Summary

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

Abstract

ניתן לתכנות מחדש תאים סומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) על ידי לאלץ את הביטוי של ארבעה גורמי שעתוק (אוקטובר-4, סוקס-2, KLF-4, ו- c-Myc), הביע בדרך כלל על ידי תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) . בשל הדמיון שלהם עם hESCs, iPSCs הפך כלי חשוב לרפואת רגנרטיבית מטופל ספציפי פוטנציאלית, הימנעות סוגיות אתיות הקשורות לhESCs. כדי להשיג תאים מתאימים ליישום קליני, iPSCs ללא transgene צריך להיות שנוצר כדי למנוע הפעלה מחדש transgene, ביטוי גנים שהשתנה ובידול מוטעה. יתר על כן, שיטת תכנות מחדש יעילה והזולה ביותר היא צורך להפיק iPSCs מספיק למטרות טיפוליות. בהתחשב בצורך הזה, גישת פלסמיד episomal שילוב הלא-יעילה היא הבחירה עדיפה לגזירת iPSC. כיום סוג התא הנפוץ ביותר בשימוש למטרות תכנות מחדש הוא fibroblasts, הבידוד של אשר דורש ביופסית רקמה, אניהליך כירורגי nvasive עבור המטופל. לכן, דם היקפי אדם מייצג את הרקמה נגישה ביותר ולפחות פולשנית לדור iPSC.

במחקר זה, פרוטוקול חסכוני ויראלית ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב דווח לדור של iPSCs מתאי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לאחר צנטריפוגה דם השלמה וללא הפרדת שיפוע צפיפות.

Introduction

בשנת 2006, הקבוצה של שיניה יאמאנאקה 1 הוכיחה בפעם הראשונה שתאים סומטיים מעכברים ובני האדם מבוגרים יכולים להיות מומרים למדינת pluripotent על ​​ידי ביטוי חוץ רחמי של ארבעה גורמי תכנות מחדש (אוקטובר-4, סוקס-2, KLF-4, ו ג-Myc), יצירת התאים שנקרא המושרה pluripotent הגזע (iPSCs) 2. iPSCs מטופל ספציפי דומה מאוד בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) במונחים של מורפולוגיה, הפצה והיכולת להתמיין לסוגי תאי שלוש-נבט (המזודרם, האנדודרם והאאקטודרם) ואילו חסרי דאגות האתיות הקשורות לשימוש בhESCs ועקיף דחייה חיסונית אפשרית 3. לפיכך, iPSCs מופיע כאחד מהמקורות החשובים ביותר של תאי חולה ספציפי למחקר בסיסי, הקרנת סמים, דוגמנות מחלה, הערכה של רעילות, ומטרות רפואת רגנרטיבית 4.

כמה גישות שימשו במשך דור iPSC: וקטורי שילוב נגיפיים(רטרו-וירוס 5, lentivirus 6), ויראלי וקטורי שילוב-עישון (אדנווירוס 7), סנדאי וירוס 8, transposons BAC 9, וקטורי episomal 10, חלבונים 11 או משלוח RNA 12. למרות שהשימוש בשיטות תיווך וירוס יכול להוביל לתכנות מחדש יעילות גבוהה, וקטורים ויראליים להשתלב בגנום של תאי מארח וmutagenesis insertional האקראי ולכן פוטנציאל, שינוי קבוע של ביטוי גנים, והפעלה מחדש של transgenes הושתק במהלך התמיינות לא ניתן לשלול 13.

כדי להפוך iPSCs בטוח יותר לרפואת רגנרטיבית, נעשו מאמצים כדי להפיק iPSCs ללא שילוב של DNA אקסוגני לתוך הגנום תאי. למרות וקטורים ויראליים excisable וtransposons פותחו, זה עדיין לא ברור אם רצפים קצרים וקטור, שבהכרח יישארו בתאי transduced לאחר כריתה, וtransposase ביטוי, יכולים לגרום לשינוי בתאular לתפקד 13. למרות היעילות הגבוהה תכנות מחדש שלה, וירוס סנדאי מייצג גישה יקרה ולהגיע דרך חששות רישוי עם החברה שפיתחה מערכת זו יש הפוטנציאל להגביל יישומה במחקרי translational. יתר על כן, את הצורך בהקדמה ישירה של חלבונים ו- RNA דורש משלוח מרובה של תכנות מחדש מולקולות עם המגבלות טכניות הטבועות זו מציגה, ויעילות תכנות מחדש כוללת היא נמוכה מאוד 14. ראוי לציין, שיטות שילוב הלא-נגיפיות-חופשיות וחסכוניות המבוססות על השימוש בפלסמידים episomal דווחו בהצלחה לתכנות מחדש של fibroblasts עור 15. באופן ספציפי, בעבודה הנוכחית החלטנו להשתמש בפלסמידים episomal מסחריים זמינים ללא אינטגרציה, כפי שדווח בעבר 10,15.

עד כה, fibroblasts העור מייצג את סוג תא התורם הפופולרי ביותר 5. עם זאת, מקורות תא אחרים היו succesתכנות מחדש sfully לiPSCs כולל קרטינוציטים 16, בתאי גזע mesenchymal מח עצם 17, תאי סטרומה שומן 18, שיער הזקיקים 19, ותאי עיסת שיניים 20. הבידוד של תאים אלה דורש פרוצדורות כירורגיות, וכמה שבועות יש צורך במבחנה הרחבת תא כדי להקים תרבות תא ראשונית.

לאור זאת, הבחירה של מתחיל סוג התא היא קריטית וחשוב באותה מידה להיות מסוגל לייצר iPSCs מרקמות נגישים ופחות פולשני כמו דם. שני תאי mononuclear דם טבורי (CBMNCs) 21,22 והיקפי mononuclear דם תאים (PBMNCs) 14,22-24 מייצגים מקורות מתאימים של תאים לגזרה של iPSCs.

למרות היעילות של תכנות מחדש PBMNC המבוגר היא 20-50 פעמים נמוכה מזה של 22 CBMNCs, הם נשארים סוג התא הנוח ביותר למטרה דגימה. בלמעשה, יש דגימת PBMNC את היתרון של להיות פולשנית, ובנוסף, תאים אלה אינם דורשים הרחבה רבה במבחנה לפני ניסויי תכנות מחדש. עד כה, פרוטוקולים שונים דיווחו כי PBMNCs לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות אפשר להקפיא ולהפשיר ימים לכמה חודשים לאחר ההקפאה ומורחבת לכמה ימים לפני תכנות מחדש לiPSCs 22,23. עם זאת, ככל שאנו מודעים לא דווחנו תארו תכנות מחדש של PBMNCs ממעיילי אפים קפואים. חשוב לציין, מעילי אפים קפואים שנאספו ללא הפרדת שיפוע צפיפות מייצגים את דגימות דם הנפוצות ביותר מאוחסנות בbiobanks בקנה מידה הגדול ממחקרי אוכלוסייה, ובכך מייצג את בריכה נגישה של חומר לייצור iPSC שימנע איסוף דגימה נוסף.

במסמך זה אנו מדווחים לראשונה את הדור של iPSCs הנגיפי-חופשי ממעיילי אפים קפואים אנושיים, המבוסס על פרוטוקול שתואר קודם לכן 22. בבנוסף, iPSCs נוצרו מPBMNCs הקפוא מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות, כפרוטוקול בקרה לתוצאות PBMNC שיפוע שאינו צפיפות מטוהרת.

Protocol

תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMNCs) היו מבודדים מדגימות דם היקפיים אנושיות של תורמים בריאים לאחר שנחתמו הסכמה ואישור הוועדה האתית של מחוז הדרום טירול הודיעה. ניסויים נערכו בהתאם לעקרונות לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי. כל הנתונים נאספו ונותחו באופן אנונימי. <p class="jove_title" style=";text…

Representative Results

במחקר זה פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור iPSCs הנגיפי-בחינם על ידי תכנות מחדש של PBMNCs מבודד ממעיילי אפים קפואים לאחר צנטריפוגה דם השלמה והשוואה עם תכנות מחדש של PBMNCs מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות מדווחת. איור 1 א מציג ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מפורט. לאחר הפשרה, PBMNCs המ…

Discussion

בעבר, הדרך היחידה להשיג תאי גזע pluripotent אדם נושאים מוטציה גנטית מסוימת היה לגייס הורים עוברים אבחון גנטי טרום השרשה וליצור תאי גזע עובריים מblastocysts הושלכה 31,32. שימוש בגישה תכנות מחדש, חוקרים יכולים כעת ליצור iPSCs מחולים נושאים כמעט כל גנוטיפ. האפשרות להתחיל משורת תא…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube Terumo VF-054SBCS07
Ammodium chloride Sigma-Aldrich A9434
Potassium bicarbonate Sigma-Aldrich 60339
EDTA disodium powder Sigma-Aldrich E5134 0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium  GE Healthcare Life Sciences 17-5442-02 Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)  Gibco 21056-023 No phenol red
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) Gibco 51500-056  1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031 1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 300-07 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) PeproTech 200-03 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) PeproTech 100-11 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) R&D Systems  287-TC-500 2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D2915 1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin R&D Systems  2914-HT 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II Gibco 11269016 Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1 StemCell Technologies 5850 Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM Gibco 10829-018
Knockout Serum Replacement Gibco 10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140-050
2-Mercaptoethanol  Gibco 31350-010 0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate Sigma-Aldrich B5887 0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa  R&D Systems  4114-TC 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503  10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum Hyclone SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution Merck-Millipore ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD Biosciences 354230
Collagenase, Type IV Gibco 17104-019 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007 Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) Global Stem GSC-6201G 1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F Addgene  27077 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK Addgene  27078 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL Addgene  27080 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP Addgene  27082 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit Stemgent 00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody Merck-Millipore MAB4304 1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody Merck-Millipore MAB4360 1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody Merck-Millipore MAB4381 1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-9081 1/500
Anti-Nanog Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-33759 1/500
Anti-Troponin I Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15368 1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody Sigma-Aldrich A7732 1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody Covance Research Products Inc  MMS-435P-100 1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Calbiochem 657012 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse  Molecular Probes A-11029 1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit Molecular Probes A-21429 1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate Corning 3471
Trizol Reagent Ambion 15596-018  reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754050 Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 185-5195
Experion Automated Electrophoresis System Bio-Rad 700-7000 Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit Bio-Rad 7007105 Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) Zeiss 495007
NeonTransfection System 100 µL Kit Invitrogen MPK10025 Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000 Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells–from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Play Video

Cite This Article
Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas, A. A., Schwienbacher, C., Silipigni, R., Di Segni, M., Chen, H. V., Pramstaller, P. P., Hicks, A. A., Rossini, A. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids. J. Vis. Exp. (100), e52885, doi:10.3791/52885 (2015).

View Video