Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) representerer en kilde til pasientspesifikke vev for kliniske applikasjoner og grunnforskning. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å omprogrammere humane perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) fra fryste buffy coats inn virusfritt iPSCs med ikke-integrerende episomale plasmider.
Somatiske celler kan omprogrammeres til indusert pluripotente stamceller (iPSCs) ved å tvinge ekspresjon av fire transkripsjonsfaktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, og c-myc), vanligvis uttrykt av humane embryonale stamceller (hESCs) . På grunn av deres likhet med hESCs har iPSCs blitt et viktig redskap for potensiell pasient-spesifikke regenerativ medisin, unngå etiske problemstillinger knyttet til hESCs. For å oppnå celler som er egnet for klinisk anvendelse, transgene fritt iPSCs må genereres for å unngå transgenet reaktive, forandret genekspresjon og villedet differensiering. Videre er en svært effektiv og billig metode for omprogrammering er nødvendig for å utlede tilstrekkelig iPSCs for terapeutiske formål. Gitt dette behovet, er en effektiv ikke-integrere episomal plasmid tilnærming til å foretrekke valg for IPSC avledning. Dag den vanligste celletype som brukes til reprogrammerings formål er fibroblaster, isolering av noe som krever vevsbiopsi, en Invasive kirurgisk prosedyre for pasienten. Derfor representerer human perifer blod den mest tilgjengelige og minst invasiv vev for IPSC generasjon.
I denne studien er en kostnadseffektiv og virusfritt protokoll ved bruk av ikke-integrerende episomale plasmider rapportert for generering av iPSCs fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) oppnådd fra frosne buffy coats etter sentrifugering av fullblod og uten densitetsgradient separasjon.
I 2006, gruppen av Shinya Yamanaka en demonstrert for første gang at somatiske celler fra voksne mus og mennesker kan konverteres til en pluripotent tilstand ved ektopisk uttrykk for fire omprogrammering faktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, og c-Myc), genererer de såkalte Induced Pluripotent stamceller (iPSCs) 2. Pasientspesifikke iPSCs ligner menneskelige embryonale stamceller (hESCs) tett i form av morfologi, spredning og evne til å differensiere i hvilke typer tre-bakterie celle (mesoderm, endoderm og ektoderm) mens mangler etiske bekymringer knyttet til bruk av hESCs og forbi mulig immunawisning tre. Dermed iPSCs fremstå som en av de viktigste kildene til pasientspesifikke celler for grunnforskning, narkotika screening, sykdom modellering, vurdering av toksisitet, og regenerativ medisin formål 4.
Flere tilnærminger har vært brukt i IPSC generasjon: virale integrere vektorer(Retrovirus 5, lentivirus 6), viral ikke-integrere vektorer (adenovirus 7), Sendai-virus 8 BAC transposoner 9, episomale vektorer 10, proteiner 11 eller RNA levering 12. Selv om bruken av virus-mediert metoder kan føre til høy effektivitet omprogrammering, virale vektorer som integreres i genomet til vertsceller og dermed potensialet tilfeldig insertional mutagenese, kan permanent endring av genekspresjon, og reaktivering av dempede transgener under differensiering ikke utelukkes 13.
For å gjøre iPSCs tryggere for regenerativ medisin, har man forsøkt å utlede iPSCs uten integrering av eksogent DNA i celle genomer. Selv excisable virale vektorer og transposoner har blitt utviklet, er det fortsatt uklart om korte vektorsekvenser, som uunngåelig forblir i transduserte celler etter fjerning, og transposase uttrykk, kan indusere endringer i celleular fungere 13. Til tross for sin høye omprogrammering effektivitet, representerer Sendai virus en kostbar tilnærming og nå gjennom lisensiering bekymringer med selskapet som utviklet dette systemet har potensial til å begrense sin søknad i translasjonsforskning studier. Videre er behovet for direkte innføring av proteiner og RNA krever flere levering av omprogrammering molekyler med de iboende tekniske begrensninger Dette innfører, og samlet omprogrammering effektivitet er meget lav 14. Av notatet, har kostnadseffektive virusfrie og ikke-integrere metoder basert på bruk av episomale plasmider blitt rapportert for omprogrammering av hudfibroblaster 15. Spesielt i dette arbeidet har vi besluttet å bruke kommersielt tilgjengelige integreringsfritt episomale plasmider, som tidligere rapportert 10,15.
Til dags dato, hudfibroblaster representerer den mest populære donor celletype 5. Imidlertid har andre cellekilder vært takkonstruksjonensfully omprogrammeres til iPSCs inkludert keratinocytter 16, benmarg stamceller 17, adipose stromaceller 18, hårsekker 19, og tannpulpa celler 20. Isoleringen av disse cellene krever kirurgiske prosedyrer, og flere uker er nødvendig for in vitro celle-ekspansjon for å etablere en primær cellekultur.
I lys av dette, er utvalget av starter celletype kritisk og det er like viktig å kunne produsere iPSCs fra lett tilgjengelige og mindre invasive vev som blod. Begge ledningen blod mononukleære celler (CBMNCs 21,22) og perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) 14,22-24 representerer egnede kilder til celler for avledning av iPSCs.
Selv om effektiviteten av voksen PBMNC omprogrammering er 20 til 50 ganger lavere enn for CBMNCs 22, de forblir den mest praktiske celletypen for prøvetaking formål. IFaktisk har PBMNC sampling fordelen av å være minimalt invasiv, og i tillegg har disse cellene ikke kreve omfattende utvidelse in vitro før omprogrammering eksperimenter. Hittil har forskjellige protokoller rapportert at PBMNCs etter tettshetsgradient separasjon kan fryses og tines dager til flere måneder etter frysing og utvidet for noen dager før omprogrammering inn iPSCs 22,23. Likevel, så langt vi kjenner ingen rapporter har beskrevet omprogrammering av PBMNCs fra frosne buffy strøk. Viktigere, frosne buffy strøk samles uten tettshetsgradient separasjon representerer de mest vanlige blodprøver som er lagret i stor skala biobanker fra befolkningsstudier, og representerer således en lett tilgjengelig pool av materiale for IPSC produksjon som unngår ytterligere prøvetaking.
Heri rapporterer vi for første gang generering av virusfrie iPSCs fra humane frosne buffy coats, basert på en tidligere beskrevet protokoll 22. IDessuten ble iPSCs generert fra frosne PBMNCs oppnådd etter tetthetsgradient separasjon, som en kontrollprotokoll for de ikke-tetthetsgradient rensede PBMNC resultater.
I det siste, den eneste måten å få menneskelige pluripotente stamceller som bærer en bestemt genetisk mutasjon var å rekruttere foreldre som gjennomgår pre-implantasjon genetisk diagnose og generere embryonale stamceller fra sine kasserte blastocysts 31,32. Ved hjelp av en omprogrammering tilnærming, kan forskerne nå generere iPSCs fra pasienter som frakter nesten enhver genotype. Muligheten for å starte fra en pasient-spesifikk cellelinje og en lett tilgjengelig kilde er meget viktig da den tillater…
The authors have nothing to disclose.
The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
NeonTransfection System 100 µL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |