Abstract
L'immunofluorescence est une technique de laboratoire couramment utilisés pour étudier de nombreux aspects de la biologie. Il est généralement utilisé pour visualiser la distribution et / ou la localisation d'une molécule cible dans des cellules et des tissus. Immunofluorescence repose sur la spécificité des anticorps marqués par fluorescence contre leurs antigènes correspondants au sein d'une cellule. Les deux approches directes et indirectes immunofluorescence peuvent être utilisés qui reposent sur l'utilisation d'anticorps liés à un fluorochrome. L'immunofluorescence directe est moins fréquemment utilisé, car il fournit le signal inférieur, implique un coût plus élevé et moins de flexibilité. En revanche, l'immunofluorescence indirecte est plus couramment utilisé en raison de sa haute sensibilité et fournit un signal amplifié depuis plus d'un anticorps secondaire peut se rattacher à chaque anticorps primaire. Dans ce manuscrit, à la fois microscopie à épifluorescence et microscopie confocale ont été utilisés pour contrôler l'internalisation de la lactoferrine humaine, un élément important de la réponse immunitairesystème, dans les cellules hépatiques. De plus, nous avons surveillé le potentiel d'inhibition de la hLF sur la réplication intracellulaire du virus de l'hépatite C par immunofluorescence. Aussi bien les avantages et les inconvénients associés à ces approches sont discutées.
Protocol
1. Les cellules élaboration et au traitement
- Dans une plaque de 24 puits, mettre un couvercle de verre au fond des puits. Laver chaque puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Semences Huh-7 cellules de soutien réplicon sub-génomique du VHC dans chaque puits à une densité de 5 x 10 4 cellules / puits. En l'absence de traitement à faire, les cellules peuvent être ensemencées à une densité plus élevée. Le milieu de culture est du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de Foetal Bovine Serum (FBS), 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM et 250 mg / ml de G-418 (pour maintenir le réplicon).
- Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Le lendemain, traiter les cellules avec 3 uM de hLF purifiée à partir de lait maternel humain.
2. Paraformaldéhyde / Préparation saccharose (12% PAF et 12% de saccharose)
- Mettre 500 ml de PBS dans un bêcher et chauffer entre 20 ° C et 30 ° C. Dissoudre 60 g de saccharose dans le PBS. Dissoudre 60 g de Paraformalhyde (PAF) dans le / solution de saccharose PBS. Ajouter lentement NaOH 2N (3 à 7 ml) jusqu'à ce qu'une solution claire est obtenue.
- Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Complète le volume à 500 ml avec du PBS. Filtrez par gravité sur filtre Whatman. Avant l'emploi, diluer la solution avec du PBS à une concentration finale de 4% et de PAF 4% de saccharose (de stockage 4 ° C pendant 1 semaines maximum).
3. immunofluorescence
- Au moment voulu (0 h, 2 h ou 24 h de traitement), laver deux fois les cellules (1 min) avec du PBS et on fixe avec du PBS / 4% PAF / 4% de saccharose pendant 20 min à température ambiante. Les cellules sont généralement à 30-40% de confluence et de 1,5x10 5 cellules sont utilisées.
- Perméabiliser les cellules avec 0,15% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et le bloc de 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS pendant 20 min.
- Diluer l'anticorps primaire de la protéine d'intérêt dans 10% de NGS (exemple: souris anti-anticorps primaire hLF dilué à 1: 1000). Appliquer l'anticorps primaire pour les cellules.
- Après 4 heures à température ambiante ou O /N à 4 ° C, laver les cellules trois fois pendant 5 min avec 10% de NGS. Colorer les cellules avec un anticorps secondaire marqué avec un fluorochrome dilué dans 10% de NGS (exemple: fluorochrome avec la longueur d'onde d'excitation de 488 nm lié à un anticorps anti-souris 1: 1000) pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver les cellules une fois pendant 5 min avec du PBS et colorer les cellules avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 ug / ml) pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver les cellules deux fois pendant 5 min avec du PBS. Placer le couvercle sur les verres SlowFade milieu de montage avant la visualisation au microscope. Les cellules sont maintenant prêts pour l'analyse par épifluorescence ou microscopie confocale.
- Utiliser différentes commandes pour assurer la spécificité de la détection. Par exemple, tous les anticorps peuvent être omis dans le but de détecter autofluorescence. L'anticorps primaire peut être omis afin de déterminer la coloration non spécifique par l'anticorps secondaire. Enfin, si possible, contrôle de cellules ou de tissus qui ne sont pasexprimer la molécule d'intérêt peut également être utilisé.
- Visualisez les échantillons en utilisant un microscope à fluorescence appropriée (à épifluorescence ou confocale) et jeux de filtres appropriés pour le marqueur fluorescent utilisé. Diapositives peut également être stocké dans une boîte de diapositives à <-20 ° C pour un examen ultérieur.
4. microscopie à fluorescence
- Conserver les échantillons dans l'obscurité pour éviter photoblanchiment. Allumez la source de lumière du microscope choisi (épifluorescence ou confocale).
- Allumez le microscope. Allumez l'appareil photo pour le microscope. Mettez la lame sur le microscope pour la visualisation. Ajouter de l'huile d'immersion sur le tiroir pour augmenter l'ouverture numérique de la lentille d'objectif.
- Sélectionnez les filtres appropriés. Ajuster le focus et l'objectif approprié. Ajustez les volets afin de détecter le fluorochrome approprié, mais éviter photoblanchiment. Gardez plafonniers hors de minimiser fond clair quand on regarde l'échantillon.
- Changer efiltres électroniques de visualiser différents fluorochromes (par exemple DAPI et pour une longueur d'onde d'excitation de 488 nm). Prenez des photos avec l'appareil photo.
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Representative Results
La capacité de la lignée de cellules Huh-7 hépatique administrée de manière exogène à internaliser hLF a été surveillée en utilisant une immunofluorescence sur Miscroscope confocale. hLF a été ajouté au milieu de culture et l'internalisation a été laissé pendant 24 heures, après quoi, la hLF extracellulaire a été lavée avec du PBS et la membrane résiduel lié hLF a été dégradé avec un traitement à la trypsine 5 min (1 ml). Les cellules ont été réensemencées et autorisés à ré-adhérer pendant 18 heures avant d'immunofluorescence. Afin de souligner les limites cytoplasmiques, les membranes des cellules ont été colorées avec le germe de blé agglutinine (WGA) fluorochrome d'une longueur d'onde d'excitation de 488 nm conjugué. La coloration a été réalisée en utilisant la hLF un anticorps primaire anti-hLF et un fluorochrome avec la longueur d'onde de 633 nm liée à l'anticorps secondaire. Afin de déterminer la localisation précise de la hLF, les cellules ont été imagées suivante séquentielle de 0,5 um section horizontale par microscopie confocale. La figure 4 présente un optsection ical correspondant à l'épaisseur mi-cellule. Après l'addition exogène de hLF, une quantité importante de hLF a été détectée à l'intérieur du cytoplasme des hépatocytes. Aucune hLF a été observée à l'intérieur des cellules non traitées en utilisant les paramètres instrumentales identiques. Ensemble, ces données confirment que les hépatocytes ont la capacité d'acquérir hLF de leur environnement extracellulaire.
La capacité de la hLF à inhiber la réplication intracellulaire du VHC a ensuite été surveillée en utilisant la microscopie à épifluorescence. Cellules Huh-7 réplicon sub-génomique du VHC de support (exprimant NS3 du HCV, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B protéines) ont été traités avec la replication 3 0 uM pour la hLF, 2 ou 24 heures. La coloration double immunofluorescence pour des protéines HLF et le VHC NS5A a été analysée par microscopie à épifluorescence. Ces résultats indiquent que le VHC réplicon subgénomique de coloration (mesurée par immunofluorescence du VHC protéine non structurale 5A) a été réduite dans les cellules traitées avec la hLF. Figure 5 trong> qualitative révèle une réduction d'environ 50% à VHC intensité de coloration après 24 h de traitement hLF. Cette observation est intéressante car ce système de réplicon subgénomique qui manque VHC E1 et E2 glycoprotéines d'enveloppe, qui sont les cibles pharmacologiques communément acceptées de la hLF. Parallèlement à l'affaiblissement du VHC coloration, l'accumulation hLF a commencé à être détectée après 2 h, et l'accumulation hLF forte a été observée après 24 h.
