Immunology and Infection

C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53053

Andréa Allaire¹, Frédéric Picard-Jean¹, Martin Bisaillon¹

¹Département de biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke

Abstract

흔히 면역 생물학의 여러 측면을 연구하는 데 실험 기술이다. 이것은 전형적으로 세포 및 조직에서 표적 분자의 분포 및 / 또는 위치 파악을 시각화하기 위해 사용된다. 면역은 세포 내에서 해당 항원에 대한 형광 표지 항체의 특이성에 의존한다. 모두 직접 및 간접 면역 형광 방법은 형광 색소와 링크 된 항체의 사용에 의존 할 수있다. 그것은, 낮은 신호를 제공 높은 비용과 적은 유연성을 포함하기 때문에 직접 면역 형광이 자주 사용된다. 대조적으로, 간접 면역 형광은 더 일반적 때문에 고감도의 사용과 둘 이상의 이차 항체 각 차 항체에 부착 할 수 있기 때문에 증폭 된 신호를 제공한다. 이 논문에서는, 표면 형광 현미경 및 공 초점 현미경 모두 인간 락토페린의 내재화, 면역의 중요한 구성 요소를 모니터링하는 데 사용 된간 세포로 시스템. 또한, 우리는 면역 형광을 사용하여 C 형 간염 바이러스의 복제를 HLF 세포의 억제 가능성을 모니터. 이 두 가지 접근 방식과 관련된 장점과 단점이 논의된다.

Protocol

1. 세포 준비 및 치료

24 웰 플레이트에서 웰의 바닥에 유리 덮개를 넣고. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 각 웰을 세척 할 것.
/ 웰의 5 × ¹⁰⁴ 세포의 농도로 각 웰에 subgenomic HCV 레 플리 콘을지지 시드 응-7 세포. 그럴 치료가 없으면 세포는 고밀도로 접종 될 수있다. 배양 배지는 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 우태 혈청 (FBS)를 2mM L- 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ㎎ / ㎖ G-418 (레 플리 콘을 유지하기 위해)와 보충 (DMEM)이다.
37 ° C에서 품어 5 % CO _2. 다음날, 인간의 우유에서 정제 HLF의 3 μm의와 세포를 치료.

2. 파라 포름 알데히드 / 자당 준비 (12 % PAF 12 % 자당)

20 ° C와 30 ° C 사이를 비커에 PBS 500 ㎖에 넣고 가열한다. PBS에서 자당의 60g을 녹인다. paraformal의 60g을 녹여PBS / 자당 용액에 알데히드 (PAF). 서서히 투명 용액이 얻어 질 때까지 2 N NaOH로 (3 내지 7 ml)에 추가한다.
HCl을 7.4으로 산도를 조정합니다. PBS로 500 ml의 완전한 볼륨. 워트 먼지 필터에 중력에 의해 필터링합니다. 사용 전에, PAF 4 % 4 % 자당 (스토리지 일주 최대 4 ℃)의 최종 농도로 PBS 용액으로 희석.

3. 면역 형광

원하는 시간에 (0 시간은 2 시간 24 처리의 시간), PBS로 (1 분) 두 번 세포를 씻어 실온에서 20 분 동안 PBS / 4 % PAF / 4 % 자당에 고정합니다. 세포는 30 % ~ 40 % 합류에 통상적이며 1.5 × ^{105 세포가} 사용된다.
20 분 동안 PBS 중 10 % 정상 염소 혈청 (NGS)에서 RT에서 5 분 동안 PBS에 0.15 %의 트리톤 X-100 세포 및 블록 Permeabilize 하시려면.
10 % NGS의 관심 단백질의 일차 항체를 희석 (예 : 1000 : 일차 마우스 항 HLF 항체 희석은 1). 세포에 차 항체를 적용합니다.
RT 또는 O에서 4 시간 후 /4 ° C에서 N은 10 % NGS 5 분 동안 세포를 세 번 씻는다. 10 % NGS 희석 형광 색소로 표지 된 이차 항체와 세포 얼룩 (예 : 형광 색소를 항 - 마우스 항체 (1)에 연결된 488 nm 인 여기 파장 : 1,000) 어두운 RT에서 1 시간 동안.
PBS로 5 분 동안 한 번 세포를 씻으과 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) (1 μg의 / ml)로 세포를 얼룩.
PBS로 5 분 동안 두 번 세포를 씻으십시오. 마운트 현미경을 통해 시각화하기 전에 SlowFade 설치 매체에 안경을 커버합니다. 셀은 표면 형광 또는 공 초점 현미경에 의한 분석을위한 준비가되어 있습니다.
검출의 특이성을 보장하기 위해 다른 컨트롤을 사용합니다. 예를 들어, 모든 항체는자가 형광을 검출하기 위해 생략 될 수있다. 일차 항체는 이차 항체에 의한 비특이적 염색을 결정을 생략 할 수있다. 가능하면 마지막으로, 그렇지 않은 세포 또는 조직을 제어대상 분자가 또한 사용될 수 표현한다.
사용되는 형광 표지에 적합한 적절한 형광 현미경 (또는 표면 형광 공 초점) 및 필터 세트를 이용하여 샘플을 시각화. 슬라이드는 또한 <-20 ° C에 대한 시험에서 나중에 슬라이드 박스에 저장 될 수있다.

