Summary
الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمثل مصدرا للأنسجة المريض محددة للتطبيقات السريرية والبحوث الأساسية. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لإعادة برمجة الخلايا البشرية الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة في iPSCs مجانا الفيروسية باستخدام غير دمج-البلازميدات episomal.
Abstract
الخلايا الجسدية يمكن برمجتها إلى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) عن طريق إجبار التعبير عن أربعة عوامل النسخ (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، ج. Myc على)، عن عادة عن طريق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) . نظرا لتشابهها مع hESCs، أصبحت iPSCs أداة هامة لالمحتملين الطب المريض محددة على التجدد، وتجنب القضايا الأخلاقية المرتبطة hESCs. من أجل الحصول على خلايا مناسبة لتطبيق السريرية، تحتاج iPSCs خالية من التحوير أن تتولد لتجنب تنشيط التحوير، تغير التعبير الجيني والتمايز المضلل. وعلاوة على ذلك، وهي طريقة ذات كفاءة عالية وغير مكلفة برمجة ضروري لاشتقاق iPSCs كافية لأغراض علاجية. ونظرا لهذه الحاجة، وهو نهج عدم دمج episomal البلازميد الكفاءة هو الخيار الأفضل لالتوجيهية الاشتقاق. حاليا نوع من الخلايا الأكثر شيوعا تستخدم لأغراض إعادة برمجة الخلايا الليفية و، وعزل الأمر الذي يتطلب أخذ عينة الأنسجة، وأناإجراء العمليات الجراحية nvasive للمريض. وبالتالي، يمثل الدم المحيطي البشري الأنسجة التي يمكن الوصول إليها والأقل الغازية لتوليد التوجيهية.
في هذه الدراسة، وتفيد التقارير بروتوكول مجانا الفيروسية فعالة من حيث التكلفة واستخدام غير دمج-البلازميدات episomal لتوليد iPSCs من خلايا الإنسان الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة بعد الطرد المركزي كله دم وبدون كثافة الفصل الانحدار.
Introduction
في عام 2006، وشينيا ياماناكا مجموعة من 1 أثبتت لأول مرة أن الخلايا الجسدية من الفئران والبشر البالغين يمكن تحويلها إلى دولة المحفزة التي كتبها التعبير خارج الرحم من أربعة عوامل إعادة برمجة (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، و ج. Myc على)، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) 2. iPSCs المريض محددة تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) من حيث التشكل والانتشار والقدرة على التمايز إلى أنواع الخلايا الجرثومية الثلاث (الأديم المتوسط، الأديم والأديم الظاهر)، في حين تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية المرتبطة باستخدام hESCs وتجاوز من الممكن الرفض المناعي 3. وبالتالي، iPSCs تبدو وكأنها واحدة من أهم مصادر خلايا المريض محددة للبحوث الأساسية، وفحص المخدرات، والنمذجة المرض، وتقييم سمية، وأغراض الطب التجديدي 4.
وقد استخدمت عدة طرق لتوليد التوجيهية: ناقلات دمج الفيروسية(الارتجاعي 5، الفيروسة البطيئة 6)، الفيروسي عدم دمج نواقل (اتش 7)، سينداي الفيروسات 8 والترانسبوزونات BAC 9 ناقلات episomal 10، 11 البروتينات أو تسليم RNA 12. على الرغم من أن استخدام وسائل بوساطة الفيروس يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع كفاءة برمجة، ناقلات فيروسية على الاندماج في جينوم الخلية المصابة، وبالتالي المحتملة الطفرات إقحامي عشوائية، تغيير دائم في التعبير الجيني، وتنشيط الجينات المحورة إسكات خلال التمايز لا يمكن استبعاد 13.
لجعل iPSCs أكثر أمانا للطب التجديدي، بذلت جهود لاستخلاص iPSCs دون دمج الحمض النووي الخارجية في الجينوم الخلوي. على الرغم من النواقل والترانسبوزونات الفيروسية خاضع للضريبة وضعت، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان تسلسل ناقلات القصيرة، التي لا تزال حتما في الخلايا transduced بعد الختان، وtransposase التعبير، يمكن أن يفضي التغيير في الخليةجزيئية يعمل 13. على الرغم من ارتفاع كفاءة إعادة برمجة لها، ويمثل فيروس سينداي نهج مكلفة والوصول من خلال المخاوف الترخيص مع الشركة التي طورت هذا النظام لديها القدرة على الحد من تطبيقه في الدراسات متعدية. وعلاوة على ذلك، فإن الحاجة إلى إدخال المباشر من البروتينات والحمض النووي الريبي يتطلب تسليم متعددة من إعادة برمجة الجزيئات مع القيود التقنية المتأصلة هذا يدخل، وكفاءة إعادة برمجة الشاملة منخفضة جدا (14). من المذكرة، تم الإبلاغ عن أساليب الحرة الفيروسية وعدم دمج فعالة من حيث التكلفة على أساس استخدام البلازميدات episomal بنجاح لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد 15. على وجه التحديد، في العمل الحالي قررنا استخدام التجارية المتاحة البلازميدات episomal خالية من التكامل، كما ذكرت سابقا 10،15.
حتى الآن، الخلايا الليفية الجلدية تمثل الأكثر شعبية نوع من الخلايا المانحة 5. ومع ذلك، فإن مصادر أخرى من الخلايا نجاح للبرمجتها sfully إلى iPSCs بما في ذلك الخلايا الكيراتينية 16، نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة 17، خلايا انسجة الدهنية 18، 19 بصيلات الشعر، وخلايا لب الأسنان 20. عزل هذه الخلايا تتطلب عمليات جراحية، وهناك حاجة لعدة أسابيع لفي المختبر توسيع الخلية من أجل تأسيس ثقافة الخلية الأولية.
