誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。
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方法論記事
非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
体細胞は、典型的には、ヒト胚性幹細胞（hESC）で表される、（KLF-4、Oct-4の、ソックス-2、及びc-Mycの）は、4つの転写因子の発現を強制することによって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）に再プログラムすることができ。によるヒトES細胞との類似性のために、性IPSCは、ヒトES細胞に関連する倫理的な問題を回避し、潜在的な患者特有の再生医療のための重要なツールとなっています。臨床応用のために適切な細胞を得るために、導入遺伝子を含まないiPS細胞は、導入遺伝子の再活性化、遺伝子発現の変化と誤った分化を回避するために生成される必要があります。また、非常に効率的で安価な再プログラミング方法は、治療目的のために十分なiPS細胞を誘導するために必要です。この必要性を考えると、効率的な非統合エピソームプラスミドアプローチは、iPS細胞の誘導に好適な選択です。現在、再プログラミングのために使用される最も一般的な細胞型は、線維芽細胞、組織生検を必要とするの分離、Iであります患者のためのnvasiveの外科的処置。そのため、ヒト末梢血は、iPS細胞の生成のための最もアクセスし、最も侵襲性の組織を表します。
本研究では、非組み込み型エピソームプラスミドを用いてコスト効果およびウイルスフリープロトコルは、全血の遠心分離後に密度勾配分離せずに凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）からのiPS細胞の生成のために報告されています。
概要
2006年には、山中伸弥のグループが1 KLF-4、成体マウスおよびヒトからの体細胞は、4つの再プログラミング因子（Oct-4の、ソックス-2の異所性発現によって多能性状態に変換することができることを初めて実証し、 C-Mycの）、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）2を生成します。患者特異性IPSC密接形態、増殖、およびhESCの使用に関連する倫理的な問題を欠くと迂回し、三生殖細胞型（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に分化する能力の点でヒト胚性幹細胞（hESC）の似ています可能な免疫拒絶3。このように、性IPSCは、基礎研究、薬物スクリーニング、疾患モデリング、毒性の評価、および再生医療の目的のために4患者特異的細胞の最も重要な源の一つとして表示されます。
いくつかのアプローチは、iPS細胞の生成のために使用されている：ウイルスベクターを統合します（レトロウイルス5、レンチウイルス6）、ウイルス非組み込み型ベクター（アデノウイルス7）、センダイウイルス8、BACトランスポゾン9、エピソームベクター10、タンパク質11またはRNAの送達12。ウイルス媒介方法の使用は、高効率のリプログラミングにつながることができます....
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プロトコル
末梢血単核細胞（PBMNCs）は、後のインフォームドコンセントと南チロル州の倫理委員会の承認に署名した健康なドナーのヒト末梢血サンプルから単離しました。実験は、ヘルシンキ宣言で表さ原理に従って行われました。すべてのデータが収集され、匿名で分析しました。
末梢血単核細胞（PBMNCs）の1の単離
- PBMNCsは、密度勾配分離することなく、全血を遠心分離した後、バフィーコートから得られました。
- クエン酸ナトリウム中に静脈末梢血の8ミリリットルを収集し、室温（25℃）で、プラスチックチューブ、およびストアバッファリング。採取後12時間内のプロセスの血液。
- スイッチングオフ遠心ブレーキを、スウィングローターで、4℃で15分間、2,000×gでチューブを遠心。
- 曇ったバフィーコート（上プラズマ相との間の層と下部の収集クリオバイアルチューブ内に濃縮されたPBMNC画分（500μl）を含む赤血球の大部分を含む相）、。
- 2×500μlの、10％のDMSO濃度で1mlの総容量を得るために、90％FBSおよび20％DMSOを含む培地を凍結してバフィーコートの500μLを再懸濁します。
- -80℃で制御された速度の冷凍コンテナのバイアルを凍結。より長い期間のために液体窒素中で細胞を保管してください。
- 密度勾配分離後に得られたPBMNCs
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結果
本研究では、全血の遠心分離および密度勾配分離が報告された後に得られたPBMNCsの再プログラミングと比較した後に凍結したバフィーコートから単離したPBMNCsの再プログラミングによるウイルスフリー性IPSCを生成するための簡単で効果的なプロトコルです。 図1（a）は、の概略図を示します詳細なプロトコル。解凍後、典型的な丸みを帯びた形状を示す単離されたPBMNCsは、14日間の特定の血液培養培地（ 図1B）に展開され、その後、エピソームプラスミドでトランスフェクトしました。 10〜15日後にトランスフェクションした後、定義されたマージンと胚性幹細胞様の形態を有する小さな丸い明るいコロニーが（ 図1C）現れ始めます。約20〜30日、トランスフェクション後に、iPS細胞コロニーは、シャープなエッジで、非常にコンパクトになり、そのサイズを大きくして、ピッキングと拡張（ 図1D）の準備ができています。最初の継代工程（2-3継代）した後、iPS細胞のコロニーをそれらの未分化状態を維持し、典型的なヒト胚性幹細胞の形態.......
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ディスカッション
過去には、唯一の方法は、特定の遺伝的変異を有するヒト多能性幹細胞を得るためには、着床前遺伝子診断を受けている親を募集し、その廃棄31,32胚盤胞から胚性幹細胞を生成することでした。再プログラミングのアプローチを使用して、研究者らは現在、事実上すべての遺伝子型を保有する患者からiPS細胞を生成することができます。それは障害および新規治療アプローチのその後の識別の病態生理の研究を可能にするため、患者特異的細胞株と簡単にアクセスできるソースから開始する可能性は非常に重要です。
本研究では、我々はすでに凍結軟膜PBMNCsから以前に密度勾配分離22後に凍結PBMNCsからiPS細胞と正常に生成ウイルスフリー性IPSCを生成するために適用される方法とのプラスミドアプローチ15を組み合わせます。代わりに、密度勾配分離PBMNCsすべてのバフィーコートの使用サンプル処理中にオペレータのための時間と手動の手順を作業、コストを削減するために私達にOWS。凍結したバフィーコートからPBMNCsを使用して、低コストのプロトコルのセットアッ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、保健省とボルツァーノ自治州の教育支援・大学・研究局、および南チロリアン・スパークス財団の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| クエン酸ナトリウム緩衝液Venosafeプラスチックチューブテル | モ | VF-054SBCS07 | |
| アンモジウム | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| 炭酸カリウム | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA二ナトリウム粉末 | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M溶液 |
| Ficoll-Paque Premium | GEヘルスケアライフサイエンス | 17-5442-02 | 密度勾配遠心分離用ポリスクロース溶液 |
| Iscoveの修飾ダルベッコ培地(IMDM) | Gibco | 21056-023 | フェノールレッドハム |
| F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (ノーマル: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-アスコルビン酸 2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-チオグリセロール | Sigma-Aldrich | M6145 | 最終濃度 200 & micro;M |
| 組換えヒト幹細胞因子 (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (在庫:100 µg/ml) |
| 組換えヒトインターロイキン-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 & micro;g/ml) |
| 組換えヒトインスリン様成長因子 (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| 組換えヒトエリスロポエチン(EPO) | R&Dシステムズ | 287-TC-500 | 2 U/ml (ストック:50 U/ml) |
| デキサメタゾン | シグマ・アルドリッチ | D2915 | 1 μM (ストック: 1 mM) |
| ヒトホロトランスフェリン | R&Dシステムズ | 2914-HT | 100 Μg/ml (在庫:20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | 細胞遺伝学的解析用培地 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | iPSCフィーダーフリー培養用培地 |
| ノックアウトDMEM | Gibco | 10829-018 | |
| ノックアウト血清補充 | Gibco | 10828-028 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-グルタミン (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-メルカプトエタノール | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (ストック: 50 mM) |
| 酪酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (ストック: 0.5 M) |
| 組換えヒト FGF 基本、145 aa | R&Dシステムズ | 4114-TC | 10 ng/ml (在庫: 10 & マイクロ;g/ml) |
| Y-27632 二塩酸塩 | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (在庫: 10 mM) |
| 胎児定義ウシ血清 | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% ゼラチン溶液 | メルク・ミリポア | ES-006-B | |
| マトリゲル基底膜マトリックス 成長因子の減少 | BD Biosciences | 354230 | |
| コラゲナーゼ, IV型 | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (在庫: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAALaboratories GmbH | L11-007 | 細胞剥離液 |
| マウス胚性線維芽細胞 (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| プラスミド pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 & マイクロ;g(ストック:1µg/µl) |
| プラスミドpCXLE-hSK | アドジェネ | 27078 | 1 µg(ストック:1µg/µl) |
| プラスミドpCXLE-hUL | アドジェネ | 27080 | 1 & マイクロ;g(ストック:1µg/µl) |
| プラスミドpCXLE-EGFP | アドジェネ | 27082 | 1 &マイクロ;g(ストック:1µg/µl) |
| アルカリホスファターゼ染色キット | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 1/250 | |
| Anti-Oct-3/4 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covanceリサーチプロダクツ株式会社 | MMS-435P-100 | 1/500 |
| 抗チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 抗体 | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 ヤギ 抗マウス | 分子プローブ | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギ | 分子プローブ | A-21429 | 1/1000 |
| 超低接着細胞培養 6 ウェルプレート | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | RNA抽出用試薬 |
| SuperScript VILO cDNA 合成キット | Invitrogen | 11754050 | 逆転写酵素キット |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 リアルタイム PCR 解析システム | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion 自動電気泳動システム | Bio-Rad | 700-7000 | RNA の完全性を確認する装置 |
| Experion RNAHighsense分析キット | Bio-Rad | 7007105 | RNAの完全性をチェックするための試薬キット |
| 解剖顕微鏡(SteREO Discovery V12 | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl キット | Invitrogen | MPK10025 | エレクトロポレーション用試薬キット |
| ネオントランスフェクションシステム | Invitrogen | MPK5000 | エレクトロポレーション用機器 |
| NanoDrop UV/Vis 分光光度計 | Thermo Scientific | ND-2000 | DNA/RNA定量用機器 |
| EndoFree プラスミド マキシキット | Qiagen | 12362 | プラスミド精製キット |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from f....
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