Immunology and Infection

हेपेटाइटिस सी वायरस के खिलाफ मानव लैक्टोफेरिन के सेलुलर तेज और उसके एसोसिएटेड Antiviral गतिविधि पर नजर रखने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53053

Andréa Allaire¹, Frédéric Picard-Jean¹, Martin Bisaillon¹

¹Département de biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke

Abstract

इम्यूनोफ्लोरेसेंस आमतौर पर जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक प्रयोगशाला तकनीक है। यह आम तौर पर कोशिकाओं और ऊतकों में एक लक्ष्य अणु के वितरण और / या स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक कोशिका के भीतर उनके इसी एंटीजन के खिलाफ फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी की विशिष्टता पर निर्भर करता है। दोनों प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण एक fluorochrome के साथ जुड़ा हुआ एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर है, जो इस्तेमाल किया जा सकता है। यह कम संकेत देता है उच्च लागत और कम लचीलापन शामिल है क्योंकि प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस कम बार प्रयोग किया जाता है। इसके विपरीत, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस अधिक सामान्यतः क्योंकि इसकी उच्च संवेदनशीलता का इस्तेमाल किया और एक से अधिक माध्यमिक एंटीबॉडी प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी को संलग्न कर सकते हैं के बाद से एक प्रवर्धित संकेत देता है। इस पांडुलिपि में, epifluorescence माइक्रोस्कोपी और confocal माइक्रोस्कोपी दोनों मानव लैक्टोफेरिन के internalization, प्रतिरक्षा का एक महत्वपूर्ण घटक की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गयायकृत कोशिकाओं में प्रणाली। इसके अलावा, हम immunofluorescence का उपयोग हेपेटाइटिस सी वायरस के intracellular प्रतिकृति पर HLF की निरोधात्मक संभावित नजर रखी। इन दोनों के दृष्टिकोण के साथ जुड़े फायदे और नुकसान पर चर्चा कर रहे हैं।

Protocol

1. प्रकोष्ठों तैयारी और उपचार

24 अच्छी तरह से थाली में, कुओं के तल पर एक गिलास को कवर डाल दिया। फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।
अच्छी तरह / 5 × 10 ⁴ कोशिकाओं के घनत्व के लिए प्रत्येक कुएं में एचसीवी subgenomic replicon समर्थन बीज हं-7 कोशिकाओं। ऐसा करने के लिए कोई इलाज नहीं है, तो कोशिकाओं में एक उच्च घनत्व वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। संस्कृति के माध्यम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट और 250 मिलीग्राम / एमएल जी 418 (replicon बनाए रखने के लिए) के साथ पूरक (DMEM) है।
37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ _2. अगले दिन, मानव दूध से शुद्ध HLF के 3 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं का इलाज।

2. paraformaldehyde / सुक्रोज तैयारी (12% पीएएफ और 12% सूक्रोज)

20 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच यह एक बीकर में पीबीएस के 500 मिलीलीटर रखो और गर्मी। पीबीएस में सुक्रोज की 60 ग्राम भंग। Paraformal के 60 ग्राम भंगपीबीएस / sucrose के समाधान में dehyde (पीएएफ)। धीरे-धीरे एक स्पष्ट समाधान प्राप्त किया जाता है जब तक NaOH 2N (3-7 एमएल) जोड़ें।
एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। पीबीएस के साथ 500 मिलीलीटर के लिए पूरी मात्रा। वाटमान फिल्टर पर गंभीरता से फ़िल्टर। उपयोग करने से पहले, 4% पीएएफ और 4% सुक्रोज (स्टोरेज 1 सप्ताह अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस के साथ समाधान पतला।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

वांछित समय (0 घंटा, 2 घंटा या 24 उपचार के मानव संसाधन), पीबीएस के साथ (1 मिनट) कोशिकाओं को दो बार धोने और आरटी पर 20 मिनट के लिए पीबीएस / 4% पीएएफ / 4% sucrose के साथ तय कर लो। कोशिकाओं 30-40% संगम पर आम तौर पर कर रहे हैं और 1.5X10 ⁵ कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं।
20 मिनट के लिए पीबीएस में 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) में आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.15% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं और ब्लॉक Permeabilize।
10% NGS में ब्याज की प्रोटीन की प्राथमिक एंटीबॉडी पतला (उदाहरण: 1,000: प्राथमिक माउस विरोधी HLF एंटीबॉडी 1 पतला)। कोशिकाओं के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें।
आर टी या हे में 4 घंटे के बाद /4 डिग्री सेल्सियस पर एन, 10% NGS के साथ 5 मिनट के लिए कोशिकाओं तीन बार धोएं। 10% NGS में पतला fluorochrome साथ लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग (उदाहरण: Fluorochrome एक एंटीबॉडी विरोधी माउस 1 से जुड़ा हुआ 488 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ: 1000) अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए।
पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए एक बार कोशिकाओं को धो लें और अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ कोशिकाओं दाग।
पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए दो बार कोशिकाओं को धो लें। माउंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य से पहले Slowfade बढ़ते मध्यम पर चश्मे को कवर किया। कोशिकाओं को अब epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार कर रहे हैं।
पता लगाने की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न नियंत्रण का प्रयोग करें। उदाहरण के लिए, सभी एंटीबॉडी autofluorescence पता लगाने के लिए छोड़ा जा सकता है। प्राथमिक एंटीबॉडी माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा गैर विशिष्ट धुंधला निर्धारित करने के लिए छोड़ा जा सकता है। यदि संभव हो तो अंत में, ऐसा नहीं है कि कोशिकाओं या ऊतकों को नियंत्रितब्याज की अणु भी इस्तेमाल किया जा सकता व्यक्त करते हैं।
इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट लेबल के लिए उचित उचित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (epifluorescence या confocal) और फिल्टर सेट का उपयोग कर नमूने कल्पना। स्लाइड्स भी <-20 डिग्री सेल्सियस के लिए बाद में परीक्षा में एक स्लाइड बॉक्स में संग्रहित किया जा सकता है।

4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Photobleaching को रोकने के लिए अंधेरे में नमूने रखें। चुना माइक्रोस्कोप (epifluorescence या confocal) के प्रकाश स्रोत को चालू करें।
माइक्रोस्कोप चालू करें। माइक्रोस्कोप के लिए कैमरा चालू करें। दृश्य के लिए माइक्रोस्कोप पर स्लाइड रखो। उद्देश्य लेंस की संख्यात्मक एपर्चर बढ़ाने के लिए स्लाइड पर विसर्जन के तेल जोड़ें।
उपयुक्त फिल्टर का चयन करें। ध्यान और उचित उद्देश्य को समायोजित करें। उचित fluorochrome पता लगाने, लेकिन photobleaching को रोकने के लिए दरवाज़े को समायोजित करें। नमूना देख जब पृष्ठभूमि प्रकाश को कम करने के लिए भूमि के ऊपर रोशनी से दूर रखें।
बदलें वेंई फिल्टर (उदाहरण के DAPI के लिए और 488 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए) विभिन्न fluorochromes कल्पना करने के लिए। कैमरा के साथ तस्वीरें ले लो।

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Representative Results

exogenously administrated HLF भली यकृत हं-7 सेल लाइन की क्षमता एक confocal miscroscope पर immunofluorescence का उपयोग नजर रखी थी। HLF संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा गया है और internalization, जिसके बाद कोशिकी HLF पीबीएस के साथ धोया गया था और HLF बाध्य अवशिष्ट झिल्ली एक 5 मिनट के लिए trypsin उपचार (1 एमएल) के साथ अपमानित किया गया था, 24 घंटे के लिए अनुमति दी गई थी। प्रकोष्ठों reseeded और immunofluorescence धुंधला होने से पहले 18 घंटे के लिए फिर से पालन करने के लिए अनुमति दी गई। साइटोप्लास्मिक सीमा की रूपरेखा तैयार करने के लिए, कोशिकाओं की झिल्ली 488 एनएम रूप साधना के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के गेहूं के बीज agglutinin (WGA) fluorochrome साथ दाग रहे थे। HLF धुंधला एक विरोधी HLF प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ एनएम 633 की तरंग दैर्ध्य के साथ एक fluorochrome का उपयोग कर हासिल की थी। HLF की सटीक स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए, कोशिकाओं confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अनुक्रमिक 0.5 माइक्रोन क्षैतिज पार अनुभाग निम्नलिखित imaged थे। 4 एक विकल्प प्रस्तुत करता है चित्रामध्य सेल मोटाई के लिए इसी राजनैतिक पार अनुभाग। बहिर्जात HLF के अलावा के बाद, HLF का एक महत्वपूर्ण राशि हेपाटोसाइट्स की कोशिका द्रव्य के अंदर पाया गया। समान भूमिका निभाई सेटिंग्स का उपयोग करते समय कोई HLF अनुपचारित कोशिकाओं के अंदर मनाया गया। साथ में, इन आंकड़ों हेपाटोसाइट्स उनकी बाह्य वातावरण से HLF हासिल करने की क्षमता है कि इस बात की पुष्टि।

