Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Хирургические Модели гастроэзофагеальной рефлюксной с мышами

doi: 10.3791/53012 Published: August 25, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная.

1. Подготовка Мышь

  1. Используйте мышь над ~ 20 г массы тела или выше ~ 6 недель в возрасте для хирургии.
  2. До операции, дать мышам лаборатории чау и воды вволю и поддерживать на 12:12 час свет-темнота цикла.
  3. Бритье хирургического зона с машинки для стрижки волос. Обезболить мышей внутрибрюшинным введением 80 мг / кг кетамина и 12 мг / кг ксилазина. Эта доза ставит мышей в сон в течение нескольких минут и обеспечивает достаточное обезболивание для следующих хирургических процедур.
  4. Подтвердите правильное обезболивания, основанный на отсутствии роговицы рефлекс и конечностей втягивания, когда разбойник зажат. Применить смазочных глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость.
  5. Стерилизовать кожу бетадином решения.

2. желудочного рефлюкса Модель (1В)

  1. Сделайте верхнийсрединный разрез от ~ 2 см, начиная с мечевидным указывая на анус.
  2. Откройте брюшной полости через линии. Удалить мечевидного для повышения экспозиции с ножницами.
  3. Отдельная и сократить соединительной ткани между печени и желудка. Лигировать и вырезать пучок сосудов между селезенки и глазного дна, чтобы полностью освободить дно.
  4. Поверните глазного дна немного влево и выставить левую сторону желудочно-перехода в поле. Сделайте 5 мм продольный разрез на мышцы вдоль дистального отдела пищевода с использованием пары острых ножниц, чтобы выставить эпителий.
  5. Разрежьте эпителий в том же направлении (разрез 1, 1В). Сделать три разрезы на forestomach (2 разреза, 3 и 4, Фигура 1В), чтобы отрезать большую часть forestomach с острыми ножницами эксплуатации. Если желудок не пуст, тщательно удалить содержимое желудка.
  6. Поставьте 8-0 проленовой ŞuţuRe (с конической точки иглы) через точку А (на пищеводе) и точка А '(на forestomach) с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции. Аналогичным образом место швы через точку В и точка В ', и другими парами точек, соответственно. Равномерно пространстве эти швы 3-4 мм друг от друга.
  7. Вымойте брюшной полости физиологическим раствором для очистки крови и содержимого желудка. Закройте брюшной стенки с шелковыми швами и кожу с металлическими зажимами.

3. Смешанный рефлюкс Модель (рис 1С)

  1. Последующие шаги 2.1 до 2.4, чтобы разоблачить желудочно-пищеводного соединения.
  2. Аккуратно отделить спинной стороне пищевода из кровеносных сосудов позади пищевода. Пройдите небольшой кончик хлопок между пищеводом и кровеносных сосудов.
    Примечание: Хлопок может быть частично удаляют из наконечника, чтобы уменьшить его размер. Этот совет хлопок служит двум целям, поднимая пищевод и защиты кровеносных сосудов.
  3. Сделайте два 5 мм продольное вклisions друг на желудочно-перехода и проксимальный конец двенадцатиперстной кишки, прилегающей к привратника с острыми ножницами эксплуатации. Для разреза на двенадцатиперстную кишку, во избежание кровеносные сосуды и разместить на анти-брыжеечной границе.
  4. Анастомозирует разрезы с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции прерванных 8-0 Prolene швов. Обычно место 3-4 швов на спинной стороне и 2-3 швов на лицевой стороне.
  5. Снимите наконечник хлопка. Промыть брюшную полость с физиологического раствора и закрыть брюшной стенки и кожу.

4. двенадцатиперстной рефлюкс Модель (рис 1D)

  1. Следуйте шаг 3.1 до 3.4 для создания смешанного рефлюкса.
  2. Осторожно поднимите живот, чтобы выставить свою обратную сторону. Выступ печени может быть захвачен соединительной ткани между печени и задней части желудка. Аккуратно вырежьте соединительной ткани, должным образом защитить печень, и выставить кровеносные сосуды на спинной стороне пищевода.
  3. Перевязывать исократить кровеносные сосуды. Перевязывать и сократить пищевод в желудочно-перехода.
  4. Перевязывать двенадцатиперстную кишку на привратника. Перевязывать и сократить брыжейки. Снять целый желудок.
  5. Промыть брюшную полость с физиологического раствора. Закройте брюшной стенки и кожу.

5. После хирургического лечения

  1. После операции поддержания температуры тела с грелку. Лишь после восстановления грудины лежачее положение, место мышей обратно с другими животными.
  2. Дайте антибиотики и обезболивающее для предотвращения инфекции и облегчить боль. Вводите Baytril (10 мг / кг, внутрибрюшинно, ежедневно, в течение 3 дней), чтобы предотвратить инфекцию, и бупренорфин гидрохлорид (0,05 мг / кг, подкожно, ставка. В течение двух дней), как болеутоляющее средство. Пост не является необходимым после операции.
    Жидкость или мягкое диета может быть предоставлена.
  3. Оценить общее состояние здоровья на ежедневной basis.If мышей показывают следующие признаки (драматическая потеря веса> 15%, отсутствие приложенияetite, вокализации, выделения из носа, рта или глаз, сгорбившись жест, бездействия, ненормальное уход деятельности), усыпить мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Большинство мышей (> 95%) может пережить операцию. В послеоперационном периоде, ведущие причины смерти включают передозировку анестетиков, кровотечение и неизвестные причины.

Четыре недели после операции,> 90% мышей с желудочного рефлюкса или смешанной рефлюкса и> 80% мышей с двенадцатиперстной рефлюкса могут выжить. В течение этого периода, в первую очередь мышей умирают от пищевода стриктуры и невозможность поесть. Эти мыши обнаруживают признаки сильного стресса (сгорбившись позе, бездействия, рвота, запавшие глаза, вокализации, и т.д.) и должны быть умерщвлены. Медицина с антибиотиками и инфузии, как правило, не может спасти этих мышей от смерти. Мыши, как правило, теряют вес тела на пару граммов после операции, особенно с обратным холодильником в двенадцатиперстной. Тем не менее массы тела восстановится и увеличить в дальнейшем.

Сорок недель после операции,> 80% мышей с желудка и смешанного рефлюкса и> 70% мышей с двенадцатиперстной рефлюкса могут выжить. ДурING этот период, некоторые мыши могут умереть от недоедания или неизвестным причинам. Мы сохранили мышей в течение 80 недель после операции. В общем, они все еще ​​довольно активной и здоровой 9.

В четырех недель после операции, архитектура эпителия пищевода будут повреждены более или менее рефлюкса. Под микроскопом, эпителий становится толще и сосок вытягивается. Гиперпролиферацию эпителиальных клеток и инфильтрации воспалительных клеток (например, нейтрофилов, тучных клеток и эозинофилов) явные признаки эзофагита (рис 2). Цитокины в эпителия пищевода (например, IL1β, IL6 и IL8) повышены в частности, в присутствии рефлюкса дуоденального 11. Под электронным микроскопом передачи, дилатационная межклеточное пространство отражает ухудшение эпителиальных барьерной функции 12. Функция стрелке, транс-эпителиального электрическое сопротивление резко уменьшилось, особенно в присутствии duodenаль рефлюкс.

Фигура 1
Рисунок 1: (А) Анатомия верхних отделов пищеварительного тракта у мышей (вид спереди и вид сбоку); (B), желудочного рефлюкса (вид сбоку); (С) Смешанный рефлюкс (вид спереди); (D), двенадцатиперстной рефлюкс (вид спереди).

Рисунок 2
Рисунок 2: Гистология мыши эпителия пищевода без рефлюкса (А), или с желудочного рефлюкса (B), смешанный рефлюкс (C), двенадцатиперстной обратным холодильником (D). Масштабная линейка = 50 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Различные хирургические модели были созданы, чтобы имитировать желудка, язва двенадцатиперстной и смешанный рефлюкс у грызунов. Эти три процедуры, описанные здесь, подходят для долгосрочных экспериментов с разумным ценам послеоперационного выживания. Исследователь с опытом хирургического должны быть в состоянии понять технику после короткого периода практики.

Кровотечение может быть результатом внутрибрюшинной инъекции анестетиков до операции, рваные раны печени во время разделения соединительной ткани между печени и желудка, и случайного повреждения кровеносных сосудов. Этого следует избегать, насколько это возможно. Батарейках мини-прижигание могут быть использованы, чтобы остановить кровотечение, если это необходимо. Чрезмерного растяжения следует избегать, насколько это возможно, когда органы и ткани манипулировать. Кончики пинцета может быть обернута ватой или ватные палочки могут быть использованы как палочками, чтобы заменить пинцет. Пищевод мышь имеет два слоя или два и #8220; трубки ", внешняя красновато" мышцы труб "и внутренняя беловато" эпителий труб ". Когда надрез на пищевод, оба слоя должны быть разрезана. Швы должны быть равномерно распределены с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции. Утечка может привести из широкого расстояния между швами, а стриктуры может развиться из-за узкого расстояния между швами. Тем не менее, сужение может блокировать прохождение пищи и вызывают послеоперационную смерть, в то время как небольшая утечка может быть фиксированной местной адгезии и фиброзной реакцией и, таким образом, как правило, не опасны для жизни.

Есть несколько критически общие принципы, чтобы следовать в протоколе. Продолжительность операции должен быть сокращен, если это возможно (около 20-30 мин в лаборатории). Пост до и после операции не является необходимым. В самом деле, длительное голодание (> 1 день) может быть вредным. Хирургическое лучше всего проводить с помощью одного хирурга. Помощник может помочь обезболить мышей и поставить Surgские материалы. Микроскоп не надо, если хирург не был должным образом обучены микрохирургии. В противном случае продолжительность операции, как правило, длиннее, чем необходимо и, таким образом послеоперационная выживаемость может быть потенциально хуже.

Эти процедуры были использованы в предыдущих публикаций и сформировали удовлетворительные результаты. Использование дикого типа и генетически модифицированных мышей, мы показали, что NFκB и Nrf2 пути регулируются барьерную функцию эпителия пищевода во время желудочно-пищеводного рефлюкса 11,12. Тем не менее, мы не были в состоянии производить полномасштабный пищевод или аденокарциномы Барретта в этих мышей, а, разбросанных муцинозные клетки и плоскоклеточный рак были вызваны 9. Гистологические различия между пищеводом мыши и человека пищевода могут быть присущи ограничения этих хирургических моделей в исследованиях на пищевода и аденокарциномы пищевода Барретта.

Мы считаем, что эти суrgical модели полезны для исследований на ГЭРБ. Функции генов и молекулярных механизмов можно пояснить понять молекулярные механизмы ГЭРБ и разработать механизм на основе терапии. При использовании для изготовления пищевода и аденокарциномы пищевода Барретта, генетические модификации будут необходимы в сочетании с рефлюкс хирургии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip  Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5" Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 Ethicon US, LLC
Ringer's solution Henry Schein, Inc.
ketamine Henry Schein, Inc.
xylazine Henry Schein, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, (1), 15-22 (2012).
  2. Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24, (6), 873-882 (2010).
  3. Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
  4. Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138, (3), 854-869 (2010).
  5. Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
  6. Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, (11), G1231-G1243 (2012).
  7. Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
  8. Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24, (10), 1683-1688 (2005).
  9. Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
  10. Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7, (4), 1197-1210 (2014).
  11. Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, (1), G58-G65 (2013).
  12. Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63, (5), 711-719 (2014).
Хирургические Модели гастроэзофагеальной рефлюксной с мышами
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, J., Fang, Y., Chen, X. Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice. J. Vis. Exp. (102), e53012, doi:10.3791/53012 (2015).More

He, J., Fang, Y., Chen, X. Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice. J. Vis. Exp. (102), e53012, doi:10.3791/53012 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter