Abstract
La inmunofluorescencia es una técnica de laboratorio utilizada para estudiar muchos aspectos de la biología. Normalmente se utiliza para visualizar la distribución y / o localización de una molécula diana en células y tejidos. La inmunofluorescencia se basa en la especificidad de los anticuerpos marcados con fluorescencia contra sus correspondientes antígenos dentro de una célula. Ambos enfoques directos e indirectos de inmunofluorescencia se pueden utilizar que se basan en el uso de anticuerpos unidos con un fluorocromo. La inmunofluorescencia directa se utiliza con menos frecuencia, ya que proporciona señal inferior, implica mayor costo y menor flexibilidad. En contraste, inmunofluorescencia indirecta se utiliza más comúnmente debido a su alta sensibilidad y proporciona una señal amplificada desde más de un anticuerpo secundario se puede unir a cada anticuerpo primario. En este manuscrito, tanto microscopía de epifluorescencia y la microscopía confocal se usaron para monitorizar la internalización de la lactoferrina humana, un componente importante de la respuesta inmunesistema, en las células hepáticas. Además, monitoreamos el potencial inhibitorio de hLF en la replicación intracelular del virus de la hepatitis C mediante inmunofluorescencia. Ambos se discuten las ventajas y desventajas asociadas con estos enfoques.
Protocol
1. Las células de Preparación y Tratamiento
- En una placa de 24 pocillos, poner una tapa de vidrio en el fondo de los pozos. Lavar cada pocillo con tampón fosfato salino (PBS).
- Semilla Huh-7 células de soporte replicón VHC subgenómico en cada pocillo a una densidad de 5 x 10 4 células / pocillo. Si no existe ningún tratamiento para hacerlo, las células pueden ser sembradas a una densidad más alta. El medio de cultivo es medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM y 250 mg / ml de G-418 (para mantener el replicón).
- Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2. El día siguiente, el tratamiento de las células con 3 M de hLF purificada a partir de la leche humana.
2. El paraformaldehído / Preparación de sacarosa (12% PAF y 12% de sacarosa)
- Poner 500 ml de PBS en un vaso de precipitados y se calienta entre 20 ° C y 30 ° C. Disolver 60 g de sacarosa en la PBS. Disolver 60 g de paraformaldehído (PAF) en el / solución de sacarosa PBS. Se añade lentamente NaOH 2 N (3 a 7 ml) hasta que se obtiene una solución clara.
- Ajustar el pH a 7,4 con HCl. Volumen completa a 500 ml con PBS. Filtrar por gravedad sobre filtro Whatman. Antes de su uso, diluir la solución con PBS a una concentración final de 4% PAF y 4% de sacarosa (Almacenamiento 4 ° C durante 1 semana como máximo).
3. La inmunofluorescencia
- En el momento deseado (0 hr, 2 hr o 24 h de tratamiento), lavar células dos veces (1 min) con PBS y se fijan con PBS / 4% PAF / 4% de sacarosa durante 20 min a RT. Las células son típicamente a 30-40% de confluencia y se utilizan de 1,5x10 5 células.
- Permeabilizar las células con 0,15% de Triton X-100 en PBS durante 5 min a RT y el bloque en 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBS durante 20 min.
- Diluir el anticuerpo primario de la proteína de interés en 10% NGS (ejemplo: ratón primaria anticuerpo anti-hLF diluyó 1: 1000). Aplicar el anticuerpo primario a las células.
- Tras 4 horas a temperatura ambiente o O /N a 4 ° C, lavar las células tres veces durante 5 minutos con 10% NGS. Teñir las células con anticuerpo secundario marcado con fluorocromo diluidos en 10% NGS (ejemplo: Fluorocromo con una longitud de onda de excitación de 488 nm ligado a un anticuerpo anti-ratón 1: 1000) durante 1 hora a RT en la oscuridad.
- Se lavan las células una vez por 5 min con PBS y teñir las células con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg / ml) durante 15 min a TA en la oscuridad.
- Lavar las células dos veces durante 5 min con PBS. Monte cubre gafas en medio de montaje SlowFade antes de la visualización a través de microscopía. Las células están ahora listas para el análisis por epifluorescencia o microscopía confocal.
- Utilizar diferentes controles para asegurar la especificidad de la detección. Por ejemplo, todos los anticuerpos pueden ser omitidos con el fin de detectar la autofluorescencia. El anticuerpo primario se puede omitir para determinar la tinción no específica por el anticuerpo secundario. Por último, si es posible, el control de células o tejidos que no lo hacenexpresar la molécula de interés también puede ser utilizado.
- Visualice las muestras usando el microscopio de fluorescencia apropiada (epifluorescencia o confocal) y conjuntos de filtros apropiados para el marcaje fluorescente utilizado. Slides también se puede almacenar en una caja de portaobjetos a <-20 ° C para su posterior examen.
4. microscopía de fluorescencia
- Mantener las muestras en la oscuridad para evitar photobleaching. Encienda la fuente de luz de un microscopio elegido (epifluorescencia o confocal).
- Encienda el microscopio. Encienda la cámara para el microscopio. Poner la diapositiva en el microscopio para la visualización. Añadir aceite de inmersión en la diapositiva para aumentar la apertura numérica de la lente objetivo.
- Seleccione los filtros adecuados. Ajuste el enfoque y objetivo apropiado. Ajuste las persianas a fin de detectar el fluorocromo apropiado, pero evitar photobleaching. Mantenga las luces del techo fuera para minimizar la luz de fondo cuando se mira en la muestra.
- Cambiar ªfiltros de correo para visualizar diversos fluorocromos (por ejemplo, DAPI y para una longitud de onda de excitación de 488 nm). Tomar fotos con la cámara.
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Representative Results
La capacidad de la línea celular hepática Huh-7 para internalizar exógenamente administrada hLF se monitorizó mediante inmunofluorescencia en un miscroscope confocal. hLF se añadió al medio de cultivo y la internalización se dejó durante 24 horas, después de lo cual, hLF extracelular se lavó con PBS y la membrana residual unido hLF se degradó con un 5 min tratamiento con tripsina (1 ml). Las células se volvieron a sembrar y se dejan volver a adherir durante 18 h antes de la tinción de inmunofluorescencia. Con el fin de delinear los límites citoplasmáticos, las membranas de las células se tiñeron con aglutinina de germen de trigo (WGA) fluorocromo de una longitud de onda de excitación de 488 nm conjugado. La tinción hLF se consiguió usando un anticuerpo primario anti-hLF y un fluorocromo con una longitud de onda de 633 nm ligado al anticuerpo secundario. Con el fin de determinar la localización precisa de hLF, las células fueron imágenes siguiente sección transversal secuencial 0,5 micras horizontal por microscopía confocal. La Figura 4 presenta un optsección transversal iCal correspondiente al grosor de células mediados. Después de la adición exógena de hLF, se detectó una cantidad significativa de hLF en el interior del citoplasma de los hepatocitos. No hLF se observó el interior de las células no tratadas utilizando las configuraciones instrumentales idénticos. En conjunto, estos datos confirman que los hepatocitos tienen la capacidad de adquirir hLF de su entorno extracelular.
La capacidad de hLF para inhibir la replicación intracelular del VHC fue el siguiente vigila por medio de microscopía de epifluorescencia. Huh-7 células de soporte del VHC replicón subgenómico (expresando VHC NS3, NS4A, NS4B, NS5A, proteínas NS5B) la replicación fueron tratados con 3 M hLF durante 0, 2 o 24 hr. La tinción de doble inmunofluorescencia para proteínas hLF y VHC NS5A se analizó por microscopía de epifluorescencia. Estos resultados indican que la tinción replicón VHC subgenómico (medida por inmunofluorescencia de la proteína 5A HCV no estructural) se redujo en las células tratadas con hLF. Figura 5 trong> revela una reducción cualitativa de aproximadamente 50% en la intensidad de tinción del VHC después de 24 h de tratamiento hLF. Esta es una observación interesante ya que este sistema replicón subgenómico de HCV que falta E1 y E2 sobre las glicoproteínas, que son las dianas farmacológicas comúnmente aceptadas de hLF. Concomitante con el desvanecimiento de la tinción de HCV, la acumulación de hLF comenzó a ser detectada después de 2 hr, y fuerte acumulación hLF se observó después de 24 hr.
Figura 1. Principio de la microscopía de epifluorescencia. En este tipo de microscopía, filtros de excitación seleccionar la longitud de onda específica que excita la muestra (Tissus o células que albergan anticuerpos marcados con fluorescencia). Por otra parte, filtros de emisión se eligen para que coincida con las características de emisión espectral del fluoróforo usado para marcar la muestra.carga / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Principio de la microscopía confocal. Este tipo de microscopía utiliza un agujero de alfiler de emisión para eliminar la señal de luz fuera de foco. Puesto que sólo la luz producida por fluorescencia muy cerca del plano focal se puede detectar, la resolución óptica de la imagen es mucho mejor que la de los microscopios de epifluorescencia. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Esquema de la inmunofluorescencia indirecta y directa. Inmunofluorescencia directa implicasólo un tipo de anticuerpo marcado con un fluorocromo que es específico para la molécula de interés (anticuerpo primario). En contraste, inmunofluorescencia indirecta implica anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos que son específicos para las especies del anticuerpo primario no marcado. Más de un anticuerpo secundario puede adjuntar a cada anticuerpo primario que aumenta la señal de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. hepatocelular absorción de hLF. Huh-7 células exógenas fueron tratados con 0 M o 3 M hLF durante 24 horas, se lavó dos veces, sometido a un tratamiento de tripsina 5 min, se dejó volver a adherirse durante 18 horas y se sometieron a inmunofluorescencia. Los núcleos se tiñeron wDAPI i-ésima (canal azul), membranas plasmáticas fueron marcadas con WGA (canal verde) y hLF se tiñó con un anticuerpo anti-hLF (canal rojo). Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopía confocal a un aumento original de 60x. Las secciones transversales ópticas horizontales representan la mitad del grosor de las células. Barra de escala, 10 micras. Modificado de (11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Tratamiento hLF reduce la tinción de HCV. Huh-7 células de soporte la replicación del VHC replicón subgenómico se trataron con 3 M hLF para 0, 2, o 24 hr y se sometieron a inmunofluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI (canal azul), HCV fue revelado por un anticuerpo anti-NS5A (canal rojo) y hLF se tiñó con un anticuerpo anti-hLF unantibody (canal verde). Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopía de epifluorescencia a un aumento original de 60x. Barra de escala, 10 micras. Modificado de (11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La epidemia del VHC sigue siendo una amenaza global, con el 80% de los pacientes recientemente infectados desarrollan una infección crónica, que los pone en riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática o carcinoma hepatocelular. Por acción directa agentes antivirales dirigidas a la replicación del VHC y la maduración representan agentes anti-VHC primos, según lo demostrado recientemente por la aprobación reglamentaria de dos inhibidores de la proteasa NS3 N-terminal (Boceprevir y Telaprevir). La actividad anti-VHC hLF Actualmente se cree que se comporten como un inhibidor de la entrada del virus, la unión de circulación viriones y que les impide entrar en su objetivo hepatocelular. Nuestra investigación sobre hLF presenta un nuevo mecanismo intracelular anti-VHC de acción (distinta de la neutralización virión extracelular) 7.
Inmunofluorescencia puede ser utilizado eficientemente para visualizar la distribución y / o localización de una molécula diana en una muestra biológica. Como se encuentra en muchas otras técnicas de fluorescencia, uno de los pro principalblemas asociados con inmunofluorescencia se photobleaching (destrucción fotoquímica del fluorocromo) 8. Esta pérdida de actividad causada por photobleaching se puede evitar mediante el empleo de cualquiera de los dos fluorocromos más robustos que son menos propensos a photobleaching o mediante la reducción de la intensidad o lapso de tiempo de exposición a la luz. Por otra parte, puesto que los anticuerpos no pueden atravesar la membrana celular, inmunofluorescencia generalmente sólo se limita a las células fijas. Los enfoques alternativos para supervisar la distribución / localización de las proteínas en células vivas por lo tanto, generalmente se basan en la expresión de proteínas que contienen dominios de proteínas fluorescentes tales como la proteína fluorescente verde (GFP) 9. Sin embargo, la adición de tales epítopos GFP se asocia a veces con una modificación en la localización y actividad de las proteínas. Inmunofluorescencia también se puede utilizar en un número de diferentes muestras, incluyendo secciones de tejidos, líneas de células cultivadas o células individuales también se utiliza con frecuencia para controlarla localización / distribución de las proteínas, glicanos, y moléculas pequeñas. Las principales ventajas de esta técnica reside en su simplicidad y el hecho de que se puede utilizar en combinación con otros métodos, que no son anticuerpos de tinción fluorescente (por ejemplo, manchas de ADN). Además, los anticuerpos secundarios producidos comercialmente son relativamente baratos y disponibles en una amplia gama de colores.
En el estudio actual, la inmunofluorescencia de las células hepáticas de apoyo un replicón subgenómico de HCV reveló una reducción cualitativo en la intensidad de la tinción VHC tras el tratamiento con hLF. Esta es una observación interesante ya que este sistema replicón subgenómico de HCV que falta E1 y E2 sobre las glicoproteínas, que son las dianas farmacológicas comúnmente aceptadas de hLF. A diferencia de la actividad de neutralización del virión extracelular, hLF tendría que ser internalizado por los hepatocitos infectados por el VHC con el fin de poner en peligro la replicación viral. El uso de la microscopía fuorescence nos permitió Evalucomió esta posibilidad. Al pre-incubación en hepatocitos infectados por el VHC, exógeno hLF se internaliza con éxito, y se muestra a deteriorar la replicación viral intracelular. La comprensión de esta nueva actividad antiviral hLF constituye un paso adelante en la comprensión de la (pleiotrópicos y probable) mundial mecanismo de inhibición de esta proteína la inmunidad innata.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
- Odell, I. D., Cook, D.
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
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- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
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- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
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- Green Remington, S. J.