في ضوء ذلك، واختيار لبدء نوع من الخلايا أمر بالغ الأهمية، وأنه من المهم أيضا أن تكون قادرة على إنتاج iPSCs من الأنسجة يمكن الوصول إليها بسهولة وأقل الغازية مثل الدم. كل من الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMNCs) 21،22 والطرفية وحيدة النواة خلايا الدم (PBMNCs) 14،22-24 تمثل المصادر المناسبة من الخلايا للاشتقاق iPSCs.
على الرغم من أن كفاءة الكبار PBMNC إعادة برمجة أقل 20-50 مرات من تلك التي من CBMNCs 22، إلا أنها تظل نوع من الخلايا الأكثر ملاءمة لغرض أخذ العينات. فيالواقع، PBMNC أخذ العينات لديها ميزة كونها الغازية الحد الأدنى، وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الخلايا لا تتطلب توسيع نطاق واسع في المختبر قبل إعادة برمجة التجارب. حتى الآن، وأفادت البروتوكولات المختلفة التي PBMNCs بعد الانفصال كثافة التدرج يمكن تجميد وإذابة أيام إلى عدة أشهر بعد تجميد وتوسيع نطاقها لبضعة أيام قبل إعادة برمجة إلى iPSCs 22،23. ومع ذلك، بقدر ما نحن ندرك ووصف أي تقارير عن إعادة برمجة PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة. الأهم من ذلك، المعاطف الشهباء المجمدة التي تم جمعها من دون فصل كثافة التدرج تمثل عينات الدم الأكثر شيوعا المخزنة في المصارف البيولوجية على نطاق واسع من الدراسات السكانية، مما يمثل حمام سباحة يمكن الوصول إليه بسهولة من المواد اللازمة لإنتاج التوجيهية أن يتجنب المزيد من جمع العينات.
هنا نقدم تقريرا للمرة الأولى توليد iPSCs مجانا الفيروسية من الإنسان المعاطف الشهباء المجمدة، استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا (22). فيبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء iPSCs من PBMNCs المجمدة التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج، وبروتوكول التحكم في نتائج PBMNC غير الكثافة التدرج تنقيته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم عزل الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMNCs) من الإنسان عينات الدم الطرفية من المتبرعين الأصحاء بعد أن وقعت الموافقة المستنيرة وموافقة اللجنة الأخلاقية لمقاطعة جنوب التيرول. وأجريت التجارب وفقا للمبادئ الواردة في إعلان هلسنكي. وجميع البيانات جمعها وتحليلها مجهولة.
1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة (PBMNCs)
- PBMNCs تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم كله، من دون فصل التدرج الكثافة.
- جمع 8 مل من الدم المحيطي وريدي الى سيترات الصوديوم مخزنة أنبوب من البلاستيك، وتخزينها في RT (25 ° C). الدم العملية في غضون 12 ساعة بعد جمع.
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 2000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في يتأرجح دلو الدوار، التبديل حالا الفرامل أجهزة الطرد المركزي.
- جمع معطف الشهباء غائم (الطبقة بين مرحلة البلازما العليا والسفلىالمرحلة التي تحتوي على أكثر من كريات الدم الحمراء)، الذي يحتوي على PBMNC جزء التخصيب (500 ميكرولتر) في أنبوب cryovial.
- و resuspend 500 ميكرولتر من معطف الشهباء مع 500 ميكرولتر من 2X تجميد المتوسطة التي تحتوي على 90٪ FBS و 20٪ DMSO، من أجل الحصول على الحجم الكلي لل1 مل مع 10٪ تركيز DMSO.
- تجميد القارورة في حاوية تجميد معدل الخاضعة للرقابة في -80 ° C. مخزن الخلايا في النيتروجين السائل لفترات أطول.
- PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج
- جمع 12 مل من الدم المحيطي وريدي الى سيترات الصوديوم مخزنة أنبوب بلاستيكي، وتخزينها في RT. الدم العملية في غضون 12 ساعة بعد جمع.
- تمييع الدم مع PBS العقيمة إلى الحجم النهائي من 35 مل.
- بعناية وببطء، طبقة 35 مل من الدم المخفف في 15 مل من محلول polysucrose (التي تستخدم لفصل كثافة التدرج) (ع = 1.077) في 50 مل أنبوب مخروطي (نسبة 3: 1).
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 800 x ج لمدة 30 دقيقة في RT فييتأرجح دلو الدوار، التبديل حالا الفرامل أجهزة الطرد المركزي.
- نضح العلوي، المرحلة الصفراء التي تحتوي البلازما وتخلص منه. بعناية، ونقل طبقة البيني بيضاء غير شفافة تحتوي على PBMNCs إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
- يصل إجمالي حجم إلى 30 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- تجاهل طاف و resuspend الخلايا مع 30 مل من برنامج تلفزيوني. حساب عدد خلايا قابلة للحياة، على أساس التريبان الأزرق الاستبعاد 25.
- PBMNCs أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT، نضح طاف وتخلص منه.
- resuspend الكرية خلية في كمية مناسبة من تجميد المتوسطة التي تحتوي على 90٪ FBS و 10٪ DMSO، من أجل الحصول على تركيز 5 × 10 6 خلية / مل.
- قسامة 1 مل لكل قارورة (حوالي 5 × 10 6 خلية / مل)، وتجميد قارورة في مراقبة معدل تجميد الحاويات في - 80 ° C. مخزن الخلايا في النيتروجين السائل لفترات أطول.
2. ذوبان وطلاء من PBMNCs (DAY 0)
- PBMNCs تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم كله، من دون فصل التدرج الكثافة.
- لبدء البروتوكول باستخدام PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة، وذوبان الجليد 1 قارورة من الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، وتمييع معطف الشهباء مع برنامج تلفزيوني العقيمة إلى الحجم النهائي من 2 مل.
- نقل معطف الشهباء المخفف إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 10 مل من أحمر العازلة تحلل الخلايا واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
- لإعداد 500 مل من أحمر العازلة تحلل الخلية، إضافة 0.5 غرام من بيكربونات البوتاسيوم، 4.145 غرام من كلوريد الأمونيوم، و 100 ميكرولتر من 0.5 M حل EDTA إلى 500 مل من الماء عالى النقاء، ودرجة الحموضة 7،2-7،4.
- يصل إجمالي حجم 50 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 50 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، الطرد المركزي معطف الشهباء في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- resuspend الخلايا في1 مل من PBMNC المتوسطة، كما هو موضح سابقا 22، تتألف من: IMDM وهام في F-12 (نسبة 1: 1)، 1٪ من الانسولين ترانسفيرين-السيلينيوم ايثانول (ITS-X)، 1٪ من كيميائيا تعريف التركيز الدهون (سي دي)، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 0.005٪ من حمض L-الأسكوربيك، 0.5٪ من الأبقار مصل الزلال (BSA)، 1-Thioglycerol (نهائي تركيز 200 ميكرومتر)، الخلايا الجذعية عامل SCF (100 نانوغرام / مل)، انترلوكين -3 IL-3 (10 نانوغرام / مل)، إريثروبويتين EPO (2 U / مل)، الانسولين عامل النمو الذي يشبه IGF-1 (40 نانوغرام / مل)، ديكساميثازون (1 ميكرومتر) وهولو-ترانسفيرين (100 ميكروغرام / مل ).
- نقلها إلى جانب واحد من 12 لوحة جيدا مع معيار سطح تعامل زراعة الأنسجة، من دون طلاء، في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة، حتى الخطوة المتوسطة المتغيرة (انظر القسم 3).
- PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج
- لبدء البروتوكول باستخدام PBMNCs المجمدة بعدكثافة الفصل الانحدار، وذوبان الجليد 1 قارورة من الخلايا في حمام مائي عند 37 ° C، ونقل الخلايا في 5 مل من PBMNC المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- resuspend الخلايا في 1 مل من PBMNC المتوسطة ونقلها إلى جانب واحد من لوحة ال 12 أيضا، في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة، حتى الخطوة المتوسطة المتغيرة (انظر القسم 3).
3. الثقافة والتوسع في PBMNCs (DAY 2-13)
- جمع PBMNCs في الثقافة تعليق، باستخدام ماصة مع طرف 1 مل، 15 مل في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسط PBMNC الطازجة.
- نقل الخلايا إلى 1 بشكل جيد من 12 لوحة جيدا مع معيار سطح تعامل زراعة الأنسجة، من دون طلاء، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
4. ترنسفكأيشن من PBMNCs مع Episomal البلازميدات (DAY 14)
ملاحظة: إجراء عزل البلازميدات episomal خالية من intergation التجارية الأربعة، التي تحمل جينات تعدد القدرات باستخدام طقم التجارية لتنقية البلازميد وتقييم نوعية البلازميدات النقاء باستخدام التحليل agarose هلام، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- جمع PBMNCs في 15 مل أنبوب مخروطي وحساب عدد خلايا قابلة للحياة (على أساس استبعاد التريبان الأزرق) 25.
- الطرد المركزي 2 × 10 6 الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- و resuspend 2 × 10 6 خلايا في مزيج ترنسفكأيشن تحتوي على 100 ميكرولتر من إعادة تعليق مؤقت T و 1 ميكروغرام لكل DNA البلازميد (البلازميد واحد يحمل OCT3 / 4 و shRNA ضد البروتين p53، البلازميد واحد يحمل SOX2 وKLF4، واحدالبلازميد تحمل L-MYC وLIN28، والبلازميد واحدة تحمل EGFP، للتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن).
- نضح مزيج ترنسفكأيشن التي تحتوي على الخلايا في 100 ميكرولتر طرف وإدراج ماصة مع العينة عموديا داخل الأنبوب، مليئة 3 مل من العازلة كهربائيا E2، وضعت في محطة ماصة من جهاز Electroporation لل، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- خلايا electroporate كفاءة استخدام البرنامج التالي: 1650 V، و 10 مللي ثانية، 3 البقول.
- resuspend الخلايا electroporated (2 × 10 6 خلايا) في 2 مل من قبل تحسنت المتوسطة PBMNC، مضيفا 0.25 ملي الصوديوم الزبدات (NAB) وحساب عدد خلايا قابلة للحياة بعد بروتوكول Electroporation لل(على أساس استبعاد التريبان الأزرق) 25.
- نقل الخلايا إلى جانب واحد من لوحة 6 جيدا دون طلاء، صخرة بلطف لوحة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
- اليوم بعد Electroporation لل، اشعرتي عدد الخلايا GFP إيجابية تحت المجهر مضان 8-10 المجالات عشوائية، من أجل تقييم كفاءة ترنسفكأيشن.
- الحفاظ على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل دون تقسيم لمدة 3 أيام، حتى الطلاء لهم على MEFS (انظر القسم 6).
- استبدال 2 مل من PBMNCs الطازجة المتوسطة، بالإضافة إلى 0.25 ملي NAB كل يومين.
5. إعداد أطباق مع الخلايا المغذية للالمشارك الثقافة (DAY 16)
- معطف الآبار من لوحة 6 جيدا مع 1 مل من الطابق السفلي مصفوفة الغشاء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و لوحة الماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا / جيد مع 2 مل 10٪ الواردة FBS DMEM (MEF المتوسطة) قبل الركض PBMNCs electroporated على الخلايا المغذية MEF يوم واحد.
6. PBMNCs تصفيح Transfected على MEFS (DAY 17-19)
- جمع PBMNCs في الثقافة تعليق، باستخدام ماصة مع 1 مل طرف، في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي transfected PBMNCs في 300 x ج لمدة 10 دقيقةفي RT.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه في 2 مل من المتوسط PBMNC الطازجة، بالإضافة إلى 0.25 ملي NAB.
