Summary

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمثل مصدرا للأنسجة المريض محددة للتطبيقات السريرية والبحوث الأساسية. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لإعادة برمجة الخلايا البشرية الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة في iPSCs مجانا الفيروسية باستخدام غير دمج-البلازميدات episomal.

Abstract

الخلايا الجسدية يمكن برمجتها إلى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) عن طريق إجبار التعبير عن أربعة عوامل النسخ (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، ج. Myc على)، عن عادة عن طريق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) . نظرا لتشابهها مع hESCs، أصبحت iPSCs أداة هامة لالمحتملين الطب المريض محددة على التجدد، وتجنب القضايا الأخلاقية المرتبطة hESCs. من أجل الحصول على خلايا مناسبة لتطبيق السريرية، تحتاج iPSCs خالية من التحوير أن تتولد لتجنب تنشيط التحوير، تغير التعبير الجيني والتمايز المضلل. وعلاوة على ذلك، وهي طريقة ذات كفاءة عالية وغير مكلفة برمجة ضروري لاشتقاق iPSCs كافية لأغراض علاجية. ونظرا لهذه الحاجة، وهو نهج عدم دمج episomal البلازميد الكفاءة هو الخيار الأفضل لالتوجيهية الاشتقاق. حاليا نوع من الخلايا الأكثر شيوعا تستخدم لأغراض إعادة برمجة الخلايا الليفية و، وعزل الأمر الذي يتطلب أخذ عينة الأنسجة، وأناإجراء العمليات الجراحية nvasive للمريض. وبالتالي، يمثل الدم المحيطي البشري الأنسجة التي يمكن الوصول إليها والأقل الغازية لتوليد التوجيهية.

في هذه الدراسة، وتفيد التقارير بروتوكول مجانا الفيروسية فعالة من حيث التكلفة واستخدام غير دمج-البلازميدات episomal لتوليد iPSCs من خلايا الإنسان الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة بعد الطرد المركزي كله دم وبدون كثافة الفصل الانحدار.

Introduction

في عام 2006، وشينيا ياماناكا مجموعة من 1 أثبتت لأول مرة أن الخلايا الجسدية من الفئران والبشر البالغين يمكن تحويلها إلى دولة المحفزة التي كتبها التعبير خارج الرحم من أربعة عوامل إعادة برمجة (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، و ج. Myc على)، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) 2. iPSCs المريض محددة تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) من حيث التشكل والانتشار والقدرة على التمايز إلى أنواع الخلايا الجرثومية الثلاث (الأديم المتوسط، الأديم والأديم الظاهر)، في حين تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية المرتبطة باستخدام hESCs وتجاوز من الممكن الرفض المناعي 3. وبالتالي، iPSCs تبدو وكأنها واحدة من أهم مصادر خلايا المريض محددة للبحوث الأساسية، وفحص المخدرات، والنمذجة المرض، وتقييم سمية، وأغراض الطب التجديدي 4.

وقد استخدمت عدة طرق لتوليد التوجيهية: ناقلات دمج الفيروسية(الارتجاعي الفيروسة البطيئة 6)، الفيروسي عدم دمج نواقل (اتش 7)، سينداي الفيروسات 8 والترانسبوزونات BAC 9 ناقلات episomal 10، 11 البروتينات أو تسليم RNA 12. على الرغم من أن استخدام وسائل بوساطة الفيروس يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع كفاءة برمجة، ناقلات فيروسية على الاندماج في جينوم الخلية المصابة، وبالتالي المحتملة الطفرات إقحامي عشوائية، تغيير دائم في التعبير الجيني، وتنشيط الجينات المحورة إسكات خلال التمايز لا يمكن استبعاد 13.

لجعل iPSCs أكثر أمانا للطب التجديدي، بذلت جهود لاستخلاص iPSCs دون دمج الحمض النووي الخارجية في الجينوم الخلوي. على الرغم من النواقل والترانسبوزونات الفيروسية خاضع للضريبة وضعت، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان تسلسل ناقلات القصيرة، التي لا تزال حتما في الخلايا transduced بعد الختان، وtransposase التعبير، يمكن أن يفضي التغيير في الخليةجزيئية يعمل 13. على الرغم من ارتفاع كفاءة إعادة برمجة لها، ويمثل فيروس سينداي نهج مكلفة والوصول من خلال المخاوف الترخيص مع الشركة التي طورت هذا النظام لديها القدرة على الحد من تطبيقه في الدراسات متعدية. وعلاوة على ذلك، فإن الحاجة إلى إدخال المباشر من البروتينات والحمض النووي الريبي يتطلب تسليم متعددة من إعادة برمجة الجزيئات مع القيود التقنية المتأصلة هذا يدخل، وكفاءة إعادة برمجة الشاملة منخفضة جدا (14). من المذكرة، تم الإبلاغ عن أساليب الحرة الفيروسية وعدم دمج فعالة من حيث التكلفة على أساس استخدام البلازميدات episomal بنجاح لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد 15. على وجه التحديد، في العمل الحالي قررنا استخدام التجارية المتاحة البلازميدات episomal خالية من التكامل، كما ذكرت سابقا 10،15.

حتى الآن، الخلايا الليفية الجلدية تمثل الأكثر شعبية نوع من الخلايا المانحة 5. ومع ذلك، فإن مصادر أخرى من الخلايا نجاح للبرمجتها sfully إلى iPSCs بما في ذلك الخلايا الكيراتينية 16، نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة 17، خلايا انسجة الدهنية 18، 19 بصيلات الشعر، وخلايا لب الأسنان 20. عزل هذه الخلايا تتطلب عمليات جراحية، وهناك حاجة لعدة أسابيع لفي المختبر توسيع الخلية من أجل تأسيس ثقافة الخلية الأولية.

في ضوء ذلك، واختيار لبدء نوع من الخلايا أمر بالغ الأهمية، وأنه من المهم أيضا أن تكون قادرة على إنتاج iPSCs من الأنسجة يمكن الوصول إليها بسهولة وأقل الغازية مثل الدم. كل من الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMNCs) 21،22 والطرفية وحيدة النواة خلايا الدم (PBMNCs) 14،22-24 تمثل المصادر المناسبة من الخلايا للاشتقاق iPSCs.

على الرغم من أن كفاءة الكبار PBMNC إعادة برمجة أقل 20-50 مرات من تلك التي من CBMNCs 22، إلا أنها تظل نوع من الخلايا الأكثر ملاءمة لغرض أخذ العينات. فيالواقع، PBMNC أخذ العينات لديها ميزة كونها الغازية الحد الأدنى، وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الخلايا لا تتطلب توسيع نطاق واسع في المختبر قبل إعادة برمجة التجارب. حتى الآن، وأفادت البروتوكولات المختلفة التي PBMNCs بعد الانفصال كثافة التدرج يمكن تجميد وإذابة أيام إلى عدة أشهر بعد تجميد وتوسيع نطاقها لبضعة أيام قبل إعادة برمجة إلى iPSCs 22،23. ومع ذلك، بقدر ما نحن ندرك ووصف أي تقارير عن إعادة برمجة PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة. الأهم من ذلك، المعاطف الشهباء المجمدة التي تم جمعها من دون فصل كثافة التدرج تمثل عينات الدم الأكثر شيوعا المخزنة في المصارف البيولوجية على نطاق واسع من الدراسات السكانية، مما يمثل حمام سباحة يمكن الوصول إليه بسهولة من المواد اللازمة لإنتاج التوجيهية أن يتجنب المزيد من جمع العينات.

هنا نقدم تقريرا للمرة الأولى توليد iPSCs مجانا الفيروسية من الإنسان المعاطف الشهباء المجمدة، استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا (22). فيبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء iPSCs من PBMNCs المجمدة التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج، وبروتوكول التحكم في نتائج PBMNC غير الكثافة التدرج تنقيته.

Protocol

تم عزل الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMNCs) من الإنسان عينات الدم الطرفية من المتبرعين الأصحاء بعد أن وقعت الموافقة المستنيرة وموافقة اللجنة الأخلاقية لمقاطعة جنوب التيرول. وأجريت التجارب وفقا للمبادئ الواردة في إعلان هلسنكي. وجميع البيانات جمعها وتحليلها م…

Representative Results

في هذه الدراسة بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs مجانا الفيروسية عن طريق إعادة برمجة PBMNCs معزولة عن المجمدة المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم الكامل والمقارنة مع إعادة برمجة PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الإبلاغ عن فصل التدرج الكثافة. ويبين الشكل 1A تمثيل …

Discussion

في الماضي، والطريقة الوحيدة للحصول على الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يحمل طفرة جينية معينة كان لتجنيد الآباء تمر قبل الزرع التشخيص الوراثي وتوليد خلايا جذعية جنينية من الكيسات الأريمية على التخلص 31،32. باستخدام نهج برمجة، يمكن للباحثين الآن تولد iPSCs من المر?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube Terumo VF-054SBCS07
Ammodium chloride Sigma-Aldrich A9434
Potassium bicarbonate Sigma-Aldrich 60339
EDTA disodium powder Sigma-Aldrich E5134 0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium  GE Healthcare Life Sciences 17-5442-02 Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)  Gibco 21056-023 No phenol red
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) Gibco 51500-056  1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031 1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 300-07 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) PeproTech 200-03 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) PeproTech 100-11 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) R&D Systems  287-TC-500 2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D2915 1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin R&D Systems  2914-HT 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II Gibco 11269016 Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1 StemCell Technologies 5850 Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM Gibco 10829-018
Knockout Serum Replacement Gibco 10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140-050
2-Mercaptoethanol  Gibco 31350-010 0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate Sigma-Aldrich B5887 0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa  R&D Systems  4114-TC 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503  10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum Hyclone SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution Merck-Millipore ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD Biosciences 354230
Collagenase, Type IV Gibco 17104-019 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007 Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) Global Stem GSC-6201G 1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F Addgene  27077 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK Addgene  27078 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL Addgene  27080 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP Addgene  27082 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit Stemgent 00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody Merck-Millipore MAB4304 1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody Merck-Millipore MAB4360 1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody Merck-Millipore MAB4381 1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-9081 1/500
Anti-Nanog Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-33759 1/500
Anti-Troponin I Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15368 1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody Sigma-Aldrich A7732 1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody Covance Research Products Inc  MMS-435P-100 1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Calbiochem 657012 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse  Molecular Probes A-11029 1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit Molecular Probes A-21429 1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate Corning 3471
Trizol Reagent Ambion 15596-018  reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754050 Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 185-5195
Experion Automated Electrophoresis System Bio-Rad 700-7000 Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit Bio-Rad 7007105 Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) Zeiss 495007
NeonTransfection System 100 µL Kit Invitrogen MPK10025 Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000 Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells–from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Play Video

Cite This Article
Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas, A. A., Schwienbacher, C., Silipigni, R., Di Segni, M., Chen, H. V., Pramstaller, P. P., Hicks, A. A., Rossini, A. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids. J. Vis. Exp. (100), e52885, doi:10.3791/52885 (2015).

View Video