Abstract
免疫蛍光は、一般的に生物学の多くの側面を研究するために使用される実験技術です。それは、典型的には、細胞及び組織中の標的分子の分布および/または局在化を可視化するために使用されます。免疫蛍光は、細胞内でのそれらの対応する抗原に対する蛍光標識抗体の特異性に依存しています。直接的および間接的の両方の免疫アプローチは、蛍光色素に結合された抗体の使用に依存しているものを用いることができます。それは、より低い信号を提供し、より高いコスト、より少ない柔軟性を必要とするので、直接免疫蛍光法は、あまり頻繁に使用されます。対照的に、間接免疫蛍光法は、より一般的に、その高い感度を使用し、複数の二次抗体は、それぞれ一次抗体に付着することができるので、増幅された信号を供給する。本稿では、落射蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡法の双方は、ヒトラクトフェリンの内在化、免疫の重要な構成要素を監視するために使用しました。肝細胞へのシステム。また、我々は、免疫蛍光法を用いて、C型肝炎ウイルスの細胞内複製にHLFの阻害可能性を監視しました。これらのアプローチに関連する利点と欠点の両方が議論されています。
Protocol
1.細胞の調製および治療
- 24ウェルプレートにおいて、ウェルの底部にカバーガラスを置きます。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を各ウェルを洗浄します。
- /ウェル5×10 4細胞の密度に各ウェル中のHCVサブゲノムレプリコンを支援するシードのHuh-7細胞。行うには治療法がない場合、細胞は、より高い密度で播種することができます。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび250 mg / mlのG-418（レプリコンを維持するため）を補足した（DMEM）です。
- 37℃で培養し、5％CO 2翌日、ヒトの乳から精製されたHLFの3μMで細胞を処理します。
2.パラホルムアルデヒド/ショ糖の製造（12％PAFおよび12％ショ糖）
- ビーカーに500mlのPBSに入れ、20°Cと30°Cの間に加熱します。 PBS中のショ糖の60グラムを溶解します。 paraformalの60グラムを溶かしPBS /スクロース溶液中のアルデヒド（PAF）。透明な溶液が得られるまでゆっくりと2NのNaOH（3~7 ml）を加えます。
- HClでpHを7.4に調整します。 PBSで500ミリリットルに、完全なボリューム。ワットマンのフィルター上の重力によってフィルタします。使用前に、4％PAFおよび4％スクロース（ストレージ1週間に最大4°C）の最終濃度にPBSで溶液を希釈します。
3.免疫蛍光
- 所望の時間（0時間、2時間または治療の24時間）で、PBSで2回（1分）細胞を洗浄し、室温で20分間、PBS / 4％PAF / 4％スクロースで固定します。細胞が30-40％コンフルエントであり、典型的には1.5×10 5個の細胞が使用されます。
- 20分間、PBS中10％正常ヤギ血清（NGS）中で室温で5分間、PBS中の0.15％のトリトンX-100で細胞を透過性とブロック。
- 10％NGS中で目的のタンパク質の一次抗体を希釈する（例：1,000：一次マウス抗HLF抗体の1希釈）。細胞に一次抗体を適用します。
- RTまたはOで4時間後/4℃でのNは、10％NGSで5分間、細胞を3回洗浄します。 10％NGS中で希釈した蛍光色素で標識した二次抗体を用いた細胞染色（例：蛍光色素を抗体抗マウス1に連結された488nmでの励起波長で1,000）暗所でRTで1時間。
- PBSで5分間、細胞を1回洗浄し、暗所で室温で15分間、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（1μg/ ml）で細胞を染色します。
- PBSで5分間、細胞を2回洗浄します。マウントは、顕微鏡を通して視覚化する前にメディアをマウントSlowFadeのメガネをカバーしています。細胞は今落射蛍光または共焦点顕微鏡による分析のために準備ができています。
- 検出の特異性を確保するために、別のコントロールを使用します。例えば、すべての抗体は、自己蛍光を検出するために省略することができます。一次抗体を、二次抗体による非特異的染色を決定するために省略することができます。ない最後に、可能な場合は、コントロール細胞または組織目的の分子を用いることも可能で発現します。
- 使用される蛍光標識に適した適切な蛍光顕微鏡（落射蛍光または共焦点）とフィルターセットを使用してサンプルを可視化します。スライドはまた、<-20°Cの場合、後の検査でスライドボックスに保存することができます。
4.蛍光顕微鏡