- لوحة الخلايا على MEF المغلفة 6 جيدا لوحة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
- بعد يومين، نضح في والمتوسطة واستبدالها 2 مل من IPSC متوسطة تتألف من خروج المغلوب DMEM (KO-DMEM)، و 20٪ استبدال KO-المصل (KOSR)، 1 ملم NEAAs، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 20 مم L- الجلوتامين، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 10 نانوغرام / مل جمعية جيل المستقبل (bFGF الأساسي) و 0.25 ملي NAB.
- استبدال 2 مل من الطازجة المتوسطة التوجيهية كل يوم والتحقق من خلايا يوميا.
ملاحظة: في حوالي 22-25 يوم، وينبغي أن المستعمرات الأولى من iPSCs تكون مرئية.
7. انتقاء وتوسيع المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) النسخ (DAY 30-35)
ملاحظة: في حوالي 30-35 يوما بعد ترنسفكأيشن، ينبغي أن تكون مستعمرات التوجيهية جاهزة للقطف وreplating. وينبغي أن تكون كفاءة إعادة برمجة ESTIتزاوج كنسبة مئوية من عدد من المستعمرات التوجيهية / العدد الكلي للخلايا electroporated، كما ذكرت سابقا 26.
- قبل يوم واحد الركض المستعمرات التوجيهية، وإعداد وحدة التغذية MEF في لوحة 12-جيدا (1.25 × 10 5 خلايا / جيد).
- نضح في والمتوسطة MEF وتتغير مع 1 مل من IPSC المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر Y-27632. تشريح يدويا باستخدام إبرة واحدة مستعمرة في كل مرة تحت المجهر تشريح في قطف غطاء محرك السيارة من أجل الحصول على الشبكة، وجمع كتل أصغر من قبل pipetting ونقلها بشكل فردي كل في بئر واحدة من 12 لوحة جيدا المغلفة مع MEFS.
- مرور وتوسيع كل لوحة 12-جيدا لوحة 6 جيدا في نسبة 1: 2، ثم كل لوحة 6 جيدا في نسبة 1: 4 لمزيد من الانتشار. تشريح وتوسيع iPSCs يدويا لالممرات الأولى 2-3 (كما هو موضح تماما في الخطوة 7.2)، ثم استخدم إجراء انزيم تفارق (تبدأ من الخطوة 7.4).
- لوضع بروتوكول انزيم تفارق ونظيفة التوجيهية coloniوفاق بواسطة الشفط أجزاء متباينة، تحت المجهر تشريح في قطف غطاء محرك السيارة.
- احتضان iPSCs مع 1 مل من كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
- نضح الحل الانزيم، وشطف الخلايا مع 1 مل من KO-DMEM وجمع المستعمرات في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
- نضح طاف، resuspend والمستعمرات في 2 مل من IPSC المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر Y-27632 لوحة ولهم على MEF المغلفة لوحة 6 جيدا (نسبة 1: 4).
8. توصيف iPSCs (بين 5-15 مقاطع)
- الفوسفاتاز القلوية تلطيخ
- ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 3-5 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
- لبدء بروتوكول الفوسفاتيز القلوية تلطيخ، وشطف iPSCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومن ثم اصلاحها مع 1 مل من 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، لإزالة المتبقي PFA.
- خلايا وصمة عار الثابتة باستخداموالقلوية عدة الفوسفاتيز تلطيخ التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- المناعي
- ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 3-5 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
- لبدء الفحص المناعي، وغسل iPSCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومن ثم اصلاحها مع 1 مل من 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في RT.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، لإزالة المتبقي PFA.
- علاج iPSCs ثابتة مع 1 مل من permeabilization / عرقلة الحل تحتوي على 4٪ مصل الماعز، 0.1٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.05٪ أزيد الصوديوم (نان 3) لمدة 1 ساعة على RT.
- نضح عرقلة الحل واحتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الأولية في 3٪ BSA و 0.05٪ نان 3 حل O / N عند 4 ° C (راجع الجدول المادي لقائمة الأجسام المضادة الأولية واقترح الأجسام المضادة عامل التخفيف).
- في اليوم التالي، وغسل iPSCs ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم احتضان الخلايا مع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس واليكسا فلوريداuor 555 الماعز الأجسام المضادة المضادة للأرنب، المخفف 1: 1000 في 3٪ BSA و 0.05٪ نان 3 الحل، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- وصمة عار على النوى مع دابي (1μg / مل) لمدة 10 دقيقة في RT في الظلام، تليها ثلاث غسل الوقت مع برنامج تلفزيوني.
- تمايز iPSCs في الهيئات مضغي (EBS)
- ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 5-6 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
- إزالة أجزاء متباينة من المستعمرات التوجيهية بواسطة الشفط، تحت المجهر تشريح في قطف غطاء محرك السيارة.
- احتضان iPSCs مع 1 مل من كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
- نضح الحل الانزيم، وشطف الخلايا مع 1 مل من KO-DMEM وجمع المستعمرات في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
- نضح طاف و resuspend المستعمرات في 2 مل من EB متوسطة تتألف من KO-DMEM، 20٪ حددت مصل الجنين البقري (FBS)، 1 ملم NEAAs، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 20 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملم46؛ -mercaptoethanol.
- لوحة المستعمرات التوجيهية في تعليق لمدة 6 أيام على مرفق منخفضة للغاية 6 لوحات جيدة، وذلك للسماح للتشكيل هيئات مضغي ثلاثية الأبعاد كروي (EBS). تغيير 2 مل من الطازجة المتوسطة EB كل يومين.
- في يوم 7، وجمع EBS وطبق لهم على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6 لوحات جيدة في 2 مل من EB المتوسط والحفاظ على EBS في التمايز لمدة 20 يوما.
- تغيير 2 مل من الطازجة المتوسطة EB كل يومين.
- QRT-PCR تحليل التعبير الجيني
- ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 5-6 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
- استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من PBMNCs، iPSCs أو EBS باستخدام 1 مل من كاشف التجاري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تقييم تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء بالطرق المناسبة مثل استخدام الطيف (RNA جودة عالية مع A 260 / A 280 و A 260 / A 230 النسب> 1.8) 27.
- الاختيارسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام طقم التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (جودة عالية RNA RQI> 9.5) 28.
- إجراء رد فعل عكس النسخ على 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعة الناسخ العكسي التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إعداد الخلائط QPCR تحتوي على 5 نانوغرام من قالب [كدنا]، 7.5 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix، 2 ميكرولتر من 5 ميكرومتر الاشعال (إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 ميكرولتر من ريبونوكلياز / الدناز خالية من الماء لكل 29 رد فعل.
- أداء QRT-PCR باستخدام البرنامج التالي: خطوة تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورة مقسمة إلى خطوة تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتمهيدي الصلب والإرشاد خطوة عند 60 درجة مئوية لمدة 45 29 ثانية.
- تطبيع التعبير عن الجينات الأخرى التي تستخدم GAPDH كما الجينات التدبير المنزلي 28 (انظر الاشعال المدرجة في الجدول 1).
- QPCRلالتحوير الاستبعاد
- استخراج الحمض النووي من PBMNCs أو iPSCs باستخدام 1 مل من تحلل العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، 100 ملي EDTA، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) و 20 ميكروغرام / مل بروتين K.
- إضافة حجم مساو (1 مل) من 100٪ الأيزوبروبانول، مزيج من قبل انقلاب ثلاث مرات من أجل السماح للترسيب الحمض النووي وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- تجاهل طاف، ويغسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح وتجاهل طاف و resuspend في ريبونوكلياز / الدناز خالية من الماء.
- تقييم تركيز الحمض النووي والنقاء بالطرق المناسبة مثل استخدام الطيف (RNA جودة عالية مع A 260 / A 280 و A 260 / A 230 النسب> 1.8) 27.
- إعداد الخلائط QPCR تحتوي على 5 نانوغرام من الحمض النووي القالب، 7.5 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix، 2 ميكرولتر من 5 ميكرومتر الاشعال (إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 &# 181؛ ل من ريبونوكلياز / الدناز خالية من الماء لكل 29 رد فعل.
- تطبيع التعبير البلازميد episomal محدد EBNA-1 الجينات باستخدام FBX-15 كما الجينات التدبير المنزلي 29 (انظر الاشعال المدرجة في الجدول 1).
- تحليل النمط النووي
- ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 5-6 أيام على خالية من وحدة التغذية الطابق السفلي مصفوفة غشاء لوحة مغطاة تجارية محددة والمتوسطة صيانة مجانية المغذية للiPSCs، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
- لبدء بروتوكول تحليل النمط النووي، فصل المستعمرات التوجيهية مع 1 مل من محلول مفرزة خلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، حتى الحصول على تفكك خلية واحدة.
- جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- و resuspend iPSCs في 2 مل من متوسطة وضعت خصيصا لزراعة الخلايا لتقنيات التشخيص قبل الولادة. iPSCs لوحة وحيدة الخلية على الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة أطباق الزجاج واحتضان لهم في 37 ° C، 5٪ CO 2 </ دون> الحاضنة.
- بعد 2-4 أيام، إضافة 10 ميكرولتر / الكولشيسين مل مباشرة إلى الثقافات واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
- نضح المتوسطة واحتضان iPSCs في 1 مل من محلول منخفض التوتر (0.6٪ سيترات الصوديوم و 0.13٪ كلوريد البوتاسيوم) لمدة 10 دقيقة في RT.
- شطف الخلايا مع 1 مل من 5٪ محلول حامض الخليك وإصلاح iPSCs مع الميثانول / حل حامض الخليك (نسبة 3: 1) في الجهاز مع درجة الحرارة للرقابة والرطوبة (28 ° C، و 42٪ RH).
- تزج وصمة عار الثابتة الخلايا مع حل كيناكرين لمدة 15-20 دقيقة في RT في الظلام (للحصول Q-النطاقات) 30.
- اكتساب طور متوسط الخلية تحت المجهر مضان في التكبير 100X 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs مجانا الفيروسية عن طريق إعادة برمجة PBMNCs معزولة عن المجمدة المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم الكامل والمقارنة مع إعادة برمجة PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الإبلاغ عن فصل التدرج الكثافة. ويبين الشكل 1A تمثيل تخطيطي ل بروتوكول تفصيلا. بعد ذوبان الجليد، وPBMNCs معزولة، مما يدل على شكل مستدير نموذجي، يتم توسيع محدد في مستنبت الدم لمدة 14 يوما (الشكل 1B) ثم مع transfected البلازميدات episomal. بعد 10-15 يوما بعد ترنسفكأيشن، المستعمرات مشرق مدورة صغيرة مع هوامش محددة والجذعية الجنينية تشبه الخلايا التشكل تبدأ في الظهور (الشكل 1C). بعد ما يقرب من 20-30 أيام ترنسفكأيشن، المستعمرات التوجيهية تصبح مدمجة للغاية، مع حواف حادة، وزيادة حجمها وجاهزة للقطف والتوسع (1D الشكل). بعد الخطوات الركض الأول (2-3 الممرات)،المستعمرات التوجيهية الحفاظ على دولتهم غير متمايزة وتظهر الجذعية الجنينية مورفولوجيا نموذجية الخلية البشرية. خلال الممرات الأولى، قطف اليدوي هو وسيلة التوسع أكثر كفاءة مقارنة انزيم تفارق من أجل اختيار غير متمايزة تماما، والتعاقد ومعبأة بإحكام المستعمرات (أرقام 2A). التكبير أكبر من المستعمرات التوجيهية يظهر الخلايا الفردية داخل المستعمرات والنواة إلى ارتفاع نسبة السيتوبلازم ورصدت أكثر بسهولة (الشكل 2B). بعد قطف الميكانيكية الأولي، يتم توسيع استنساخ التوجيهية المحددة مع التفكك انزيم باستخدام كولاجيناز الرابع. بعد 10-15 مقاطع من التوسع في المختبر، يتم إجراء تحليل وراثي خلوي على المستعمرات التوجيهية. حوالي 20 طور متوسط من اثنين على الأقل الثقافات مستقلة، ففي حوالي 300-400 مستوى الفرقة، ويتم تحليل وإظهار جميع العينات لkaryogram العادي (الشكل 2C). وتشير هذه الملاحظة التي iPSCs مستقرة وراثيا.
الخلفإيه في المختبر التوسع (5-10 الممرات)، وتتميز iPSCs للتعبير عن علامات stemness وإمكانية تعدد القدرات الخاصة بهم. أرقام 3A، B تبين أن iPSCs إيجابية لتلطيخ الفوسفاتيز القلوية. باستخدام التحليل QRT-PCR، ونحن التحقق من أن iPSCs تعبر عن الجينات المحفزة الذاتية (SOX-2، OCT3 / 4، NANOG) عند مستويات أعلى بكثير من PBMNCs البدء، في حين أن مستويات التعبير عن الذاتية C-MYC وKLF-4 هي مماثلة من قبل و بعد التوجيهية برمجة (الشكل 3C). بعد فقط 5 مقاطع في الثقافة، لا يمكن أن يتم الكشف عن التعبير عن الجينات المحورة episomal الخارجية في iPSCs، مما يشير إلى تفعيل ناجحة من الجينات المحفزة الذاتية. PBMNCs بعد 5 أيام ترنسفكأيشن، مع قوي مستوى التعبير التحوير، تقييمها من قبل الاشعال محددة episomal لEBNA-1، يتم استخدامها لمكافحة إيجابية. PBMNCs التي لم تتعرض لالبلازميدات تحمل 4 جينات تعدد القدرات الخارجية، كما تستخدم سيطرة سلبية (فايجوري 3D). أخيرا، التحليل المناعي يكشف عن أن iPSCs تعبر عن علامات تعدد القدرات، مثل OCT3 / 4، SOX-2، SSEA-4، TRA-1-60، وTRA-1-81 (الشكل 4).
وتختلف iPSCs إلى الهيئات مضغي (EBS) باستخدام بروتوكول التمايز عفوية، كما هو مبين في الشكل 5A، من أجل تقييم في المختبر تعدد القدرات المحتملة. تجارب QRT-PCR تكشف عن أن iPSCs قادرة على التمايز إلى خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث؛ في الواقع، حصلت EBS بعد 20 يوما من عرض تمايز كبير يصل التنظيم من ممثل علامات النسب من الأديم الباطن (SOX-7، ا ف ب)، الأديم المتوسط (CD31، ACTA-2، CDH-5، RUNX-1) والأديم الظاهر (KTR- 14، TH، GABRR-2) (الشكل 5B). ويظهر التحليل المجهري متحد البؤر التي وحيدة الخلية نأت المجموعات بفوزه على التعبير عن علامات cardiomyocyte نموذجية مثل تروبونين I (تينيسي-I) وα-Actinin، نظمت في نمط الساركومير واضح (الشكل6 ا). بالإضافة إلى ذلك، التحليل المناعي للEBS يظهر تلطيخ إيجابية للعصبون محددة الدرجة علامة III β-تويولين (TUJ1)، فضلا عن الدوبامين العصبية هيدروكسيلاز علامة التيروزين (TH) (الشكل 6B).
الشكل 1. بروتوكول لتوليد iPSCs من الدم المحيطي والخلايا التغيرات المورفولوجية الإنسان خلال البروتوكول. (A) رسم تخطيطي لبروتوكول يستخدم لتوليد iPSCs تم الحصول عليها من PBMNCs المجمدة بعد DGS وPBMNCs عزل من المعاطف الشهباء المجمدة، وذلك باستخدام ترنسفكأيشن واحد من غير دمج البلازميدات episomal. (B) صور الممثل المتكاثرة PBMNCs تم الحصول عليها من أسهم دبي للذهب والمعاطف الشهباء بعد ذوبان الجليد والتوسع في الثقافة لمدة 14 يوما، قبل أن يتم transfected. مقياس شريط 100 ميكرون. (C) أمثلة على المستعمرات التوجيهية بعد أسبوع من الخلايا ررATED على MEFS. شريط مقياس 500 ميكرون. (D) صور الممثل المستعمرات التوجيهية في 30-35 يوما بعد إعادة الطلاء-على MEF المغذية طبقة. شريط مقياس 500 ميكرون. iPSCs = الخلايا الجذعية المحفزة. أسهم دبي للذهب = كثافة الفصل التدرج؛ PBMNCs = الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية. MEFS = الخلايا الليفية الماوس الجنينية. العوامل GFS = النمو؛ bFGF = عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية؛ NAB = الصوديوم الزبدات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مورفولوجيا وتحليل النمط النووي. (A) صور الممثل المستعمرات التوجيهية بعد 2-3 الخطوات الركض اليدوية. شريط مقياس 500 ميكرون. (B) التكبير الصورة من المستعمرات التوجيهية. شريط مقياس 200 ميكرون. (C) Represekaryograms طبيعي ntative من iPSCs بعد 10-15 مقاطع من التوسع في المختبر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توصيف التوجيهية: نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية، وإعادة التعبير عن الجينات تعدد القدرات الذاتية للiPSCs وتقييم التحوير إسكات (A) و (B) صور الممثل تبين تلطيخ إيجابية لالفوسفاتيز القلوية. شريط مقياس 500 ميكرون. (C) والرسم البياني شريط يبين إعادة التعبير عن الجينات تعدد القدرات الذاتية (C-MYC، KLF-4، SOX-2، OCT3 / 4 و NANOG) في كل من iPSCs تم الحصول عليها من أسهم دبي للذهب والمعاطف الشهباء، وذلك باستخدام التحليل QRT-PCR ( ن = 4، طالب اختبار t: * P <0.05، § p <0.005 مقابل PBMNCs المقابلة). (D) QRT-PCR مع الاشعال episomal محددة (EBNA-1) (النسبية للسيطرة الاشعال FBOX15) لا يظهر أي الجينوم التكامل ناقلات episomal. (ن = 4، طالب اختبار t: * P <0.001 مقابل PBMNCs المقابلة ترنسفكأيشن 5 أيام). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التحليل المناعي من خلايا جذعية جنينية علامات تعدد القدرات. المناعي الممثل تلطيخ يظهر التعبير كبيرا من البروتينات تعدد القدرات SSEA-4، TRA-1-60، TRA-1-81، OCT3 / 4 و SOX-2. وcounterstained نوى مع دابي. مقياس شريط 200 ميكرون لالتوجيهية DGS (A) ومعطف التوجيهية بافي (B). شريط مقياس 100 ميكرون لالتوجيهية بافي معطف (A)، IPSC DGS (B قوية>) و (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. بروتوكول للتمايز iPSCs والتعبير عن ثلاثة جينات طبقة الجرثومية في EBS الحصول عليها من iPSCs. (A) تمثيل تخطيطي للبروتوكول الذي يحفز التمايز عفوية من iPSCs من PBMNCs بعد DGS وبافي المعاطف في EBS. تجارب (B) QRT-PCR تظهر التعبير عن كل الجينات طبقة ثلاثة الجرثومية: الأديم الباطن (SOX-7، ا ف ب)، الأديم المتوسط (CD31، ACTA-2، CDH-5، RUNX-1)، والأديم الظاهر (KRT 14، TH، GABRR-2) في EBS بعد 20 يوما من التمايز (ن = 4، طالب اختبار t: * P <0.05 مقابل المقابلة iPSCs نظيره). EBS = الهيئات مضغي./52885/52885fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم تحليل 6. متحد البؤر المجهري للبروتينات القلب والعصبية في EBS في يوم 20 من التمايز التي تم الحصول عليها من PBMNCs بعد DGS والمستمدة المعاطف الشهباء iPSCs. (A) صور الممثل (إسقاط الحد الأقصى لمتحد البؤر صورة كومة) للبروتينات الساركومير القلب α-Actinin وتروبونين I (تينيسي-I) في خلية واحدة فصل ضرب المناطق (مقياس شريط 10 ميكرون) و (B) للعصبون محددة الدرجة علامة III β-تويولين (TUJ1) وهيدروكسيلاز الدوبامين العصبية علامة التيروزين (TH) (مقياس منع 20 ميكرون). وcounterstained نوى مع دابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر منهذا الرقم.
| كتاب تمهيدي | تسلسل | ||
| C-MYC مهاجم | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 " | ||
| C-MYC مراجعة | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 " | ||
| KLF-4 مهاجم | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 " | ||
| KLF-4 مراجعة | 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 " | ||
| SOX-2 مهاجم | 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 " | ||
| SOX-2 مراجعة | 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 مهاجم | 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 " | ||
| OCT3 / 4 دوران المحرك | 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 " | ||
| NANOG مهاجم | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 " | ||
| NANOG مراجعة | 5 &# 8242؛ -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 " | ||
| SOX-7 مهاجم | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 " | ||
| SOX-7 مراجعة | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 " | ||
| AFP مهاجم | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 " | ||
| AFP مراجعة | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 " | ||
| CD31 مهاجم | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 " | ||
| CD31 مراجعة | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 " | ||
| ACTA-2 مهاجم | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 " | ||
| ACTA-2 مراجعة | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 " | ||
| CDH-5 مهاجم | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 " | ||
| CDH-5 مراجعة | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 " | ||
| RUNX-1 مهاجم | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 " | RUNX-1 لفة | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 " |
| KRT-14 مهاجم | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 " | ||
| KRT-14 لفة | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 " | ||
| TH مهاجم | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 " | ||
| مراجعة TH | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 " | ||
| GABBR-2 مهاجم | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 " | ||
| GABBR-2 مراجعة | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 " | ||
| EBNA-1 مهاجم | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 " | ||
| EBNA-1 لفة | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 " | ||
| FBX-15 مهاجم | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 " | ||
| FBX-15 مهاجم | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 " | ||
| GAPDH مهاجم | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 " | ||
| GAPDH مراجعة | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 " |
الجدول 1: قائمة الاشعال QRT-PCR تسلسل التمهيدي المستخدمة لتقييم الذاتية التعبير تعدد القدرات الجينات، التحوير إسكات والتعبير عن ثلاث علامات طبقة الجرثومية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الماضي، والطريقة الوحيدة للحصول على الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يحمل طفرة جينية معينة كان لتجنيد الآباء تمر قبل الزرع التشخيص الوراثي وتوليد خلايا جذعية جنينية من الكيسات الأريمية على التخلص 31،32. باستخدام نهج برمجة، يمكن للباحثين الآن تولد iPSCs من المرضى تحمل أي تقريبا الوراثي. إمكانية يبدأ من خط خلية المريض محددة ومصدر يمكن الوصول إليه بسهولة مهم جدا لأنه يسمح بإجراء تحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات وتحديد لاحق من مناهج علاجية جديدة.
