Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Summary

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Abstract

Las células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) forzando la expresión de cuatro factores de transcripción (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), por lo general expresado por las células madre embrionarias humanas (hESCs) . Debido a su similitud con hESCs, iPSCs se han convertido en una herramienta importante para el potencial de la medicina regenerativa específica del paciente, evitando problemas éticos asociados con hESCs. Con el fin de obtener células adecuadas para la aplicación clínica, CMPI-transgén libre necesitan ser generados para evitar la reactivación del transgén, expresión de genes alterados y la diferenciación equivocada. Por otra parte, un método de reprogramación altamente eficiente y de bajo costo es necesario derivar iPSCs suficientes para fines terapéuticos. Ante esta necesidad, un enfoque eficiente no integrar plásmido episomal es la opción preferible para IPSC derivación. Actualmente, el tipo de célula más común usado para los propósitos de reprogramación son fibroblastos, el aislamiento de los cuales requiere biopsia de tejido, una iprocedimiento quirúrgico nvasive para el paciente. Por lo tanto, la sangre periférica humana representa el tejido más accesible y menos invasivo para la generación de IPSC.

En este estudio, un protocolo rentable y viral gratis con no-integración de plásmidos episomales se reporta para la generación de células iPS a partir de células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados después de toda la centrifugación de sangre y sin densidad de separación en gradiente.

Introduction

En 2006, el grupo de Shinya Yamanaka ¹ demostró por primera vez que las células somáticas de ratones y seres humanos adultos se pueden convertir en un estado pluripotente por la expresión ectópica de cuatro factores de reprogramación (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), generando las llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ^2. CMPI-paciente específico se parecen mucho a las células madre embrionarias humanas (hESCs) en términos de la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en los tipos de células de tres germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo), mientras que carece de los problemas éticos asociados a la utilización de hESCs y derivación posible rechazo inmune ^3. Por lo tanto, iPSCs aparece como una de las fuentes más importantes de las células específicas del paciente para la investigación básica, la detección de drogas, el modelado de la enfermedad, la evaluación de la toxicidad y efectos de medicina regenerativa ^4.

Varios enfoques se han utilizado para la generación de IPSC: vectores de integración virales⁽⁵ retrovirus, lentivirus ^6), virales no-integración de vectores (adenovirus ^7), Sendai virus ^8, transposones BAC ^9, vectores episomales ^{10, 11} proteínas o ARN entrega ^12. Aunque el uso de métodos mediada por virus puede conducir a la reprogramación de alta eficiencia, los vectores virales se integran en el genoma de células huésped y por lo tanto potencial mutagénesis de inserción al azar, alteración permanente de la expresión génica, y la reactivación de transgenes silenciados durante la diferenciación no se puede excluir ^13.

Para hacer iPSCs más seguro para la medicina regenerativa, se han hecho esfuerzos para derivar iPSCs sin la integración de ADN exógeno en genomas celulares. Aunque se han desarrollado vectores virales y transposones sujetos a impuestos especiales, todavía no está claro si las secuencias del vector cortos, que inevitablemente permanecen en las células transducidas después de la escisión, y transposasa expresión, podrían inducir alteración en la celdaular funcionan ^13. A pesar de su alta eficiencia de reprogramación, virus Sendai representa un enfoque caro y llegar a través de las preocupaciones de licencia con la empresa que desarrolló este sistema tiene el potencial de limitar su aplicación en estudios de traducción. Además, la necesidad de la introducción directa de proteínas y ARN requiere la entrega múltiplo de la reprogramación de moléculas con las limitaciones técnicas inherentes esto conlleva la introducción, y la eficiencia general de reprogramación es muy baja ^14. De nota, métodos virales libres y no integrador rentables basados ​​en el uso de plásmidos episomales se han reportado con éxito para la reprogramación de fibroblastos de la piel ^15. En concreto, en el presente trabajo hemos decidido utilizar plásmidos episomales-integración libre de comerciales disponibles, como se informó anteriormente ^10,15.

Hasta la fecha, los fibroblastos de la piel representan el tipo de célula donante más popular ^5. Sin embargo, otras fuentes de células han sido éxitosfully reprogramado en iPSCs incluyendo queratinocitos ^16, células madre mesenquimales de médula ósea ^17, las células del estroma adiposo ^18, folículos pilosos ^19, y las células de la pulpa dental ^20. El aislamiento de estas células requiere procedimientos quirúrgicos, y se necesitan varias semanas para la expansión de células in vitro con el fin de establecer un cultivo celular primario.

En este sentido, la selección de iniciar tipo de célula es crítica y es igualmente importante ser capaz de producir células iPS a partir de tejidos de fácil acceso y menos invasivas como la sangre. Tanto las células mononucleares de sangre de cordón (CBMNCs) ^21,22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) ^14,22-24 representan fuentes adecuadas de células para la derivación de células iPS.

Aunque la eficiencia de adulto PBMNC reprogramación es 20-50 veces menor que la de CBMNCs ^22, siguen siendo el tipo de célula más conveniente para el propósito de muestreo. EnDe hecho, el muestreo PBMNC tiene la ventaja de ser mínimamente invasiva, y además, estas células no requieren extensa expansión in vitro antes de los experimentos de reprogramación. Hasta la fecha, diferentes protocolos han informado de que PBMNCs después de la separación en gradiente de densidad pueden ser congeladas y descongeladas días a varios meses después de la congelación y se expandieron para pocos días antes de la reprogramación en iPSCs ^22,23. Sin embargo, en lo que somos conscientes no hay informes han descrito reprogramación de PBMNCs de buffy abrigos congelados. Es importante destacar que, buffy abrigos congelados recogidos sin separación en gradiente de densidad representan las muestras de sangre más comunes almacenados en bancos de datos genéticos a gran escala a partir de los estudios de población, lo que representa una piscina de fácil acceso de material para la producción de IPSC que evita además la recogida de muestras.

Aquí nos presenta por primera vez la generación de CMPI-virales libres de capas leucocitarias congelados humanos, sobre la base de un protocolo previamente descrito ^22. EnAdemás, CMPI se generaron a partir PBMNCs congelados obtenidos después de la separación en gradiente de densidad, como un protocolo de control para los resultados PBMNC gradiente de densidad no purificada.

Protocol

Células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) fueron aisladas de muestras de sangre periférica humana de donantes sanos después de firmado el consentimiento y la aprobación del Comité Ético de la provincia del Tirol del Sur informado. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. Todos los datos fueron recogidos y analizados de forma anónima. 1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PB…

Representative Results

En este estudio un protocolo simple y eficaz para la generación de CMPI-virales libre por reprogramación de PBMNCs aislados a partir de capas leucocitarias congelados después de la centrifugación de sangre total y la comparación con la reprogramación de PBMNCs obtenidos después de la separación en gradiente de densidad se informó. La Figura 1A muestra una representación esquemática de el protocolo detallado. Después de la descongelación, las PBMNCs aisladas, que muestran una típica forma r…

Discussion

En el pasado, la única forma de obtener células madre pluripotentes humanos con una mutación genética particular era reclutar a los padres sometidos a diagnóstico genético pre-implantación y generar células madre embrionarias a partir de sus blastocistos descartado ^31,32. Utilizando un enfoque de reprogramación, los investigadores ahora pueden generar células iPS de pacientes portadores de prácticamente cualquier genotipo. La posibilidad de empezar de una línea celular específica del paciente y u…

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µL Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit