Immunology and Infection

Иммунофлуоресценции для мониторинга клеточного поглощения лактоферрин человека и его противовирусной активностью против вируса гепатита С

Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53053

Andréa Allaire¹, Frédéric Picard-Jean¹, Martin Bisaillon¹

¹Département de biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke

Abstract

Иммунофлуоресценции является метод лабораторной обычно используется для изучения многих аспектов биологии. Это, как правило, используется для визуализации распределения и / или локализации молекулы-мишени в клетках и тканях. Иммунофлуоресценции зависит от специфики флуоресцентных-меченых антител против антигенов, соответствующих их в клетке. Прямые и косвенные подходы иммунофлуоресцентные может быть использован, которые основаны на использовании антител, связанных с флуорохромом. Прямой иммунофлюоресценции менее часто используется, поскольку обеспечивает низкую сигнал, включает высокую стоимость и меньшую гибкость. В противоположность этому, непрямой иммунофлуоресценции чаще используется из-за его высокой чувствительностью и обеспечивает усиленный сигнал, так как более одного вторичного антитела можно прикрепить к каждому первичного антитела. В этой рукописи, и эпифлуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии для контроля интернализации лактоферрина человека, важный компонент иммуннойСистема, в печеночных клетках. Кроме того, мы наблюдали за ингибирующее потенциал чЛФ на внутриклеточного репликации вируса гепатита С с использованием иммунофлуоресценции. Оба обсудили преимущества и недостатки, связанные с этими подходами.

Protocol

1. Клетки подготовки и обработки

В 24-луночный планшет, поставить стеклянную крышку в нижней части лунки. Промыть каждую лунку фосфатно-солевым буфером (PBS).
Семенной Ха-7 клетки, поддерживающие HCV субгеномного репликон в каждой лунке до плотности 5 × 10 ⁴ клеток / лунку. Если нет обработка сделать, клетки могут быть посеяны на более высокой плотностью. Культуральную среду Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 250 мг / мл G-418 (для поддержания репликон).
Инкубируют при 37 ° С и 5% СО _2. На следующий день, лечения клеток с 3 мкМ чЛФ очищенного из грудного молока.

2. Параформальдегид / сахарозы Подготовка (12% СУП и 12% сахарозы)

Поместите 500 мл PBS в химический стакан и нагреть его в пределах от 20 ° С до 30 ° С. Растворить 60 г сахарозы в PBS в. Растворите 60 г paraformalвого альдегида (СУП) в растворе сахарозы / PBS. Медленно добавить NaOH 2N (от 3 до 7 мл) до получения прозрачного раствора.
Доведения рН до 7,4 с помощью HCl. Полный объем до 500 мл с PBS. Фильтр по тяжести на Ватман фильтра. Перед использованием разбавить раствор с PBS до конечной концентрации 4% PAF и 4% сахарозы (хранение 4 ° С в течение 1 недели максимум).

3. Иммунофлуоресценции

В нужное время (0 ч, 2 ч или 24 ч лечения), промыть клетки дважды (1 мин) с PBS и зафиксировать PBS / 4% PAF / 4% сахарозы в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки, как правило, на 30-40% слияния и 1.5X10 ^{5 клеток} используются.
Клетки проницаемыми с 0,15% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и блок в 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) в PBS в течение 20 мин.
Развести первичных антител из интересующего белка в 10% NGS (например: первичная мышиное анти-антитела чЛФ разводили 1: 1000). Применение первичное антитело к клеткам.
Через 4 ч при комнатной температуре или O /N при 4 ° С, промыть клетки три раза в течение 5 мин с 10% NGS. Пятно клетки с вторичным антителом, меченным флуорохромом, разведенного в 10% NGS (например: Флуорохром с длиной волны возбуждения 488 нм, связанного с антителом против мыши 1: 1000) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
Промыть клетки один раз в течение 5 мин с PBS и окрашивают клетки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
Промыть клетки дважды в течение 5 мин с PBS. Установить крышку очки на SlowFade монтажа среду до визуализации через микроскопии. Клетки готовы для анализа эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
Используйте различные элементы управления, чтобы обеспечить специфичность обнаружения. Например, все антитела могут быть опущены, чтобы обнаружить флуоресценции. Первичные антитела могут быть опущены, чтобы определить неспецифическое окрашивание вторичным антителом. Наконец, если это возможно, контролировать клеток или тканей, которые не делаютвыразить интерес молекула также могут быть использованы.
Представьте образцы, используя подходящий флуоресцентный микроскоп (эпифлуоресцентной или конфокальной) и наборы фильтров, подходящий для флуоресцентной метки используются. Слайды также могут быть сохранены в виде слайд-поле в <-20 ° C для последующего анализа.