في هذه الدراسة، ونحن الجمع بين نهج البلازميد 15 مع طريقة تطبيقها بالفعل لإنتاج iPSCs من PBMNCs المجمدة سابقا بعد التدرج الكثافة الفصل 22 و iPSCs خالية من الفيروسات ولدت بنجاح من PBMNCs معطف الشهباء المجمدة. استخدام الشهباء المعاطف بدلا من التدرج الكثافة PBMNCs فصل كلالدودة الحلزونية لنا لخفض التكاليف، ووقت العمل والخطوات اليدوية لمشغلي خلال تجهيز العينات. مجموعة المتابعة لبروتوكول منخفضة التكلفة باستخدام PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة ضروري للدراسات مع عدد مرتفع من المشاركين وللمجموعات عينة في دراسات متعددة المراكز. الأهم من ذلك، القدرة على إنتاج iPSCs من المعاطف الشهباء المجمدة يسمح بالوصول إلى العديد من biosamples المجمدة المخزنة بالفعل في بنوك الدم، وذلك باستخدام بسيط، والوقت فعالة من حيث التكلفة وليس ذلك مضيعة للطريقة لجمع العينات.
هذه الطريقة الاستقراء يمكن أن تكون مفيدة لاشتقاق خالية من التكامل iPSCs المريض محددة، حيث تتميز المستعمرات بسبب غياب episomal التحوير بعد سوى عدد قليل من الممرات (≥5 الممرات)، في كل من المواد الأولية. بشكل ملحوظ، لاحظنا أن جميع المستعمرات التوجيهية المحددة التي تم الحصول عليها من كلا النوعين من بدء عرض المواد ميزات تعدد القدرات للمقارنة والحفاظ على التشابه الخلوية والجزيئية لhESCs، إنديكاتينغ اشتقاق التوجيهية ناجح واستنساخ ثابت من البروتوكول.
iPSCs وعلاوة على ذلك، ونحن قد ولدت بنجاح من أكثر من 10 البشرية الليفية الجلد و 3 خطوط الخلايا الوسيطة انسجة القلب (سواء من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين يعانون من أمراض عضلة القلب والهيكل العظمي) باستخدام هذه الطريقة (لا تظهر البيانات)، مما يوحي بأن بروتوكول صفها يمكن استخدامها لإعادة برمجة الناجحة لأنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، واختيار من الدم في بدء المواد هو مفيد مقارنة مع الخلايا الليفية، خاصة عند النظر إلى التوسع واسعة من الخلايا الليفية في المختبر قد يؤثر على كفاءة إعادة برمجة، استنادا إلى عدد وانتشار الخلايا الليفية مرور معدل 33،34. بروتوكول لدينا كما يتيح توليد iPSCs خالية من التحوير من المعاطف الشهباء المجمدة بعد الحد الأدنى من الوقت والثقافة، وبالتالي تقليل بنحو 3-4 أسابيع من الوقت اللازم لاشتقاق iPSCs مقارنة مع مصادر أخرى، مثل فايbroblasts. وعلاوة على ذلك، كشفت الدراسات الحديثة أن iPSCs المشتقة من خلايا الدم عرض التوقيع جينية أن أكثر شبها hESCs من تلك التي تم الحصول عليها من خلايا اللحمة المتوسطة الجذعية (MSC) / الليفية 14،35.
على الرغم من الجيل الناجح لiPSCs من المعاطف الشهباء المجمدة، تحتاج إلى قليل من القيود التي سينظر فيها في هذا البروتوكول. قبل إعادة برمجة التعريفي، يمكن أن التضخيم من PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة تمثل خطوة حاسمة للبروتوكول. نوعية المواد بدءا يمكن أن تؤثر بشدة على اختيار وعزل PBMNCs، من أجل تحقيق أرقام الخلية كافية لإجراء إعادة برمجة (لا يقل عن 2 × 10 6 خلايا ل electroporation). هذا يرجع في معظمه إلى التباين البيولوجي لا يتجزأ من العينات، ولكن أيضا إلى المسائل التقنية هذه. في الواقع، والتضخيم من PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة أقل كفاءة مقارنة PBMNCs تم الحصول عليها من الفصل كثافة التدرج، وذلك بسبب دي قويةاالعتماد على تقلب المشغل اليدوي. من أجل تعزيز استنساخ وكفاءة PBMNC التضخيم من المعاطف الشهباء المجمدة دون انفصال الكثافة التدرج، فمن المستحسن استخدام النظم الآلية بقوة لجمع الكسور معطف بافي. على الرغم من أنها أكثر صعوبة لتوسيع عدد كاف من PBMNCs من الشهباء المعاطف من PBMNCs بعد كثافة الفصل التدرج، وكفاءة إعادة برمجة (حوالي 0،001-،0005٪) من اثنين من المواد الأولية غير قابلة للمقارنة، وفقا لكفاءة إعادة برمجة الدم ذكرت سابقا 14، 23. منذ كفاءة إعادة برمجة منخفضة لأغراض الطب التجديدي، واستخدام تحسين EBNA1 / OriP (من فيروس ابشتاين بار، EBV) ناقلات episomal قد يزيد من عدد من المستعمرات التوجيهية للخلية في المستقبل تطوير العلاج 22،36. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام طبقة المغذية MEF لتوليد التوجيهية والصيانة في بروتوكول لدينا. من أجل الحصول على iPSCs السريرية الصف، يمكن لثقافة خالية من تغذية تكون العبوة البديلةطريقة rnative لمزيد من الدراسات.
في الختام، هذا البروتوكول يمثل طريقة صحيحة لتوليد iPSCs من مصدر خلية المريض يمكن الوصول إليها بسهولة مع ميزة كبيرة من استخدام نظام غير متكامل التي يمكن ان تستخدم لاشتقاق iPSCs السريرية الصف، ليس فقط لنمذجة المرض ولكن أيضا دواء مستقبل شخصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
