direkte protein målene for lite molekyl. Nylig har flere rapporter validert nytten av tilnærming, spesielt ved å kombinere med andre tilnærminger inkludert store kreftcellelinje følsomhet profilering, for å avsløre den cellulære mål av små-molekyl sonder 9,10.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne artikkelen er betalt av H3 biomedisin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
| Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
| Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
| RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
| Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
| GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
| MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
| Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
| MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |
References
- Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
- Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
- Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499 (2013).
- Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
- Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
- Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
- Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
- Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
- Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
- Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
- Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
- Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
- Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71 (2013).
- GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
- Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
- Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
- Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
- Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
- Forbes, S., et al. Cosmic 2005. Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).
- Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
- Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
- de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
- Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
- Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
