Summary

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Abstract

Somatik hücreler, dört transkripsiyon faktörlerinin (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve c-myc) ekspresyonunu zorlayarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) içine yeniden olabilir, tipik olarak insan embriyonik kök hücreleri tarafından (hESC) olarak ifade . Nedeniyle hESC ile benzerliği, iPSCs hESC ile ilgili etik sorunlar kaçınarak, olası hastaya özgü rejeneratif tıp için önemli bir araç haline gelmiştir. Klinik uygulamalar için, uygun hücreler elde etmek için, transgen içermeyen iPSCs transgen reaktivasyonu, değiştirilmiş gen ekspresyonunu ve yanlış farklılaşmasını önlemek için söz konusu olacaktır. Ayrıca, yüksek ölçüde verimli ve pahalı olmayan bir yeniden programlama yöntemi, terapötik amaçlar için yeterli iPSCs elde etmek gereklidir. Bu ihtiyacı göz önüne alındığında, etkin bir sivil entegre episomal plazmid yaklaşımı iPSC türetme tercih seçimdir. Şu anda yeniden programlama amaçlı kullanılan en yaygın hücre tipi fibroblastlar vardır, izolasyon hangi bir i doku biyopsisi gerektirirhasta için nvasive cerrahi prosedür. Bu nedenle, insan periferik kan iPSC nesil için en erişilebilir ve en az invaziv doku temsil eder.

Bu çalışmada, bütünleşmeyen epizomal plasmidleri kullanılarak uygun maliyetli ve viral içermeyen protokolü tam kan, santrifüj işleminden sonra ve yoğunluk dereceli ayırma olmadan dondurulmuştur buffy kat elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) için iPSCs üretilmesi için rapor edilir.

Introduction

2006 yılında, Shinya Yamanaka 1 grubu, yetişkin farelerde ve insanlarda somatik hücreler, dört yeniden programlama faktörleri (Ekim-4, Sox-2, Klf-4 ve ektopik ekspresyonu ile pluripotent haline dönüştürülebilir ilk defa burada gösterilmektedir c-myc), sözde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) 2 üretilmesi. Hastaya özgü iPSCs yakından morfoloji, çoğalması ve üç germ hücre tipleri (mezoderm, endoderm ve ektoderm) içine ayırt etmek için yeteneği bakımından insan embriyonik kök hücreleri (hESC) benzer hESC ve baypas kullanımına bağlı etik kaygıları eksik ise olası bağışıklık reddi 3. Böylece, iPSCs temel araştırma, ilaç tarama, hastalık modelleme, toksisite değerlendirilmesi ve rejeneratif tıp amaçlı 4 hasta-spesifik hücrelerin en önemli kaynaklarından biri olarak görünür.

Çeşitli yaklaşımlar iPSC üretimi için kullanılmıştır: Viral entegre vektörler(Retrovirüs 5, lentivirüs 6), viral olmayan entegre vektörleri (adenovirüs 7), Sendai-virüs 8, BAC transposonlar 9, epizomal vektörleri 10, proteinler 11 veya RNA teslim 12. Virüs aracılı yöntemleri kullanımı yüksek verimlilik yeniden programlama neden olabilir, ancak, viral vektörler, konak hücreler ve bu nedenle, potansiyel rastgele girmeyle mutagenez genomu içine entegre, farklılaşması sırasında gen ekspresyonu ve susturulması transgenlerin yeniden aktive kalıcı değişiklik 13 göz ardı edilemez.

Rejeneratif tıp iPSCs daha güvenli hale getirmek için, çaba hücre genomlarına ekzojen DNA'nın entegrasyonu olmadan iPSCs elde etmek için yapılmıştır. Vergiye tabi viral vektörler ve transposonlar geliştirilmiş olmasına rağmen, bu kaçınılmaz olarak kesilip çıkarılmasından sonra dönüştürülmüş hücreler kalır ve ifade transposaz kısa vektör sekansları, hücre içinde değişikliğe sebep olup olmadığı hala belirsizular 13 işlev. Yüksek yeniden programlama verimliliği rağmen, Sendai virüsü translasyonel çalışmalarda uygulanmasını sınırlamak potansiyeline sahip bu sistem geliştirdi şirket ile pahalı bir yaklaşım ve ulaşmak geçiş lisans kaygıları temsil etmektedir. Ayrıca, protein ve RNA doğrudan sokulması için bir ihtiyaç bu getirmektedir içsel teknik sınırlamalar molekülleri yeniden programlanması birden fazla teslimat gerektirir ve genel olarak yeniden programlama verimi 14 çok düşüktür. Dikkat çekici bir şekilde, epizomal plasmidlerin kullanımı göre düşük maliyetli bir viral ve serbest olmayan entegre yöntem başarılı bir şekilde deri fibroblastları 15 yeniden programlama için rapor edilmiştir. Daha önce 10,15 bildirdiği gibi Özellikle, mevcut çalışmada biz, ticari mevcut entegrasyon serbest episomal plasmidlerini kullanmaya karar verdi.

Bugüne kadar, cilt fibroblastlar en popüler donör hücre tipi 5 temsil etmektedir. Bununla birlikte, diğer hücre kaynakları başarı olmuştursfully keratinositler 16, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin 17, adipoz stromal hücreler 18 olmak üzere iPSCs içine yeniden programlanması, saç folikülleri 19 ve dental pulpa hücreleri 20. Bu hücrelerin izolasyonu cerrahi prosedürler gerektiren ve birkaç hafta birincil hücre kültürünün oluşturulması için in vitro hücre genişlemesi için ihtiyaç vardır.