- 光退色を防止するために、暗闇の中でサンプルを保管してください。選択した顕微鏡（落射蛍光または共焦点）の光源をオンにします。
- 顕微鏡の電源をオンにします。顕微鏡用カメラの電源をオンにします。可視化のための顕微鏡のスライドを入れてください。対物レンズの開口数を増加させるために、スライド上の液浸油を加えます。
- 適切なフィルタを選択します。フォーカスし、適切な目標を調整します。適切な蛍光色素を検出するが光漂白を防ぐためにシャッターを調整します。サンプルを見ているときに、背景光を最小化するためにオーバーヘッドライトをオフにしてください。
- 目を変更電子フィルタは、（例えばDAPIおよび488nmでの励起波長のための）様々な蛍光色素を可視化します。カメラで写真を撮ります。
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Representative Results
外因的に投与さHLFを内在する肝臓のHuh-7細胞株の能力を、共焦点miscroscopeに免疫蛍光を用いてモニターしました。 HLFは、培養培地に添加し、インターナリゼーションは、その後、細胞外HLFをPBSで洗浄し、結合したHLF残留膜を5分間トリプシン処理（1 ml）で分解し、24時間おきました。細胞は、再播種し、免疫蛍光染色の前に18時間再接着させました。細胞質の限界を概説するために、細胞膜を488nmの複合体の励起波長のコムギ胚芽凝集素（WGA）蛍光色素で染色しました。 HLF染色は抗HLF一次抗体と二次抗体に結合された波長633nmの蛍光色素を使用して達成されました。 HLFの正確な位置を決定するために、細胞を、共焦点顕微鏡によるシーケンシャル0.5μmの水平断面次画像化した。 図4は、オプトインを示す図ミッドセル厚に対応するicalの断面。外因性HLFの添加後、HLFのかなりの量は、肝細胞の細胞質中に検出されました。同一の楽器の設定を使用しない時HLFは、未処理の細胞の内部観察されませんでした。一緒に、これらのデータは、肝細胞が、それらの細胞外環境からHLFを取得する能力を持っていることを確認します。
HCVの細胞内複製を阻害するHLFの能力は、次のエピ蛍光顕微鏡を用いてモニターしました。複製（HCV NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bタンパク質を発現する）HCVサブゲノムレプリコンを支持するHuh-7細胞を、0,2または24時間、3μMHLFで処理しました。 HLF及びHCV NS5Aタンパク質についての二重免疫蛍光染色は、落射蛍光顕微鏡法により分析しました。 HLFで処理した細胞において減少した（HCV非構造（a）タンパク質の免疫蛍光によって測定される）これらの結果は、HCVサブゲノムレプリコンの染色を示す。 図5 trong> HLFの処理の24時間後のHCV染色強度の約50％の質的低下を明らかにしています。このサブゲノムレプリコンシステムは、HLFの一般に受け入れられている薬理学的標的であり、HCV E1およびE2エンベロープ糖タンパク質を、欠けているように、これは興味深い観察です。 HCV染色の退色との併用は、HLFの蓄積は、2時間後に検出されるようになった、と強いHLFの蓄積は24時間後に観察されました。
落射蛍光顕微鏡の原理図1。顕微鏡のこのタイプでは、励起フィルターは（蛍光標識抗体を保有する織物博物館や細胞）試料を励起する特定波長を選択します。また、発光フィルターは、試料を標識するために使用されるフルオロフォアの発光スペクトル特性と一致するように選択されます。ロード/ 53053 / 53053fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
共焦点顕微鏡の原理図2。顕微鏡のこのタイプは、焦点外の光信号を除去するために、発光ピンホールを使用しています。焦点面に非常に近い蛍光によって生成された光のみを検出することができるので、画像の光学解像度は、落射蛍光顕微鏡のそれよりもはるかに優れています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
間接および直接免疫蛍光の図3の回路図。直接免疫蛍光法が含まれます目的の分子（一次抗体）に特異的である蛍光色素で標識された抗体の一種類のみ。これとは対照的に、間接免疫蛍光法は、非標識一次抗体の種に固有の蛍光色素で標識した二次抗体を必要とします。複数の二次抗体は、蛍光シグナルを増加させ、各一次抗体に付加することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