4. флуоресцентной микроскопии

Держите образцы в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Включите источник света выбранной микроскопом (эпифлуоресцентной или конфокальной).
Включите микроскопа. Включите камеру для микроскопа. Положите слайд на микроскопе для визуализации. Добавить иммерсионное масло на слайде, чтобы увеличить числовую апертуру объектива.
Выберите соответствующие фильтры. Отрегулируйте фокусировку и подходящий цели. Отрегулируйте жалюзи в целях выявления соответствующего флуорохром но предотвратить фотообесцвечивания. Держите накладные огни, чтобы минимизировать фоновый свет, глядя на образец.
Изменить йе фильтров для визуализации различных флуорохромов (например DAPI и для длине волны возбуждения 488 нм). Возьмите фотографии с камеры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Способность печени Ха-7 клеточной линии интернализации экзогенно администрируемых чЛФ контролировали с помощью иммунофлуоресценции на конфокальной miscroscope. чЛФ был добавлен в культуральной среде и интернализации давали в течение 24 ч, после чего внеклеточный чЛФ промывали PBS и остаточного мембраной чЛФ деградировала с 5 мин обработки трипсином (1 мл). Клетки пересевали и позволило повторно придерживаться в течение 18 часов перед иммунофлуоресцентного. Для того, чтобы наметить цитоплазматические пределы клетки мембраны окрашивали зародышей пшеницы (WGA агглютининов) флуорохромом в длине волны возбуждения 488 нм конъюгата. Окрашивание чЛФ была достигнута с использованием первичных антител анти-чЛФ и флуорохромом с длиной волны 633 нм, связанного с вторичным антителом. Для того, чтобы определить точную локализацию чЛФ, клетки были обследованы следующие последовательные 0,5 мкм горизонтальном поперечном сечении по конфокальной микроскопии. 4 представлены выбираниеческих сечение, соответствующее толщине средней клеток. После добавления экзогенного чЛФ, значительное количество чЛФ был обнаружен внутри цитоплазмы гепатоцитов. Нет чЛФ не наблюдалось внутри необработанных клеток при использовании одинаковых инструментальных параметров. Вместе эти данные подтверждают, что гепатоциты обладают способностью приобретать чЛФ от их внеклеточной среде.

Способность чЛФ ингибировать внутриклеточное репликации ВГС был рядом контролируется с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Хух-7 клеток, поддерживающих ВГС репликон субгеномного (выражающее HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B белки) репликации лечили 3 мкм чЛФ для 0, 2 или 24 часа. Двойной иммунофлюоресценции окрашивание чЛФ и ВГС NS5A белков анализировали с помощью микроскопии эпифлуоресцентной. Эти результаты показывают, что окрашивание ВГС субгеномная репликона (как измерено с помощью иммунофлуоресценции ВГС неструктурных белков 5А) была снижена в клетках, обработанных чЛФ. Фиг.5 Чонг> показывает качественный снижение примерно на 50% в интенсивности окрашивания ВГС после 24 часов лечения чЛФ. Это интересное наблюдение, как это субгеномной системы репликона HCV не хватает E1 и E2 конверт гликопротеинов, которые являются общепринятые фармакологические мишени чЛФ. Одновременно с угасанием окрашивания HCV, накопление чЛФ стали обнаружены после 2 часов, и сильный накопления чЛФ наблюдалось после 24 часов.

фигура 1
Рисунок 1. Принцип эпифлуоресцентной микроскопии. В этом типе микроскопии, фильтры возбуждения выбрать определенную длину волны, который возбуждает образца (TISSUS или клетки, несущие флуоресцентные меченных антител). Кроме того, фильтры выбросов выбраны, чтобы соответствовать спектральные характеристики излучения флуорофора, используемого для обозначения образца.нагрузка / 53053 / 53053fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Принцип конфокальной микроскопии. Этот тип микроскопии использует крошечное отверстие выбросов устранить из фокуса светового сигнала. Так как только свет, излучаемый флуоресценции очень близко к фокальной плоскости могут быть обнаружены, оптическое разрешение изображения намного лучше, чем эпифлуоресцентной микроскопов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Схема непрямого и прямого иммунофлюоресценции. Прямой иммунофлюоресценции включаеттолько один тип антитела, меченного флуорохромом, который является специфичным для интересующей молекулы (первичным антителом). В отличие от этого, непрямой иммунофлюоресценции включает вторичные антитела, меченные флуорохромами, которые являются специфическими для видов немеченым первичного антитела. Более вторичное антитело может прикрепить к каждой первичного антитела, что повышает сигнал флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Гепатоцеллюлярной поглощение экзогенных чЛФ. Ха-7 клетки обрабатывали 0 мкм или 3 мкм чЛФ в течение 24 часов, промывают дважды, представленный трипсина лечения 5 мин, позволило повторно придерживаться в течение 18 ч и подвергали иммунофлюоресценции. Ядра окрашивали жIth DAPI (синий канал), плазматические мембраны метили WGA (зеленый) и канала чЛФ окрашивали антителом против чЛФ (красный канал). Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии при увеличении первоначального 60x. Горизонтальные оптические поперечные сечения представляют середины толщины клеток. Масштаб бар, 10 мкм. Измененный (11). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Обработка чЛФ уменьшает окрашивание HCV. Ха-7 клеток, поддерживающих ВГС репликон субгеномная репликацию обрабатывали 3 мкМ чЛФ в течение 0, 2, или 24 ч и подвергают иммунофлюоресценции. Ядра окрашивали DAPI (синий канал), ВГС было выявлено с помощью анти-NS5A антитела (красный канал) и чЛФ окрашивали анти-А чЛФntibody (зеленый канал). Изображения были получены с помощью микроскопии в эпифлуоресцентной оригинальной увеличением 60x. Масштаб бар, 10 мкм. Измененный (11). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эпидемия гепатита остается глобальной угрозой, с 80% вновь инфицированных пациентов развивающихся хроническую инфекцию, положить их на риск цирроза, печеночной недостаточности или гепатоцеллюлярной карциномы. Прямого действия противовирусных препаратов, направленные репликацию HCV и созревание представляют простые агенты анти-HCV, как недавно продемонстрировано нормативного утверждения двух NS3 N-концевых ингибиторов протеазы (Boceprevir и Telaprevir). Анти-ВГС активность чЛФ настоящее время считается, вести себя, как вирусный ингибитор входа, связывание оборотных вирионов и предотвращения их попадания в их гепатоцеллюлярной цели. Наши исследования чЛФ представляет новый механизм внутриклеточного анти-HCV действия (отличный от внеклеточного вириона нейтрализации) ^7.

Иммунофлуоресценции может быть эффективно использован для визуализации распределения и / или локализации молекулы-мишени в биологическом образце. Как во многих других флуоресцентных методов, один из основных пропроблемы еще, связанные с иммунофлюоресценции является фотообесцвечивания (фотохимический разрушение флуорохромом) ^8. Эта потеря активности вызвано фотообесцвечиванию можно обойти либо с использованием более надежных флуорохромов, которые менее склонны к фотообесцвечивания или путем уменьшения интенсивности или временной промежуток освещенности. Кроме того, поскольку антитела не может пересечь клеточную мембрану, иммунофлюоресценции, как правило, ограничивается только фиксированных клеток. Альтернативные подходы для контроля распределения / локализацию белков в живых клетках, поэтому обычно полагаются на экспрессию белков, содержащих домены флуоресцентный белок, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) ^9. Однако добавление таких GFP эпитопов иногда ассоциируется с модификацией в локализации и активности белка. Иммунофлуоресценции также могут быть использованы в ряде различных образцов, включая ткани, секций культивируемых клеточных линий, или отдельных клеток он также часто используется для мониторингалокализация / распределение белков, гликанов, и малых молекул. Основные преимущества данной методики находятся в его простоте и в том, что он может быть использован в сочетании с другими, не-антитела методами флуоресцентной окраски (например, окрашивание ДНК). Кроме того, в продаже производимые вторичные антитела являются относительно недорогими и доступны в огромном массиве цветов.

В текущем исследовании, иммунофлюоресценции печеночных клеток, поддерживающих ВГС репликон субгеномного показали качественный снижение интенсивности окрашивания в ВГС при обработке чЛФ. Это интересное наблюдение, как это субгеномной системы репликона HCV не хватает E1 и E2 конверт гликопротеинов, которые являются общепринятые фармакологические мишени чЛФ. В отличие от внеклеточный вирион нейтрализации активности, чЛФ необходимо будет усвоен, инфицированных ВГС гепатоцитов, чтобы нарушить репликацию вируса. Использование fuorescence микроскопии позволило оценели эту возможность. После предварительной инкубации в инфицированных ВГС гепатоцитов, экзогенные чЛФ успешно усвоены, и было показано, ухудшает внутриклеточный репликацию вируса. Понимание этого нового чЛФ противовирусной активности является шагом вперед в понимании глобальной (и, вероятно, плейотропный) механизма ингибирования этой врожденной белка иммунитета.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca²⁺& Mg²⁺
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4 (2013).
Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
Green Remington, S. J. fluorescent protein: a perspective. Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).