Bu ışığında, hücre tipi başlangıç ​​seçimi kritiktir ve kan gibi kolay erişilebilir ve daha az invazif dokulardan iPSCs üretebilmek için aynı derecede önemlidir. Her iki kordon kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMNCs) 21,22 ve periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) 14,22-24 iPSCs türetilmesi için hücrelerin uygun bir kaynağıdır.

Yetişkin PBMNC yeniden programlama verimliliği CBMNCs 22 daha 20-50 kat daha düşüktür rağmen, örnekleme amacıyla en uygun hücre tipi kalır. IçindeAslında, PBMNC numune minimal invaziv olma avantajına sahiptir, ve buna ek olarak, bu hücrelerin yeniden programlama deneyleri daha önce in vitro olarak geniş bir genişleme gerekli değildir. Bugüne kadar, farklı protokoller yoğunluk gradyan ayrıldıktan sonra PBMNCs dondurulup çözülmüş gün birkaç aya kadar dondurma sonra iPSCs 22,23 içine yeniden programlama birkaç gün önce genişletilebilir bildirmiştir. Bununla birlikte, kadarıyla biz hiçbir rapor dondurulmuş buffy kat gelen PBMNCs yeniden programlamayı tarif var farkında olarak. Önemlisi, yoğunluk gradyan ayırımı olmaksızın toplanan dondurulmuş buffy mantolar böylece daha örnek toplama önler iPSC üretimi için malzeme kolay ulaşılabilir bir havuz temsil nüfus çalışmalardan elde büyük ölçekli biyobankalar saklanan en sık kan örnekleri temsil etmektedir.

Burada biz, daha önce tanımlanmış olan protokole göre 22 insan dondurulmuş buffy kat ilk defa virüs içermeyen iPSCs üretilmesini rapor etmektedir. IçindeAyrıca, iPSCs olmayan yoğunluk gradyanı saflaştınldı PBMNC sonuçlar için bir kontrol protokolü olarak, yoğunluk gradyanı ayrıldıktan sonra elde edilen dondurulmuş PBMNCs elde edildi.

Protocol

Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) sonra bilgilendirilmiş onam ve Güney Tirol Eyaleti Etik Kurul onayı imzalı sağlıklı donörlerin insan periferik kan örneklerinden izole edilmiştir. Deneyler Helsinki Bildirgesi ifade esaslar doğrultusunda yapılmıştır. Tüm veriler toplanmış ve anonim analiz edildi. Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMNCs) PBMNCs yoğunluk gradyan separasyonu olmaksızın, tam kan, santrifüj işleminden sonra i…

Representative Results

Bu çalışmada, tam kan merkezkaç ve yoğunluk dereceli ayırma bildirilir sonra elde edilen PBMNCs resetleme ile karşılaştırıldığında sonra dondurulmuş buffy kat izole PBMNCs resetleme viral içermeyen iPSCs üretilmesi için basit ve etkin bir protokol. Şekil 1A şematik bir temsilini göstermektedir ayrıntılı bir protokol. Çözündükten sonra, tipik bir yuvarlak şeklini gösteren izole PBMNCs, 14 gün süre ile belirli bir kan kültür ortamı (Şekil 1B) yayılır …

Discussion

Geçmişte, tek yolu, belirli bir genetik mutasyon taşıyan insan pluripotent kök hücreleri elde etmek için pre-implantasyon genetik tanı geçiren anne işe ve onların atılır blastosist 31,32 embriyonik kök hücreleri oluşturmak oldu. Bir yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar şimdi hemen hemen her genotipi taşıyan hastaların iPSCs üretebilirsiniz. olasılık hastaya özgü hücre hattından başlamak ve hastalıkların patofizyolojisi ve yeni terapötik yaklaşımların…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube Terumo VF-054SBCS07
Ammodium chloride Sigma-Aldrich A9434
Potassium bicarbonate Sigma-Aldrich 60339
EDTA disodium powder Sigma-Aldrich E5134 0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium  GE Healthcare Life Sciences 17-5442-02 Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)  Gibco 21056-023 No phenol red
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) Gibco 51500-056  1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031 1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 300-07 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) PeproTech 200-03 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) PeproTech 100-11 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) R&D Systems  287-TC-500 2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D2915 1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin R&D Systems  2914-HT 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II Gibco 11269016 Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1 StemCell Technologies 5850 Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM Gibco 10829-018
Knockout Serum Replacement Gibco 10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140-050
2-Mercaptoethanol  Gibco 31350-010 0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate Sigma-Aldrich B5887 0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa  R&D Systems  4114-TC 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503  10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum Hyclone SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution Merck-Millipore ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD Biosciences 354230
Collagenase, Type IV Gibco 17104-019 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007 Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) Global Stem GSC-6201G 1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F Addgene  27077 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK Addgene  27078 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL Addgene  27080 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP Addgene  27082 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit Stemgent 00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody Merck-Millipore MAB4304 1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody Merck-Millipore MAB4360 1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody Merck-Millipore MAB4381 1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-9081 1/500
Anti-Nanog Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-33759 1/500
Anti-Troponin I Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15368 1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody Sigma-Aldrich A7732 1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody Covance Research Products Inc  MMS-435P-100 1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Calbiochem 657012 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse  Molecular Probes A-11029 1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit Molecular Probes A-21429 1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate Corning 3471
Trizol Reagent Ambion 15596-018  reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754050 Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 185-5195
Experion Automated Electrophoresis System Bio-Rad 700-7000 Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit Bio-Rad 7007105 Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) Zeiss 495007
NeonTransfection System 100 µL Kit Invitrogen MPK10025 Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000 Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells–from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Play Video

Cite This Article
Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas, A. A., Schwienbacher, C., Silipigni, R., Di Segni, M., Chen, H. V., Pramstaller, P. P., Hicks, A. A., Rossini, A. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids. J. Vis. Exp. (100), e52885, doi:10.3791/52885 (2015).

View Video