4. 형광 현미경

광표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. 선택한 현미경 (표면 형광 또는 공 촛점)의 광원을 켭니다.
현미경을 켭니다. 현미경 용 카메라를 켭니다. 시각화를위한 현미경의 슬라이드를 넣습니다. 대물 렌즈의 개구 수를 증가시키는 침지 슬라이드에 오일을 추가한다.
적절한 필터를 선택합니다. 초점과 적절한 목표를 조정합니다. 적절한 형광 색소를 검출하지만 광표백을 방지하기 위해 셔터를 조정한다. 샘플을 볼 때 배경 조명을 최소화하기 위해 머리 위의 조명을 유지합니다.
변경 일E 필터 (예 DAPI 및 488 nm 인 여기 파장 용)의 다양한 형광 색소를 시각화. 카메라로 사진을 촬영합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

외생 투여 HLF 내부화 간 허-7 세포주의 능력에 촛점 miscroscope 면역 형광을 사용하여 모니터 하였다. HLF은 배양 배지에 첨가하고, 내재화 후, 세포 외 HLF는 PBS로 세척하고, 결합 된 잔여 HLF 막은 5 분간 트립신 처리 (1 ml)로 저하시키고, 24 시간 동안 두었다. 세포는 시드 및 면역 형광 염색하기 전에 18 시간 동안 다시 부착하는 것이 허용되었다. 세포질 한계를 개설하기 위하여, 세포 막은 488 nm의 복합체의 여기 파장의 밀 배아 응집소 (WGA) 형광 색소로 염색되었다. HLF 염색은 항 - HLF 일차 항체와 이차 항체에 연결된 633 나노 미터의 파장을 갖는 형광 색소를 사용하여 달성 하였다. HLF의 정확한 정위를 결정하기 위해, 세포를 공 초점 현미경으로 순차 0.5 μm의 수평 단면 다음 이미지화 하였다. 4 OPT를 제시 도표중간 셀 두께에 대응 iCal의 단면도. 외인성 HLF의 첨가 후, HLF 상당량은 간세포의 세포질 내부에서 검출되었다. 동일한 설정을 사용하는 수단이 없을 경우에는 HLF는 미처리 세포 내부에서 관찰되지 않았다. 함께, 이러한 데이터는 간세포가 세포 외 환경에서 HLF을 획득 할 수있는 능력을 가지고 있는지 확인합니다.

HCV의 세포 내 복제가 다음이었다 억제 HLF의 능력은 표면 형광 현미경을 사용하여 관찰. 복제 (HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B 단백질을 발현) subgenomic HCV 레 플리 콘을지지 응-7 세포는 0, 2, 24 시간 동안 3 μM HLF 처리 하였다. HLF 및 HCV NS5A 단백질에 대한 이중 면역 염색 표면 형광 현미경으로 분석 하였다. HLF로 처리 된 세포에서 감소 하였다 (HCV 비 구조 5A 단백질의 면역 형광에 의해 측정)이 결과는 HCV 레 플리 subgenomic 염색을 나타낸다.도 5 trong는> HLF 처리 24 시간 후 HCV 염색 강도의 약 50 %의 질적 저하를 보여준다. 이것은 HLF의 일반적으로 받아 들여지는 약리학 적 표적이다 HCV E1 및 E2 엔벨로프 당 단백질, 부족이 subgenomic 플리 시스템과 같은 흥미있는 관측이다. HCV 염색 페이딩과 병용은 HLF 축적은 2 시간 후에 검출되기 시작하고, 강한 HLF 축적이 24 시간 후에 관찰 하였다.

그림 1
그림 표면 형광 현미경의 1 원칙. 현미경의 이러한 유형은, 여기 필터 (형광 표지 항체를 품고 TISSUS 또는 세포) 시료를 자극하는 특정 파장을 선택합니다. 또한, 배출 필터는 시편에 라벨을 사용하는 형광체의 발광 스펙트럼 특성과 일치하도록 선택된다.로드 / 53053 / 53053fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
공 초점 현미경 검사의 원리는도 2. 현미경이 유형의 포커스 아웃 광 신호를 제거하기 위해 발광 핀홀을 사용한다. 초점면에 매우 가까운 형광 제조 광만을 검출 할 수 있기 때문에, 화상의 해상도는 광학 현미경 표면 형광보다 매우 우수하다. 이 도면의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하여주십시오.