Figure 1. Principe de la microscopie à épifluorescence. Dans ce type de microscopie, les filtres d'excitation sélectionner la longueur d'onde spécifique qui excite l'échantillon (Tissus ou cellules portant des anticorps marqués par fluorescence). En outre, les filtres d'émission sont choisis en fonction des caractéristiques spectrales d'émission du fluorophore utilisé pour étiqueter l'échantillon.Charge / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Principe de microscopie confocale. Ce type de microscopie utilise un trou d'épingle d'émission pour éliminer signal hors-focus lumière. Depuis que la lumière produite par fluorescence très proche du plan focal peut être détectée, la résolution optique de l'image est bien meilleure que celle des microscopes à épifluorescence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Schéma de l'immunofluorescence indirecte et directe. L'immunofluorescence directe impliqueun seul type d'anticorps marqué par un fluorochrome spécifique à la molécule d'intérêt (l'anticorps primaire). En revanche, l'immunofluorescence indirecte implique anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes qui sont spécifiques à l'espèce de l'anticorps primaire non marqué. Plus d'un anticorps secondaire peut se rattacher à chaque anticorps primaire qui augmente le signal de fluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. hépatocellulaire absorption des cellules Huh-7 exogènes hLF. Ont été traités avec 0 uM ou 3 uM hLF pendant 24 heures, lavé deux fois, soumise à un traitement à la trypsine 5 min, on laisse de nouveau adhérer pendant 18 heures et soumis à une immunofluorescence. Les noyaux ont été colorés avecième DAPI (canal bleu), les membranes plasmiques ont été marquées avec WGA (canal vert) et la hLF a été coloré avec un anticorps anti-hLF (canal rouge). Les images ont été acquises par microscopie confocale à un grossissement original de 60x. Les sections optiques horizontales représentent la mi-épaisseur des cellules. La barre d'échelle, 10 um. Modifié à partir de (11). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. hLF traitement réduit la coloration VHC. Cellules Huh-7 supportant la réplication du VHC réplicon subgénomique de ont été traitées avec 3 uM de hLF 0, 2, ou 24 h et soumis à immunofluorescence. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (canal bleu), le VHC a été révélée par un anticorps anti-NS5A (canal rouge) et a été coloré avec la hLF un anti-hLF unntibody (canal vert). Les images ont été acquises par microscopie à épifluorescence à un grossissement original de 60x. La barre d'échelle, 10 um. Modifié à partir de (11). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'épidémie de VHC demeure une menace mondiale, avec 80% des patients nouvellement infectés en développement une infection chronique, les mettant à risque de cirrhose, l'insuffisance hépatique ou carcinome hépatocellulaire. Action directe des agents antiviraux ciblant la réplication du VHC et de la maturation représentent premiers agents anti-VHC, comme l'a récemment démontré par l'approbation réglementaire de deux inhibiteurs de la protéase NS3 extrémité N-terminale (bocéprévir et télaprévir). L'activité anti-VHC hLF pense actuellement de se comporter comme un inhibiteur de l'entrée virale, la liaison de circulation des virions et les empêchant de pénétrer dans leur cible hépatocellulaire. Notre recherche sur la hLF présente un nouveau mécanisme intracellulaire anti-VHC de l'action (distinct du virion extracellulaire neutralisation) 7.
L'immunofluorescence peut être efficacement utilisé pour visualiser la distribution et / ou la localisation d'une molécule cible dans un échantillon biologique. Comme l'a constaté dans de nombreuses autres techniques de fluorescence, l'un des principaux problèmes associés à immunofluorescence est Photobleaching (destruction photochimique du fluorochrome) 8. Cette perte d'activité causée par photoblanchiment peut être contournée, soit en employant des fluorochromes plus robustes qui sont moins sujettes au photoblanchiment ou en réduisant l'intensité ou laps de temps d'exposition de la lumière. En outre, étant donné que les anticorps ne peuvent pas traverser la membrane cellulaire, l'immunofluorescence est généralement limitée à seulement des cellules fixées. D'autres approches pour contrôler la distribution / localisation de protéines dans des cellules vivantes compter donc généralement sur l'expression de protéines contenant des domaines de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) 9. Cependant, l'addition de tels epitopes GFP est parfois associée à une modification dans la localisation et l'activité des protéines. Immunofluorescence peut également être utilisée sur un certain nombre de différents échantillons, y compris des coupes de tissus, de culture des lignées cellulaires ou des cellules individuelles, il est également fréquemment utilisé pour surveillerla localisation / distribution des protéines, des glycanes, et de petites molécules. Les principaux avantages de cette technique résident dans sa simplicité et le fait qu'il peut être utilisé en combinaison avec d'autres méthodes non-anticorps de coloration fluorescente (par exemple, coloration de l'ADN). En outre, les anticorps secondaires produites dans le commerce sont relativement peu coûteux et disponible dans une vaste gamme de couleurs.
Dans la présente étude, l'immunofluorescence des cellules hépatiques de support réplicon subgénomique de VHC a révélé une réduction qualitative de l'intensité de coloration du VHC lors d'un traitement avec la hLF. Cette observation est intéressante car ce système de réplicon subgénomique qui manque VHC E1 et E2 glycoprotéines d'enveloppe, qui sont les cibles pharmacologiques communément acceptées de la hLF. Contrairement à l'activité de neutralisation virion extracellulaire, hLF devrait être intériorisé par les hépatocytes infectés par le VHC en vue de nuire à la réplication virale. L'utilisation de la microscopie Fuorescence nous a permis de Évalumangé cette possibilité. Après la pré-incubation sur des hépatocytes infectés par le VHC, a été internalisé exogène hLF avec succès, et représenté à altérer la replication virale intracellulaire. La compréhension de cette nouvelle activité antivirale hLF constitue un pas en avant dans la compréhension du mécanisme (pléiotropique et probable) mondiale de l'inhibition de cette protéine de l'immunité innée.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
- Odell, I. D., Cook, D.
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A.
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
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- Green Remington, S. J.
