Abstract
Immunofluorescentie is een laboratorium techniek die vaak gebruikt om vele aspecten van de biologie te bestuderen. Het wordt meestal gebruikt om de verdeling en / of lokalisatie van een doelwitmolecuul in cellen en weefsels zichtbaar. Immunofluorescentie gebaseerd op de specificiteit van fluorescent-gelabelde antilichamen tegen het overeenkomstige antigeen in een cel. Zowel directe als indirecte immunofluorescentie benaderingen kunnen worden toegepast die gebaseerd zijn op het gebruik van antilichamen gekoppeld aan een fluorochroom. Directe immunofluorescentie wordt minder vaak gebruikt omdat het lagere signaal impliceert hogere kosten en minder flexibiliteit. Daarentegen wordt indirecte immunofluorescentie vaker gebruikt vanwege de hoge gevoeligheid en levert een versterkt signaal aangezien meerdere secundair antilichaam kan hechten aan elke primaire antilichaam. In dit manuscript werden beide epifluorescentie microscopie en confocale microscopie gebruikt om de internalisering van menselijk lactoferrine, een belangrijke component van de immune bewakensysteem, in de levercellen. Bovendien hebben we bewaakt de remmende potentie van hLF de intracellulaire replicatie van het hepatitis C virus middels immunofluorescentie. Zowel de voor- en nadelen verbonden aan deze benaderingen besproken.
Protocol
1. Cellen Voorbereiding en behandeling
- In een 24-wells plaat, zet een glazen deksel aan de onderzijde van de putjes. Was elke well met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Seed Huh-7 cellen ondersteunen subgenomische HCV replicon in elk putje tot een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / putje. Als er geen behandeling te doen, kunnen de cellen worden gezaaid met een hogere dichtheid. Het kweekmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat en 250 mg / ml G-418 (om het replicon te handhaven).
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2. De volgende dag, de behandeling van de cellen met 3 uM van hLF gezuiverd uit menselijke melk.
2. paraformaldehyde / Sucrose preparaat (12% PAF en 12% sucrose)
- Put 500 ml PBS in een bekerglas en verwarm het tussen 20 ° C en 30 ° C. Los 60 g sucrose in PBS. Los 60 g paraformaldehyde (PAF) in de PBS / sucrose-oplossing. Voeg langzaam NaOH 2N (3-7 ml) totdat een heldere oplossing wordt verkregen.
- Stel de pH tot 7,4 met HCl. Compleet volume met 500 ml PBS. Filteren door de zwaartekracht op Whatman filter. Verdun voor gebruik de oplossing met PBS tot een eindconcentratie van 4% PAF en 4% sucrose (Storage 4 ° C gedurende 1 week maximum).
3. Immunofluorescentie
- Op het gewenste tijdstip (0 uur, 2 uur of 24 uur van de behandeling), wassen cellen tweemaal (1 min) met PBS en bevestig met PBS / 4% PAF / 4% sucrose gedurende 20 min bij kamertemperatuur. De cellen worden kenmerkend bij 30-40% confluentie en 1.5X10 5 cellen gebruikt.
- Permeabilize de cellen met 0,15% triton X-100 in PBS gedurende 5 min bij kamertemperatuur en blok in 10% normaal geit serum (NGS) in PBS gedurende 20 min.
- Verdun het primaire antilichaam van het eiwit van interesse 10% NGS (bijvoorbeeld: primaire muizen anti-hLF antilichaam verdund 1: 1000). Breng het primaire antilichaam aan de cellen.
- Na 4 uur bij kamertemperatuur of O /N bij 4 ° C, was de cellen drie keer gedurende 5 min met 10% NGS. Vlekken op de cellen met secundair antilichaam gemerkt met fluorochroom verdund in 10% NGS (voorbeeld: fluorochroom met een excitatiegolflengte van 488 nm gekoppeld aan een antilichaam anti-muis 1: 1000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de cellen eenmaal gedurende 5 min met PBS en vlekken op de cellen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 ug / ml) gedurende 15 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de cellen tweemaal gedurende 5 min met PBS. Mount dekken bril op SlowFade montage medium voor visualisatie door middel van microscopie. De cellen zijn nu klaar voor analyse door epifluorescentie of confocale microscopie.
- Gebruik verschillende controles om de specificiteit van de detectie te garanderen. Zo kunnen alle antilichamen worden weggelaten om autofluorescentie detecteren. Het primaire antilichaam kan worden weggelaten om de niet-specifieke kleuring van het secundaire antilichaam te bepalen. Tenslotte, indien mogelijk, controle cellen of weefsels die nietdrukken het molecuul van belang kan ook worden gebruikt.
- Visualiseer de monsters met behulp van passende fluorescentiemicroscoop (epifluorescentie of confocale) en filter sets geschikt is voor de fluorescent label gebruikt. Slides kunnen ook worden opgeslagen in een dia doos op <-20 ° C voor later onderzoek.
