गैर समेकित करने Episomal प्लास्मिड का उपयोग करते हुए जमे हुए बफी कोट से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
Summary
प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) नैदानिक अनुप्रयोगों और बुनियादी अनुसंधान के लिए रोगी विशेष के ऊतकों का एक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ, हम गैर समेकित करने episomal प्लास्मिड का उपयोग कर वायरल से मुक्त IPSCs में जमे हुए Buffy कोट से प्राप्त मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) reprogram करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Abstract
दैहिक कोशिकाओं चार प्रतिलेखन कारक (अक्टूबर-4, सॉक्स -2, KLF-4, और सी-Myc) की अभिव्यक्ति के लिए मजबूर द्वारा प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) में reprogrammed किया जा सकता है, आम तौर पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से (hESCs) व्यक्त । कारण hESCs के साथ उनकी समानता के लिए, IPSCs hESCs के साथ जुड़े नैतिक मुद्दों से परहेज संभावित रोगी-विशिष्ट पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं। नैदानिक आवेदन के लिए उपयुक्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, transgene मुक्त IPSCs transgene पुनर्सक्रियन, बदल जीन अभिव्यक्ति और पथभ्रष्ट भेदभाव से बचने के लिए उत्पन्न होने की जरूरत है। इसके अलावा, एक अत्यंत कुशल और सस्ती reprogramming के विधि चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए पर्याप्त IPSCs प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इस जरूरत को देखते हुए, एक कुशल गैर समेकित करने episomal प्लाज्मिड दृष्टिकोण IPSC व्युत्पत्ति के लिए बेहतर विकल्प है। वर्तमान में reprogramming के उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल सबसे आम प्रकार की कोशिका fibroblasts हैं, अलगाव, जिनमें से एक मैं ऊतक बायोप्सी की आवश्यकता है,रोगी के लिए nvasive शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया। इसलिए, मानव परिधीय रक्त IPSC पीढ़ी के लिए सबसे सुलभ और कम से कम इनवेसिव ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है।
इस अध्ययन में, गैर समेकित करने episomal प्लास्मिड का उपयोग कर एक लागत प्रभावी और वायरल से मुक्त प्रोटोकॉल पूरे रक्त बाद centrifugation और घनत्व ढाल जुदाई के बिना जमे हुए Buffy कोट से प्राप्त मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) से IPSCs की पीढ़ी के लिए सूचना दी है।
Introduction
2006 में, Shinya यामानाका 1 के समूह वयस्क चूहों और इंसानों से दैहिक कोशिकाओं चार reprogramming के कारकों (अक्टूबर-4, सॉक्स -2, KLF-4, और अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा एक pluripotent राज्य में परिवर्तित किया जा सकता है कि पहली बार के लिए प्रदर्शन सी-Myc), तथाकथित प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) 2 सृजन। रोगी-विशिष्ट IPSCs बारीकी आकृति विज्ञान, प्रसार और तीन-जनन कोशिका प्रकार (mesoderm, अन्तर्जनस्तर और बाहरी झिल्ली) में अंतर करने की क्षमता के संदर्भ में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) सदृश hESCs और दरकिनार के उपयोग से जुड़े नैतिक चिंताओं की कमी है, जबकि संभव प्रतिरक्षा अस्वीकृति 3। इस प्रकार, IPSCs बुनियादी अनुसंधान, दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग, विषाक्तता का मूल्यांकन, और पुनर्योजी चिकित्सा प्रयोजनों के लिए 4 रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं के सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों में से एक के रूप में दिखाई देते हैं।
कई दृष्टिकोण IPSC पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया है: वायरल को एकीकृत वैक्टर(रेट्रोवायरस 5, lentivirus 6), वायरल गैर समेकित करने वैक्टर (adenovirus 7), सेंडाइ वायरस 8, बीएसी transposons 9, episomal वैक्टर 10, प्रोटीन 11 या आरएनए वितरण 12। वायरस की मध्यस्थता तरीकों का उपयोग उच्च दक्षता reprogramming के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वायरल वैक्टर मेजबान कोशिकाओं और इसलिए संभावित यादृच्छिक insertional उत्परिवर्तजनन के जीनोम में एकीकृत, भेदभाव के दौरान जीन अभिव्यक्ति, और खामोश transgenes की पुनर्सक्रियन की स्थायी परिवर्तन 13 से बहिष्कृत नहीं किया जा सकता।
पुनर्योजी चिकित्सा के लिए IPSCs सुरक्षित बनाने के लिए, प्रयास सेलुलर जीनोम में बहिर्जात डीएनए के एकीकरण के बिना IPSCs प्राप्त करने के लिए बनाया गया है। उत्पाद शुल्क योग्य वायरल वैक्टर और transposons विकसित किया गया है, यद्यपि यह अनिवार्य रूप से छांटना के बाद transduced कोशिकाओं में रहते हैं, और अभिव्यक्ति transposase जो कम वेक्टर दृश्यों, सेल में परिवर्तन उत्पन्न कर सकता है कि क्या अभी भी स्पष्ट नहीं हैular 13 कार्य करते हैं। इसकी उच्च reprogramming दक्षता के बावजूद, सेंडाइ वायरस translational अध्ययन में अपने आवेदन को सीमित करने की क्षमता है इस प्रणाली विकसित की है कि कंपनी के साथ एक महंगी दृष्टिकोण और पहुंच के माध्यम से लाइसेंस की चिंताओं का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, प्रोटीन और शाही सेना के प्रत्यक्ष परिचय के लिए की जरूरत है इस का परिचय निहित तकनीकी सीमाओं के साथ अणुओं reprogramming के कई डिलीवरी की आवश्यकता है, और समग्र reprogramming दक्षता 14 बहुत कम है। ध्यान से, episomal प्लास्मिड के उपयोग पर आधारित लागत प्रभावी वायरल स्वतंत्र और गैर समेकित करने के तरीकों को सफलतापूर्वक त्वचा fibroblasts के 15 के reprogramming के लिए सूचित किया गया है। पहले से 10,15 रिपोर्ट के रूप में विशेष रूप से, वर्तमान कार्य में हम वाणिज्यिक उपलब्ध एकीकरण मुक्त episomal प्लास्मिड का उपयोग करने का फैसला किया।
तिथि करने के लिए, त्वचा fibroblasts के सबसे लोकप्रिय दाता सेल प्रकार 5 का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अन्य सेल के सूत्रों के उत्तराधिकारी किया गया हैsfully केरेटिनकोशिकाओं 16, अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम सेल 17, वसा stromal कोशिकाओं 18 सहित IPSCs में reprogrammed, हेयर 19 के रोम, और दंत लुगदी कोशिकाओं 20। इन कोशिकाओं के अलगाव शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है, और कई हफ्तों के एक प्राथमिक सेल संस्कृति की स्थापना के क्रम में इन विट्रो सेल विस्तार के लिए आवश्यक हैं।
इस रोशनी में, सेल प्रकार शुरू करने के चयन के लिए महत्वपूर्ण है और यह इस तरह के खून के रूप में आसानी से सुलभ और कम आक्रामक ऊतकों से IPSCs उत्पादन करने में सक्षम होने के लिए भी उतना ही महत्वपूर्ण है। दोनों गर्भनाल रक्त कोशिकाओं mononuclear (CBMNCs) 21,22 और परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) 14,22-24 IPSCs की व्युत्पत्ति के लिए कोशिकाओं के उपयुक्त स्रोतों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
वयस्क PBMNC reprogramming की दक्षता CBMNCs 22 की तुलना में 20-50 गुना कम है, वे नमूना उद्देश्य के लिए सबसे सुविधाजनक सेल प्रकार रहते हैं। मेंतथ्य यह है, PBMNC नमूना न्यूनतम आक्रामक होने का लाभ है, और इसके अलावा, इन कोशिकाओं reprogramming के प्रयोगों से पहले इन विट्रो में व्यापक विस्तार की आवश्यकता नहीं है। तिथि करने के लिए, अलग प्रोटोकॉल घनत्व ढाल जुदाई के बाद PBMNCs जमे हुए हैं और thawed दिनों कई महीनों के बाद ठंड और IPSCs 22,23 में reprogramming से पहले कुछ दिनों के लिए विस्तारित किया जा सकता है कि सूचना दी है। फिर भी, जहाँ तक हम कोई रिपोर्ट नहीं जमी Buffy कोट से PBMNCs के reprogramming का वर्णन किया है के बारे में पता कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, घनत्व ढाल जुदाई के बिना एकत्र जमी बफी कोट इस प्रकार आगे नमूना संग्रह से बचा जाता है कि IPSC उत्पादन के लिए सामग्री की एक आसानी से सुलभ पूल का प्रतिनिधित्व करने, जनसंख्या अध्ययन से बड़े पैमाने पर biobanks में संग्रहीत सबसे आम रक्त के नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
इस के साथ साथ हम एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 22 के आधार पर, मानव जमी Buffy कोट से पहली बार के लिए वायरल से मुक्त IPSCs की पीढ़ी की रिपोर्ट। मेंइसके अलावा, IPSCs गैर घनत्व ढाल शुद्ध PBMNC परिणामों के लिए एक नियंत्रण प्रोटोकॉल के रूप में, घनत्व ढाल जुदाई के बाद प्राप्त जमी PBMNCs से उत्पन्न किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
अतीत में, एक ही तरीका है एक विशेष आनुवांशिक उत्परिवर्तन ले मानव स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए पूर्व आरोपण आनुवंशिक निदान के दौर से गुजर माता-पिता की भर्ती और उनके त्याग blastocysts 31,32 से भ्रूण स्टेम कोशिका…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.
Materials
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
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