간접 및 직접 면역 형광의 그림 3. 도식. 직접 면역 형광이 포함관심 (차 항체)의 분자에 특정한 형광 색소로 표지 된 항체의 한 유형입니다. 반면, 간접 면역 형광은 라벨이없는 일차 항체의 종류에 고유 한 형광 색소로 표지 이차 항체를 포함한다. 두 개 이상의 이차 항체가 형광 신호를 증가 각각의 일차 항체에 부착 할 수있는 것보다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

외생 HLF. 허-7 세포의 그림 4. 간세포의 흡수는 18 시간 동안 다시 부착시키고 면역을받는 5 분 트립신 처리에 제출, 두 번, 24 시간 동안 0 μm의 3 μm의의 HLF으로 처리 세척 하였다. 핵 승 염색플라즈마 막은 WGA (녹색 채널)과 HLF로 표지 된 i 번째 DAPI (청색 채널) 항 HLF 항체 (붉은 채널)로 염색 하였다. 이미지는 60 배의 원래 배율 공 초점 현미경에 의해 인수되었다. 수평 광학 단면은 세포의 중간 - 두께를 나타낸다. 스케일 바, 10 μm의. (11)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 HLF 처리 HCV 얼룩을 감소시킨다. subgenomic HCV 레 플리 콘의 복제를지지하는 어-7 세포는 0, 2, 또는 24 시간 동안 3 μM HLF로 처리하고 면역을 실시 하였다. 핵은 DAPI (파란색 채널), HCV가 안티 NS5A 항체 (적색 채널)에 의해 밝혀졌다과 HLF이 방지 HLF의 염색 한 염색 하였다ntibody (녹색 채널). 이미지는 60 배의 원래 배율 표면 형광 현미경에 의해 인수되었다. 스케일 바, 10 μm의. (11)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HCV 전염병은 간경변, 간부전이나 간암의 위험에 그들을 가하고, 만성 감염을 개발 새로 감염된 환자의 80 %로, 글로벌 위협이 남아있다. 최근 두 NS3 N- 말단 단백질 분해 효소 억제제 (Boceprevir 및 Telaprevir)의 규제 당국의 승인에 의해 입증 된 바와 같이 - 직동 HCV 복제 및 성숙을 대상으로 항 바이러스제는 주요 항 HCV 에이전트를 나타냅니다. HLF 항 HCV 활성은 현재 비리 순환 그들의 타겟 간세포 내로 들어가는 것을 방지 바인딩 엔트리 바이러스 억제제로서 동작 할 것으로 생각된다. HLF에 우리의 연구는 (세포 외 비리 중화 구별) 액션의 새로운 세포 내 항 HCV기구 ^(7)를 제공합니다.

면역 형광을 효율적으로 생물학적 샘플에서 표적 분자의 분포 및 / 또는 위치 파악을 시각화 할 수있다. 많은 다른 형광 기법 메인 프로 중 하나에 발견면역과 관련된 문제 들는은 (형광 색소의 광 화학적 파괴) ⁸ photobleaching에있다. photobleaching에 의한 활동이 손실 photobleaching에 또는 강도 또는 빛의 노출 시간 범위를 줄임으로써 적은 경향이보다 강력한 형광 색소를 이용하여 중 하나를 피할 수 있습니다. 항체는 세포막을 통과 할 수 없기 때문에, 또한, 면역 형광은 일반적으로 고정 된 세포 만 제한된다. 대안 적 방법은 따라서 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) ⁹ 형광 단백질 도메인을 포함하는 단백질의 발현에 의존 생균 단백질의 분포 / 현지화를 모니터링한다. 그러나, GFP 에피토프의 첨가는 종종 단백질 활성의 현지화 및 수정과 관련된다. 또한 면역 조직 섹션을 포함한 다른 샘플 배양 세포주, 또는 개개의 셀들의 수에 사용될 수있다 또한, 자주 모니터링하는 데 사용되는단백질, 글리 칸, 작은 분자의 지역화 / 유통. 이 기술의 주요 장점은 단순함과 형광 염색법 (예를 들어, DNA 염색)의 다른 비 - 항체 방법과 병용 할 수 있다는 사실에 상주. 또한, 상업적으로 생산 된 이차 항체는 색상의 광대 한 배열에 상대적으로 저렴하고 사용할 수 있습니다.

현재의 연구에서, HCV에게 subgenomic 플리을 지원하는 간 세포의 면역 형광은 HLF 치료시 HCV 염색 강도의 질적 저하를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이것은 HLF의 일반적으로 받아 들여지는 약리학 적 표적이다 HCV E1 및 E2 엔벨로프 당 단백질, 부족이 subgenomic 플리 시스템과 같은 흥미있는 관측이다. 세포 외 비리 중화 활성 달리 HLF는 바이러스 복제를 저해하기 위해 HCV에 감염된 간세포에 의해 내부화 될 필요가있을 것이다. fuorescence 현미경의 사용은 우리 evalu 허용이러한 가능성을 먹었다. HCV에 감염된 간세포에 미리 배양하면, 외래 HLF 성공적으로 내면화하고, 세포 내 바이러스 복제를 저해 것으로 나타났다. 이 소설 HLF 항 바이러스 활동의 이해는이 선천성 면역 단백질의 억제의 글로벌 (그리고 가능성다면 발현 성) 메커니즘의 이해에 앞으로 단계를 구성한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca²⁺& Mg²⁺
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4 (2013).
Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
Green Remington, S. J. fluorescent protein: a perspective. Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).