4. Fluorescentie Microscopie
- Laat de monsters in het donker fotobleken voorkomen. Schakel de lichtbron van de gekozen microscoop (epifluorescentie of confocale).
- Schakel de microscoop. Schakel de camera voor de microscoop. Zet de schuif op de microscoop voor visualisatie. Voeg immersie olie op de dia om de numerieke apertuur van het objectief te vergroten.
- Selecteert u de juiste filters. Pas focus en de juiste doelstelling. Pas de luiken om de juiste fluorochroom te sporen, maar fotobleking voorkomen. Houd overhead lichten uit op de achtergrond licht te minimaliseren als we kijken naar het monster.
- Verandering the filters verschillende fluorochromen (bijvoorbeeld DAPI en een excitatie golflengte van 488 nm) te visualiseren. Neem foto's met de camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen van de lever Huh-7 cellijn te internaliseren exogeen toegediende hLF werd gevolgd met behulp van immunofluorescentie op een confocale miscroscope. hLF werd aan het kweekmedium toegevoegd en de internalisatie liet men gedurende 24 uur, waarna werd extracellulair hLF gewassen met PBS en overgebleven membraangebonden hLF werd afgebroken met een 5 min trypsine behandeling (1 ml). De cellen werden opnieuw uitgezet en liet opnieuw hechten 18 uur voor immunofluorescentiekleuring. Om het cytoplasmatische grenzen aangeven, werden de cellen membranen gekleurd met tarwekiem agglutinine (WGA) fluorochroom van een excitatiegolflengte van 488 nm conjugaat. Het hLF kleuring werd bereikt met behulp van een anti hLF-primair antilichaam en een fluorochroom met een golflengte van 633 nm in verband met het secundaire antilichaam. Om de precieze lokalisatie van hLF bepalen, werden cellen afgebeeld onderstaande opeenvolgende 0,5 urn horizontale doorsnede door confocale microscopie. Figuur 4 toont een optical doorsnede overeenkomt met mid-celdikte. Na de toevoeging van exogene hLF, een significante hoeveelheid hLF gedetecteerd in het cytoplasma van de hepatocyten. Geen hLF werd waargenomen in de behandelde cellen bij het gebruik van identieke instrumentale instellingen. Samen vormen deze gegevens bevestigen dat hepatocyten de capaciteit hebben om hLF verkrijgen uit hun extracellulaire omgeving.
Het vermogen van hLF te remmen de intracellulaire replicatie van HCV werd vervolgens gevolgd met epifluorescentie microscopie. Huh-7 cellen ondersteunen subgenomische HCV replicon (expressie HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B eiwitten) replicatie werden behandeld met 3 uM hLF voor 0, 2 en 24 uur. De dubbele immunofluorescentie kleuring voor hLF en HCV NS5A eiwitten werd geanalyseerd door epifluorescentie microscopie. Deze resultaten geven aan dat subgenome HCV replicon kleuring (gemeten met immunofluorescentie van de HCV niet structurele eiwit 5A) werd in cellen behandeld met hLF verminderd. Figuur 5 trong> onthult een kwalitatieve vermindering van ongeveer 50% in HCV kleurintensiteit na 24 h hLF behandeling. Dit is een interessante observatie dit subgenomische replicon systeem ontbreekt HCV E1 en E2 envelopglycoproteïnen, waarbij de algemeen aanvaarde farmacologische doelen van hLF zijn. Gelijktijdig met het verdwijnen van HCV kleuring, hLF accumulatie begon te worden gedetecteerd na 2 uur en sterke hLF accumulatie werd waargenomen na 24 uur.
Figuur 1. Principe van epifluorescentiemicroscopie. In dit type microscopie, excitatiefilters selecteert de specifieke golflengte waarin het monster (tissus of cellen die fluorescent gemerkte antilichamen) opwekt. Bovendien worden emissiefilters gekozen om de spectrale emissiekenmerken van de fluorofoor gebruikt om het monster te labelen passen.belasting / 53.053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Principe van confocale microscopie. Dit type microscopie maakt gebruik van een emissie pinhole om out-of-focus lichtsignaal elimineren. Sinds enige licht geproduceerd door fluorescentie zeer dicht bij de focal plane kan worden gedetecteerd, de optische resolutie van het beeld is veel beter dan die van epifluorescentie microscopen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Schematische voorstelling van de indirecte en directe immunofluorescentie. Directe immunofluorescentie impliceertslechts één type antilichaam gemerkt met een fluorochroom die specifiek is voor het molecuul van belang (primair antilichaam). Daarentegen indirecte immunofluorescentie omvat secundaire antilichamen gelabeld met fluorochromen die specifiek zijn voor de soort van het niet-gemerkte primaire antilichaam. Meer dan een secundair antilichaam kan hechten aan elke primaire antilichaam dat de fluorescentie-signaal vergroot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Hepatocellulaire opname van exogeen hLF. Huh-7 cellen werden behandeld met 0 pM of 3 pM hLF voor 24 uur, tweemaal gewassen met een 5 min trypsine behandeld, opnieuw mogen hechten 18 uur en onderworpen aan immunofluorescentie ingediend. Kernen werden gekleurd wet DAPI (blauwe kanaal), plasma membranen werden gemerkt met WGA (groene kanaal) en hLF werd gekleurd met een anti-hLF antilichaam (rode kanaal). Beelden werden overgenomen door confocale microscopie op een originele vergroting van 60x. De horizontale optische doorsneden vertegenwoordigt de halverwege de breedte van de cellen. Schaal bar, 10 micrometer. Gewijzigd ten opzichte van (11). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. hLF behandeling vermindert HCV kleuring. Huh-7 cellen ondersteunen subgenomische HCV replicon replicatie werden behandeld met 3 uM hLF voor 0, 2, of 24 uur en onderworpen aan immunofluorescentie. Kernen werden gekleurd met DAPI (blauwe kanaal), HCV werd onthuld door een anti-NS5A-antilichaam (rood kanaal) en hLF werd gekleurd met anti-a hLFntibody (groene kanaal). Beelden werden overgenomen door epifluorescentiemicroscopie op een originele vergroting van 60x. Schaal bar, 10 micrometer. Gewijzigd ten opzichte van (11). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De HCV-epidemie blijft een wereldwijde bedreiging, met 80% van de nieuw geïnfecteerde patiënten ontwikkelen een chronische infectie, waardoor ze het risico van cirrose, leverfalen of leverkanker. Direct werkende antivirale middelen gericht replicatie en rijping HCV vertegenwoordigen prime anti-HCV middelen, zoals onlangs aangetoond door de goedkeuring van twee NS3 N-terminus proteaseremmers (Boceprevir en Telaprevir). Het hLF anti-HCV-activiteit wordt momenteel verondersteld zich te gedragen als een virale binnenkomst remmer, bindende circulerende virionen en voorkomen dat ze uit het aangaan van hun hepatocellular doel. Ons onderzoek op hLF presenteert een nieuwe intracellulaire anti-HCV werkingsmechanisme (onderscheiden van extracellulaire virion neutralisatie) 7.
Immunofluorescentie efficiënt worden gebruikt om de verdeling en / of lokalisatie van een doelmolecuul visualiseren in een biologisch monster. Zoals in vele andere fluorescentietechnieken, een van de belangrijkste problemen geassocieerd met immunofluorescentie is fotobleken (fotochemische afbraak van de fluorochroom) 8. Dit verlies aan activiteit veroorzaakt door fotobleken kan ofwel worden omzeild door gebruik robuuster fluorochromen die minder gevoelig zijn voor fotobleken of door de intensiteit of de tijdspanne van blootstelling aan licht. Aangezien antilichamen het celmembraan niet kan passeren, immunofluorescentie is meestal beperkt tot gefixeerde cellen. Alternatieve benaderingen volgen de verdeling / lokalisatie van eiwitten in levende cellen derhalve in het algemeen vertrouwen op de expressie van eiwitten die fluorescerend eiwitdomeinen zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) 9. Echter, de toevoeging van dergelijke GFP epitopen soms gepaard met een wijziging van de lokalisatie en activiteit van eiwitten. Immunofluorescentie kan ook gebruikt worden op een aantal verschillende monsters zoals weefselsecties, gekweekte cellijnen, of individuele cellen wordt ook vaak gebruikt om te controlerende lokalisatie / verdeling van eiwitten, glycanen, en kleine moleculen. De belangrijkste voordelen van deze techniek het verblijf op zijn eenvoud en het feit dat het kan worden gebruikt in combinatie met andere niet-antilichaam methoden van fluorescentie kleuring (bijvoorbeeld DNA-kleuring). Bovendien commercieel geproduceerde secundaire antilichamen zijn relatief goedkoop en verkrijgbaar in een breed scala aan kleuren.
In de huidige studie, immunofluorescentie van levercellen ondersteuning van een subgenomisch HCV replicon onthulde een kwalitatieve verlaging van het HCV kleurintensiteit na behandeling met hLF. Dit is een interessante observatie dit subgenomische replicon systeem ontbreekt HCV E1 en E2 envelopglycoproteïnen, waarbij de algemeen aanvaarde farmacologische doelen van hLF zijn. In tegenstelling tot de extracellulaire virion neutralisatie activiteit hLF zouden moeten worden geïnternaliseerd door HCV-geïnfecteerde hepatocyten om virale replicatie beïnvloeden. Het gebruik van fuorescence microscopie liet ons toe om evaluaten deze mogelijkheid. Na pre-incubatie op HCV-geïnfecteerde hepatocyten werd exogene hLF succesvol geïnternaliseerd, en naar intracellulaire virale replicatie beïnvloeden. Het begrijpen van deze roman hLF antivirale activiteit vormt een stap voorwaarts in het begrip van de wereldwijde (en waarschijnlijk pleiotrope) mechanisme van remming van dit aangeboren immuniteit eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
- Odell, I. D., Cook, D.
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A.
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
- Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Green Remington, S. J.
