Abstract
Immunfluoreszenz ist eine Labortechnik häufig verwendet, um viele Aspekte der Biologie zu studieren. Er wird üblicherweise verwendet, um die Verteilung und / oder die Lokalisierung eines Zielmoleküls in Zellen und Gewebe zu visualisieren. Immunfluoreszenz beruht auf der Spezifität von Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen die entsprechenden Antigene in der Zelle. Direkte und indirekte Immunofluoreszenz Ansätze können verwendet werden, die auf der Verwendung von Antikörpern, die mit einem Fluorochrom gebunden verlassen. Direkte Immunfluoreszenz wird seltener verwendet, da sie geringere Signal, mit höheren Kosten und weniger Flexibilität. Im Gegensatz dazu ist die indirekte Immunfluoreszenz mehr allgemein wegen seiner hohen Empfindlichkeit verwendet und liefert ein verstärktes Signal seit mehr als einem sekundären Antikörper kann an jeden primären Antikörper zu befestigen. In diesem Manuskript wurden sowohl Epifluoreszenzmikroskopie und konfokale Mikroskopie verwendet, um die Internalisierung von menschlichem Lactoferrin, eine wichtige Komponente der Immun überwachenSystem, in Leberzellen. Außerdem überwacht wir die Hemmpotenzial hLF auf die intrazelluläre Replikation des Hepatitis C-Virus mittels Immunfluoreszenz. Sowohl die Vorteile und Nachteile, die mit diesen Ansätzen verbunden sind, diskutiert.
Protocol
1. Zellen Vorbereitung und Behandlung
- In einer 24-Well-Platte, legte ein Glasabdeckung am Boden der Wells. Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Waschen Sie jede Vertiefung geben.
- Samen Huh-7 Zellen Stütz HCV subgenomische Replikon in jeder Vertiefung bis zu einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung. Wenn es keine Behandlung, um zu tun, können die Zellen in einer höheren Dichte ausgesät werden. Das Kulturmedium ist Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 250 mg / ml G-418 (um das Replikon zu erhalten) ergänzt.
- Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 am nächsten Tag zu behandeln, die Zellen mit 3 & mgr; M hLF aus menschlicher Milch gereinigt.
2. Paraformaldehyd / Saccharose-Herstellung (12% PAF und 12% Saccharose)
- Setzen 500 ml PBS in einem Becherglas und Wärme zwischen 20 ° C und 30 ° C. 60 g Saccharose in PBS. 60 g des paraformaldehyd (PAF) in PBS / Saccharose-Lösung. Langsam NaOH 2N (3-7 ml), bis eine klare Lösung erhalten wird.
- PH-Wert auf 7,4 mit HCl. Gesamte Volumen auf 500 ml mit PBS. Filter durch die Schwerkraft auf Whatman-Filter. Vor Gebrauch verdünnte die Lösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 4% PAF und 4% Saccharose (Lagerung 4 ° C für 1 Woche Maximum).
3. Immunfluoreszenz
- Zum gewünschten Zeitpunkt (0 h, 2 h oder 24 h der Behandlung), waschen Sie die Zellen zweimal (1 min) mit PBS und fixieren mit PBS / 4% PAF / 4% Saccharose für 20 min bei RT. Die Zellen werden typischerweise bei 30-40% Konfluenz und 1,5x10 5 Zellen verwendet werden.
- Permeabilisierung der Zellen mit 0,15% Triton X-100 in PBS für 5 min bei RT und Block in 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 20 min.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper des Proteins von Interesse in 10% NGS (Beispiel: primäre Maus-Anti-hLF Antikörper verdünnt 1: 1.000). Wenden Sie den primären Antikörper zu den Zellen.
- Nach 4 h bei RT oder O /N bei 4 ° C, waschen Sie die Zellen dreimal 5 min mit 10% NGS. Färben die Zellen mit Sekundärantikörper mit Fluorochrom in 10% NGS verdünnt markierten (Beispiel: Fluorochrom mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm auf einen Antikörper, anti-Maus-1 verbunden: 1000) für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Die Zellen werden einmal für 5 Minuten mit PBS und färben die Zellen, die mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 ug / ml) für 15 min bei RT im Dunkeln.
- Für 5 Minuten mit PBS waschen Sie die Zellen zweimal. Berg decken Gläser auf Slowfade Eindeckmedium vor Visualisierung durch Mikroskopie. Die Zellen sind nun bereit für die Analyse durch Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
- Verwenden Sie verschiedene Steuerelemente, um die Spezifität des Nachweises zu gewährleisten. Zum Beispiel können alle Antikörper, um die Autofluoreszenz zu detektieren weggelassen. Der primäre Antikörper weggelassen werden, um die nicht-spezifische Färbung mit dem sekundären Antikörper zu bestimmen. Schließlich, wenn möglich, zu steuern Zellen oder Gewebe, die nichtexprimieren das Molekül von Interesse kann auch verwendet werden.
- Visualisieren Sie die Proben unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzmikroskop (Epifluoreszenz oder konfokalen) und Filtersätze für die Fluoreszenzmarkierung verwendet angemessen. Dias können auch in einer Diashow Fach an <-20 ° C für die spätere Prüfung abgelegt werden.
4. Fluoreszenzmikroskopie
- Bewahren Sie die Proben in der Dunkelheit, um Photobleichung zu verhindern. Einschalten der Lichtquelle der ausgewählten Mikroskop (Epifluoreszenz oder konfokalen).
- Schalten Sie das Mikroskop. Einschalten der Kamera für das Mikroskop. Legen Sie die Folie unter dem Mikroskop auf Visualisierung. In Immersionsöl auf der Folie, um die numerische Apertur der Objektivlinse zu erhöhen.
- Wählen Sie die entsprechenden Filter. Stellen Sie den Fokus und entsprechende Ziel. Passen Sie die Fensterläden, um die entsprechenden Fluorochrom erkennen, sondern verhindern, Photobleichen. Halten Deckenbeleuchtung aus, um Hintergrundlicht zu minimieren, wenn man Probe.
- Th ändernE-Filter, um verschiedene Fluorochrome (zB DAPI und für eine Anregungswellenlänge von 488 nm) zu visualisieren. Nehmen Sie Bilder mit der Kamera.
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Representative Results
Die Fähigkeit der Leber Huh-7-Zelllinie exogen administrated hLF internalisiert wurde mittels Immunfluoreszenz auf einem konfokalen miscroscope überwacht. hLF wurde zu dem Kulturmedium zugegeben, und die Internalisierung wurde 24 h erlaubt, wonach wurde extrazelluläres hLF mit PBS gewaschen und restliche Membran gebunden hLF wurde mit einer 5 min Trypsinbehandlung (1 ml) abgebaut. Die Zellen wurden ausgesät und man ließ sie wieder halten 18 Stunden vor der Immunfluoreszenzfärbung. Um die cytoplasmatischen Grenzen beschreiben, wurden die Zellen Membranen mit Weizenkeim-Agglutinin (WGA) Fluorochrom einer Anregungswellenlänge von 488 nm Konjugat gefärbt. Die hLF-Färbung wurde unter Verwendung eines Anti-hLF primärer Antikörper und ein Fluorochrom mit einer Wellenlänge von 633 nm an den sekundären Antikörper gebunden erreicht. Um die genaue Lokalisierung der hLF bestimmen, wurden die Zellen nach einer sequentiellen 0,5 um Horizontalschnitt durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Figur 4 stellt eine optsche Querschnitt entsprechend der Mitte der Zellendicke. Nach der Zugabe von exogenem hLF wurde eine signifikante Menge an hLF Inneren Zytoplasma von Hepatozyten nachgewiesen. Kein hLF wurde in den unbehandelten Zellen bei Verwendung von identischen Instrumental Einstellungen beobachtet. Zusammen zeigen diese Daten bestätigen, dass Hepatozyten haben die Fähigkeit, hLF aus ihrer extrazellulären Umgebung zu erwerben.
Die Fähigkeit von hLF zur Hemmung der intrazellulären Replikation von HCV wurde als nächstes überwacht mit Epifluoreszenzmikroskopie. Huh-7-Zellen unterstützen HCV subgenomische Replikon (exprimierenden HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B-Proteine) Replikation wurden mit 3 & mgr; M hLF für 0, 2 bzw. 24 Stunden behandelt. Die Doppel-Immunfluoreszenzfärbung für hLF und HCV-NS5A-Proteine wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie analysiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass HCV subgenomische Replikon-Färbung (wie durch Immunfluoreszenz des HCV-Nichtstrukturprotein 5A gemessen) wurde in Zellen mit hLF behandelten reduziert. Figur 5 trong> zeigt eine qualitative Reduktion von ca. 50% in HCV Färbungsintensität nach 24 Stunden von hLF Behandlung. Dies ist eine interessante Beobachtung, da dieser subgenomischen Replikon-System fehlt HCV E1 und E2 Hüllenglykoproteine, die Glykoproteine, die die allgemein anerkannten pharmakologischen Ziele hLF sind. Gleichzeitig mit dem Ausbleichen des HCV-Färbung begann hLF Akkumulation nach 2 Stunden erfaßt werden und starke hLF Ansammlung wurde nach 24 h beobachtet.
Figur 1. Prinzip der Epifluoreszenzmikroskopie. Bei dieser Art von Mikroskopie Wählen Anregungsfilter der spezifischen Wellenlänge, die die Probe (tissus oder Zellen, die Fluoreszenz-markierten Antikörper) anregt. Außerdem sind die Emissionsfilter so gewählt, daß die spektralen Emissionseigenschaften des Fluorophor verwendet, um die Probe zu kennzeichnen lassen.Last / 53.053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Prinzip der konfokalen Mikroskopie. Diese Art der Mikroskopie verwendet einen Emissions Pinhole, um out-of-focus Lichtsignal zu beseitigen. Da nur Licht durch Fluoreszenz ganz in der Nähe der Brennebene erzeugt nachgewiesen werden kann, ist die optische Auflösung des Bildes deutlich besser als die von Epifluoreszenz-Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Schematische Darstellung der indirekten und direkten Immunfluoreszenz. Direkte Immunfluoreszenz beinhaltetnur eine Art von Antikörper mit einem Fluorochrom, die spezifisch für das Molekül von Interesse (primärer Antikörper) markiert ist. Im Gegensatz dazu beinhaltet die indirekte Immunfluoreszenz Sekundärantikörper mit Fluorochromen, die spezifisch für die Spezies des nicht-markierten primären Antikörper markiert sind. Mehr als ein sekundärer Antikörper kann an jedem primären Antikörpers, der das Fluoreszenzsignal erhöht befestigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. hepatozelluläre Aufnahme von exogenem hLF. Huh-7-Zellen wurden mit 0 & mgr; M bis 3 & mgr; M hLF 24 h lang behandelt, zweimal gewaschen, zu einem 5 min Trypsinbehandlung erlaubt neu anhaften 18 h und der Immunfluoreszenz unterworfen vorgelegt. Die Kerne wurden w gebeiztith DAPI (blauer Kanal), wurden die Plasmamembranen mit WGA (grünen Kanal) und hLF markiert war, mit einem Anti-Antikörper hLF (roter Kanal) gefärbt. Die Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie bei einer ursprünglichen Vergrößerung von 60x erworben. Die horizontalen optischen Querschnitte stellen die Mitte der Dicke der Zellen. Maßstabsleiste, 10 & mgr; m. Geändert von (11). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. hLF Behandlung reduziert HCV-Färbung. Huh-7-Zellen unterstützen HCV subgenomische Replikon Replikation wurden mit 3 & mgr; M hLF für 0, 2, oder 24 Stunden behandelt und auf Immunfluoreszenz unterzogen. Kerne wurden mit DAPI (blauer Kanal) wurde HCV durch einen anti-NS5A-Antikörper (roter Kanal) offenbart und hLF wurde mit einem Anti-hLF a beflecktntibody (grüner Kanal). Bilder wurden durch Epifluoreszenzmikroskopie bei einer ursprünglichen Vergrößerung von 60x erworben. Maßstabsleiste, 10 & mgr; m. Geändert von (11). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die HCV-Epidemie bleibt eine globale Bedrohung, mit 80% der neu infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, indem sie mit einem Risiko für Leberzirrhose, Leberversagen oder Leberzellkarzinom. Direkt wirkende antivirale Mittel Targeting HCV-Replikation und Reifung stellen erstklassige Anti-HCV-Mittel, wie kürzlich von der behördlichen Genehmigung von zwei NS3 N-Terminus-Protease-Inhibitoren (Boceprevir und Telaprevir) demonstriert. HLF anti-HCV-Aktivität wird derzeit angenommen, dass als das Eindringen des Virus Inhibitor verhält Bindung zirkulierender Virionen und vom Eintritt in die hepatozelluläre Ziel hindert. Unsere Forschung an hLF präsentiert eine neuartige intrazellulären Anti-HCV-Wirkmechanismus (die sich von der extrazellulären Virionen-Neutralisation) 7.
Immunfluoreszenz kann effizient verwendet werden, um die Verteilung und / oder die Lokalisierung eines Zielmoleküls in einer biologischen Probe zu visualisieren. Wie in vielen anderen Fluoreszenztechniken gefunden, eine der wichtigsten probleme mit Immunfluoreszenz verbundene Photobleaching (photochemische Zerstörung des Fluorochrom) 8. Dieser Verlust an Aktivität durch Photobleichung verursacht werden, können entweder durch die Verwendung robuster Fluorochrome, die weniger anfällig gegen Ausbleichung oder durch Verringerung der Intensität oder der Zeitspanne der Belichtung sind, umgangen werden. Darüber hinaus, da Antikörper nicht die Zellmembran durchqueren, Immunofluoreszenz wird in der Regel nur an fixierten Zellen beschränkt. Alternative Ansätze, um die Verteilung / Lokalisierung von Proteinen in lebenden Zellen zu überwachen daher im Allgemeinen verlassen sich auf die Expression von Proteinen mit fluoreszierenden Proteindomänen wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) 9. Jedoch ist der Zusatz solcher GFP Epitope manchmal mit einer Änderung in der Lokalisierung und Aktivität von Proteinen assoziiert. Immunofluoreszenz können auch auf eine Reihe von verschiedenen Proben, einschließlich Gewebeschnitten, kultivierten Zelllinien oder einzelner Zellen verwendet werden kann, wird auch häufig verwendet, um zu überwachendie Lokalisierung / Verteilung von Proteinen, Glykane und kleine Moleküle. Die Hauptvorteile dieser Technik liegen in ihrer Einfachheit und der Tatsache, dass sie in Kombination mit anderen, Nicht-Antikörper-Verfahren zur Fluoreszenzfärbung (zB DNA-Färbung) verwendet werden. Darüber hinaus sind kommerziell hergestellten Sekundärantikörper relativ preiswert und in einer Vielzahl von Farben erhältlich.
In der aktuellen Studie, Immunfluoreszenz von Leberzellen Unterstützung einer HCV subgenomische Replikon ergab eine qualitative Reduktion der HCV-Färbungsintensität bei Behandlung mit hLF. Dies ist eine interessante Beobachtung, da dieser subgenomischen Replikon-System fehlt HCV E1 und E2 Hüllenglykoproteine, die Glykoproteine, die die allgemein anerkannten pharmakologischen Ziele hLF sind. Im Gegensatz zu der extrazellulären Virionen-Neutralisationsaktivität würde hLF müssen von HCV-infizierten Leberzellen, um die virale Replikation beeinträchtigt internalisiert werden. Die Verwendung von fuorescence Mikroskopie konnten wir Evaluaß diese Möglichkeit. Nach Vorinkubation von HCV-infizierten Hepatozyten wurde exogene hLF erfolgreich verinnerlicht, und gezeigt, dass die intrazelluläre virale Replikation beeinträchtigen. Das Verständnis dieses Romans hLF antivirale Aktivität ist ein Schritt nach vorn in das Verständnis der globalen (und wahrscheinlich pleiotrope) Mechanismus der Hemmung der angeborenen Immunität Protein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
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- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
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- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
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