外因性HLFの図4.肝細胞の取り込み。ホ-7細胞を、24時間、0μMまたは3μMのHLFで処理された二回洗浄し、5分間のトリプシン処理に提出し、18時間のために再付着させ、免疫蛍光法に供しました。核はワット染色しました、プラズマ膜は、WGA（グリーンチャンネル）とHLFで標識したi番目のDAPI（青チャネル）は、抗HLF抗体（赤チャンネル）で染色しました。画像は、60倍の元の倍率で共焦点顕微鏡により得ました。水平光学断面は、セルの中央の厚さを表します。スケールバーは10μm。 （11）から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5 HLF処置はHCV染色を減少させる。HCVサブゲノムレプリコンの複製を支持するHuh-7細胞を、0,2、または24時間、3μMHLFで処理し、免疫蛍光に供しました。核はDAPI（青チャネル）で染色した、HCV抗NS5A抗体（赤チャンネル）によって明らかにされたとHLFは、抗HLF Aで染色しましたntibody（グリーンチャンネル）。画像は60倍の倍率で、元の落射蛍光顕微鏡で取得しました。スケールバーは10μm。 （11）から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
HCVの流行は、肝硬変、肝不全や肝細胞癌の危険にそれらを置くこと、新たに感染した患者の80％が慢性感染症を発症して、世界的な脅威のまま。最近2 NS3 N末端プロテアーゼ阻害剤（ボセプレビルおよびテラプレビル）の規制当局の承認によって実証されるようにHCV複製および成熟をターゲットに直接作用型抗ウイルス剤は、プライム抗HCV剤を表します。 HLF抗HCV活性は、現在、ビリオンを循環し、その肝細胞標的に侵入するのを防止する結合、ウイルス侵入阻害剤として挙動すると考えられています。 HLFの我々の研究は、（細胞外ビリオンの中和は異なる）新規の作用、細胞内の抗HCV 機構 7 を提示します。
免疫蛍光を効率的に生物学的サンプル中の標的分子の分布および/または局在化を可視化するために使用することができます。他の多くの蛍光技術、主要なプロの1に見られるように免疫蛍光法に関連したblemsは、（蛍光色素の光化学破壊）8を光退色されます。光退色に起因する活性の損失は、光退色または強度または露光の時間スパンを減らすことによってより少ない傾向があり、より堅牢な蛍光色素を使用することによってのいずれかで回避することができます。抗体は、細胞膜を横切ることができないので、免疫蛍光法は、一般的に固定された細胞にのみ限定されます。生細胞におけるタンパク質の分布/局在化を監視するための別のアプローチは、従って、一般に、緑色蛍光タンパク質（GFP）9と蛍光タンパク質ドメインを含むタンパク質の発現に依存しています。しかし、このようなGFPエピトープの付加はしばしば、タンパク質の局在化及び活性の改変に関連しています。免疫蛍光は、それがまた頻繁に監視するために使用される組織切片、培養細胞株、または個々の細胞を含む種々のサンプル数にも使用することができタンパク質、グリカン、および小分子の局在/分布。この技術の主な利点は、その単純さと、それが蛍光染色（例えば、DNA染色）の他、非抗体法と組み合わせて使用することができるという事実に存在します。また、商業的に製造した二次抗体は、色の広大な配列で、比較的安価で入手できます。
現在の研究では、HCVサブゲノムレプリコンをサポートする肝細胞の免疫蛍光は、HLFで処理して、HCVの染色強度の質的低下を明らかにしました。このサブゲノムレプリコンシステムは、HLFの一般に受け入れられている薬理学的標的であり、HCV E1およびE2エンベロープ糖タンパク質を、欠けているように、これは興味深い観察です。細胞外のビリオンの中和活性とは異なり、HLFは、ウイルス複製を損なうために、HCVに感染した肝細胞によって内在化される必要があります。 fuorescence顕微鏡の使用は、私たちはevaluを許可この可能性を食べました。 HCVに感染した肝細胞のプレインキュベーションの際に、外因性HLFが正常に内在化し、細胞内のウイルスの複製を損なうことが示されました。この小説HLF抗ウイルス活性を理解することは、この自然免疫タンパク質の阻害のグローバル（および多面的な可能性が高い）のメカニズムの理解に一歩前進を構成しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
- Odell, I. D., Cook, D.
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A.
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
- Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Green Remington, S. J.