एचसीवी के intracellular प्रतिकृति अगले गया था बाधित करने HLF की क्षमता epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर नजर रखी। प्रतिकृति (एचसीवी NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B प्रोटीन व्यक्त) एचसीवी subgenomic replicon समर्थन हं-7 कोशिकाओं 0, 2 या 24 घंटे के लिए 3 सुक्ष्ममापी HLF के साथ इलाज किया गया। HLF और एचसीवी NS5A प्रोटीन के लिए डबल immunofluorescence धुंधला epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया था। HLF साथ इलाज किया कोशिकाओं में कम हो गया था (एचसीवी गैर संरचनात्मक 5 ए प्रोटीन के immunofluorescence द्वारा मापा) ये परिणाम है कि एचसीवी subgenomic replicon धुंधला संकेत मिलता है। 5 चित्रा trong> HLF इलाज के 24 घंटे के बाद एचसीवी धुंधला तीव्रता में लगभग 50% की एक गुणात्मक कमी का पता चलता है। इस HLF के सामान्य स्वीकार औषधीय लक्ष्य कर रहे हैं जो एचसीवी E1 और E2 लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, कमी है इस subgenomic replicon प्रणाली के रूप में एक दिलचस्प अवलोकन है। एचसीवी धुंधला की लुप्त होती के साथ सहवर्ती, HLF संचय 2 घंटे के बाद पता लगाया जा करने के लिए शुरू किया, और मजबूत HLF संचय 24 घंटे के बाद मनाया गया।

चित्र 1
चित्रा Epifluorescence माइक्रोस्कोपी के 1. सिद्धांत। माइक्रोस्कोपी के इस प्रकार में, उत्तेजना फिल्टर (फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी को शरण देने Tissus या कोशिकाओं) नमूना उत्तेजित जो विशिष्ट तरंगदैर्ध्य का चयन करें। इसके अलावा, उत्सर्जन फिल्टर नमूना लेबल इस्तेमाल की fluorophore वर्णक्रमीय उत्सर्जन विशेषताओं मैच के लिए चुना जाता है।लोड / 53,053 / 53053fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Confocal माइक्रोस्कोपी का चित्रा 2. सिद्धांत। माइक्रोस्कोपी के इस प्रकार के बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश संकेत को खत्म करने के लिए एक उत्सर्जन पिनहोल उपयोग करता है। फोकल हवाई जहाज़ के बहुत करीब प्रतिदीप्ति द्वारा उत्पादित केवल प्रकाश का पता लगाया जा सकता है, छवि के ऑप्टिकल संकल्प epifluorescence सूक्ष्मदर्शी की तुलना में ज्यादा बेहतर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
अप्रत्यक्ष और प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की चित्रा 3. योजनाबद्ध। प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस शामिलब्याज (प्राथमिक एंटीबॉडी) के अणु के लिए विशिष्ट है जो एक fluorochrome के साथ लेबल एंटीबॉडी का ही एक प्रकार है। इसके विपरीत, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस unlabelled प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के लिए विशिष्ट हैं जो fluorochromes के साथ लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी शामिल है। एक से अधिक माध्यमिक एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ जाती है जो प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी को संलग्न कर सकते है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बहिर्जात HLF। हं-7 कोशिकाओं की चित्रा 4. हेपैटोसेलुलर तेज 18 घंटे के लिए फिर से पालन करने की अनुमति दी और immunofluorescence के अधीन एक 5 मिनट के लिए trypsin उपचार, को प्रस्तुत की, दो बार, 24 घंटे के लिए 0 माइक्रोन या 3 सुक्ष्ममापी HLF के साथ इलाज धोया गया। नाभिक डब्ल्यू दाग थे, प्लाज्मा झिल्ली WGA (ग्रीन चैनल) और HLF साथ लेबल रहे थे ith DAPI (नीला चैनल) एक विरोधी HLF एंटीबॉडी (लाल चैनल) के साथ सना हुआ था। छवियाँ 60x का एक मूल बढ़ाई confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा हासिल किया गया। क्षैतिज ऑप्टिकल पार वर्गों कोशिकाओं के मध्य मोटाई प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (11) से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5. HLF उपचार एचसीवी धुंधला कम कर देता है। एचसीवी subgenomic replicon प्रतिकृति समर्थन हं-7 कोशिकाओं 0, 2, या 24 घंटे के लिए 3 सुक्ष्ममापी HLF के साथ इलाज किया और immunofluorescence के अधीन थे। नाभिक DAPI (नीला चैनल), एचसीवी एक विरोधी NS5A एंटीबॉडी (लाल चैनल) से पता चला था और HLF एक विरोधी HLF एक साथ दाग था के साथ दाग थेntibody (ग्रीन चैनल)। छवियाँ 60x का एक मूल बढ़ाई epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा हासिल किया गया। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (11) से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एचसीवी महामारी सिरोसिस, जिगर की विफलता या हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा के जोखिम में उन्हें लगा, एक जीर्ण संक्रमण के विकास के नव संक्रमित रोगियों के 80% के साथ एक वैश्विक खतरा बना रहता है। हाल ही में दो NS3 एन टर्मिनस प्रोटीज अवरोधकों (Boceprevir और Telaprevir) की नियामक मंजूरी के द्वारा प्रदर्शन के रूप में प्रत्यक्ष अभिनय एचसीवी प्रतिकृति और परिपक्वता को निशाना एंटीवायरल एजेंटों, प्रधानमंत्री विरोधी एचसीवी एजेंट प्रतिनिधित्व करते हैं। HLF विरोधी एचसीवी गतिविधि वर्तमान में virions घूम और उनके हेपैटोसेलुलर लक्ष्य में प्रवेश करने से उन्हें रोकने बंधन, एक वायरल प्रविष्टि अवरोध करनेवाला के रूप में व्यवहार करने के लिए माना जाता है। HLF पर हमारे शोध (बाह्य विरिअन निराकरण से अलग) कार्रवाई का एक उपन्यास इंट्रासेल्युलर विरोधी एचसीवी तंत्र ⁷ प्रस्तुत करता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस कुशलता से एक जैविक नमूने में एक लक्ष्य अणु के वितरण और / या स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई अन्य प्रतिदीप्ति तकनीक में मुख्य समर्थक में से एक के रूप में मिलाइम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ जुड़े blems (fluorochrome के प्रकाश रासायनिक विनाश) ⁸ photobleaching है। Photobleaching की वजह से गतिविधि का यह नुकसान photobleaching के लिए या तीव्रता या प्रकाश जोखिम के समय-काल को कम करने से भी कम होने का खतरा है कि और अधिक मजबूत fluorochromes को रोजगार से या तो उन्हें धोखा दिया जा सकता है। एंटीबॉडी कोशिका झिल्ली को पार नहीं कर सकते हैं क्योंकि इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस आम तौर पर केवल तय कोशिकाओं तक सीमित है। वैकल्पिक तरीकों इसलिए आम तौर पर इस तरह की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में ⁹ फ्लोरोसेंट प्रोटीन डोमेन युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर भरोसा जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन का वितरण / स्थानीयकरण पर नजर रखने के लिए। हालांकि, इस तरह GFP एपिटोप्स के अलावा कभी कभी प्रोटीन का स्थानीयकरण और गतिविधि में एक संशोधन के साथ जुड़ा हुआ है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस भी ऊतक वर्गों सहित विभिन्न नमूनों, सुसंस्कृत सेल लाइनों, या व्यक्ति की कोशिकाओं के एक नंबर पर इस्तेमाल किया जा सकता है कि यह भी बार बार पर नजर रखने के लिए किया जाता हैप्रोटीन, ग्लाइकान, और छोटे अणुओं का स्थानीयकरण / वितरण। इस तकनीक का मुख्य लाभ अपनी सादगी और यह फ्लोरोसेंट धुंधला (जैसे, डीएनए धुंधला) के दूसरे, गैर एंटीबॉडी तरीकों के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है कि वास्तव में रहते हैं। इसके अलावा, वाणिज्यिक उत्पादन माध्यमिक एंटीबॉडी रंग की एक विशाल सरणी में अपेक्षाकृत सस्ती और उपलब्ध हैं।

वर्तमान अध्ययन में, एक एचसीवी subgenomic replicon समर्थन यकृत कोशिकाओं के immunofluorescence HLF के साथ इलाज पर एचसीवी धुंधला तीव्रता में एक गुणात्मक कमी का पता चला। इस HLF के सामान्य स्वीकार औषधीय लक्ष्य कर रहे हैं जो एचसीवी E1 और E2 लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, कमी है इस subgenomic replicon प्रणाली के रूप में एक दिलचस्प अवलोकन है। बाह्य विरिअन निराकरण गतिविधि के विपरीत, HLF वायरल प्रतिकृति ख़राब करने के लिए एचसीवी से संक्रमित हेपाटोसाइट्स से भली भाँति करने की आवश्यकता होगी। fuorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग हमें evalu करने की अनुमति दीइस संभावना को खा लिया। एचसीवी से संक्रमित हेपाटोसाइट्स पर पूर्व ऊष्मायन पर, बहिर्जात HLF सफलतापूर्वक भाँति, और intracellular वायरल प्रतिकृति ख़राब करने के लिए दिखाया गया था। इस उपन्यास HLF एंटीवायरल गतिविधि की समझ यह सहज उन्मुक्ति प्रोटीन के निषेध के वैश्विक (और संभावना pleiotropic) तंत्र की समझ में एक कदम आगे का गठन किया।

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca²⁺& Mg²⁺
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000

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References

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