Immunology and Infection

Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53053

Andréa Allaire¹, Frédéric Picard-Jean¹, Martin Bisaillon¹

¹Département de biochimie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke

Abstract

İmmünofloresan yaygın biyoloji birçok yönlerini incelemek için kullanılan bir laboratuar tekniğidir. Bu, tipik olarak hücre ve dokularda bir hedef moleküle dağılımı ve / veya lokalizasyonunu göstermek için kullanılır. Immunofluorescence bir hücre içinde bunlara karşılık gelen antijenlere karşı floresan etiketli antikorların özelliğine dayanır. Doğrudan ve dolaylı immünofloresans yaklaşımlarının florokrom bağlanmış antikorların kullanımına dayalı olan kullanılabilir. Bu alt sinyali sağlar yüksek maliyet ve daha az esneklik içerir çünkü direkt immünfloresan az sıklıkla kullanılmaktadır. Bunun aksine, dolaylı immunofluoresans daha yaygın olarak, çünkü, yüksek hassasiyet kullanılan birden fazla ikincil antikor, her birincil antikor eklemek çünkü güçlendirilmiş bir sinyal sağlar. Bu yazıda, Epifloresans mikroskobu ve konfokal mikroskopi hem insan laktoferrin içselleştirilmesi, bağışıklık önemli bir bileşeni izlemek için kullanıldıKaraciğer hücrelerine sistemi. Ayrıca, immünofloresan ile Hepatit C virüsünün hücre replikasyonu üzerindeki hLF önleyici potansiyelini izlenir. Hem bu yaklaşımların ile ilgili avantaj ve dezavantajları tartışılmıştır.

Protocol

1. Hücreler hazırlanması ve Tedavi

Bir 24-yuvalı plaka içinde, kuyu altındaki cam kapak koydu. Fosfat Tamponlu Salin (PBS), her kuyu yıkayın.
/ Gözenek 5 x 10 ⁴ hücrelik bir yoğunlukta her oyukta bulunan HCV subgenomik replikon destekleyici Tohum Huh-7 hücreleri. Yapmak için hiçbir tedavi yoktur ise, hücreler daha yüksek bir yoğunlukta ekildi edilebilir. Kültür ortamı, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı 10% Dana Fetus Sığır Serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 250 mg / ml G-418 (replikon korumak için) ile desteklenmiş (DMEM) 'dir.
37 ° C'de inkübe edin ve% 5 CO _2. Bir sonraki gün, insan sütü saflaştırılmış hLF 3 uM hücrelerin tedavisi.

2. Paraformaldehit / Sakaroz hazırlanması (% 12 PAF ve% 12 sükroz)

20 ° C ve 30 ° C arasına, bir beher içinde 500 ul PBS ml koyun ve ısıtın. PBS içinde sükroz: 60 g çözündürülür. Paraformal 60 g çözülürPBS / sükroz solüsyonunda feniltiyoasetaldehit (PAF). Yavaş yavaş berrak bir çözelti elde edilene kadar NaOH 2N (3 7 ml) ekleyin.
HCI ile 7.4'e pH ayarlayın. PBS ile 500 ml'ye tamamlayın hacmi. Whatman filtre üzerindeki yerçekimi ile Filtre. Kullanımdan önce,% 4 PAF ve% 4 sukroz (saklama 1 haftalık maksimum 4 ° C) bir son konsantrasyona PBS ile seyreltilir.

3. İmmünofloresan

İstenen zaman (0 saat, 2 saat ve 24 saat tedavi), PBS (1 dakika) hücreler iki kez yıkama ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS /% 4 PAF /% 4 sukroz ile sabitleyin. Hücreler 30-40% konfluansa tipik olarak ve 1.5x10 ⁵ hücreleri kullanılır.
20 dakika boyunca PBS içinde% 10 normal keçi serumu (NGS) içinde, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.15 Triton X-100 ile hücreler ve blok geçirgenliği.
% 10 NGS daki proteinin birincil antikor seyreltilir (örneğin: 1000: Primer fare anti-hLF antikoru 1 seyreltilmiş). Hücrelere birincil antikor uygulayın.
Oda sıcaklığında veya O C'de 4 saat sonra /4 ° C 'de N,% 10 NGS ile 5 dakika boyunca hücreler üç kez yıkayın. % 10 NGS içinde seyreltilmiş fluorokrom ile etiketlenmiş sekonder antikor ile hücrelerin Leke (örneğin: bir florokrom, bir antikorun bir anti-fare 1 ile bağlantılı olan 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ile: 1000), karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
PBS ile 5 dakika boyunca bir kez hücreler yıkanır ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 ug / ml) ile hücrelerin leke.
PBS ile 5 dakika boyunca iki kez hücreleri yıkayın. Dağı mikroskobu ile görselleştirme önce Slowfade montaj orta gözlük kapsamaktadır. Hücreler artık Epifloresans veya konfokal mikroskobu ile analiz için hazırız.
Algılama özgünlüğünü sağlamak için farklı kontrolleri kullanın. Örneğin, tüm antikorlar otoflüoresan tespit etmek için göz ardı edilebilir. Birincil antikor, ikincil antikorun spesifik olmayan bir boyama belirlemek için göz ardı edilebilir. Mümkünse Nihayet, değil mi hücreleri ya da dokuları kontrolilgi konusu molekülün de kullanılabilir ifade eder.
Kullanılan floresan etiket için uygun uygun floresan mikroskop (Epifloresans veya konfokal) ve filtre setleri kullanarak örnekleri gözünüzde canlandırın. Slaytlar, aynı zamanda <-20 ° C sıcaklıkta daha sonra muayene bir slayt kutuda saklanabilir.

4. Floresan Mikroskopi

Photobleaching önlemek için karanlıkta örnekleri tutun. Seçilen mikroskobu (Epifloresans veya konfokal) ışık kaynağı açın.
Mikroskop açın. Mikroskop için Kamerayı açın. Görselleştirme için mikroskop slayt koyun. Objektif lens sayısal açıklık artırmak için slayt daldırma yağı ekleyin.
Uygun filtreleri seçin. Odağı ve uygun hedefi ayarlayın. Uygun florokrom algılamak ama photobleaching önlemek için kepenkleri ayarlayın. Numune bakarken arka plan ışığı en aza indirmek için havai ışıkları tutun.
Değişim incie filtreler (örneğin DAPI ve 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu için), çeşitli fluorochromes görselleştirmek için. Kamera ile fotoğraf çekme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dışsal olarak halde uygulanan hLF içselleştirmeye hepatik Huh-7 hücre hattının yeteneği konfokal miscroscope ile immünofloresan kullanılarak izlenmiştir. hLF kültür ortamına ilave edildi ve içselleştirme sonra, hücre dışı hLF PBS ile yıkanmış ve hLF bağlı kalan membran 5 dk tripsin tedavisi (1 mi) ile hazmedilmiştir, 24 saat süre ile bırakıldı. Hücreler yeniden tohumlandı ve immünofloresan boyama öncesi 18 saat yeniden yapışmaya bırakıldı. Sitoplazmik sınırları anlatabilmek için, hücreler, membranlar 488 nm konjügatın bir eksitasyon dalga boyu buğday tohumu agglutinin (WGA) florokrom ile boyandı. HLF boyama, bir anti-hLF primer antikor ve sekonder antikor ile bağlantılı mil 633 bir dalga boyuna sahip bir florokrom kullanılarak elde edilmiştir. HLF hassas lokalizasyonunu tespit etmek için, hücreler, konfokal mikroskobu ile sıralı 0,5 um yatay kesiti, aşağıdaki görüntülenmiştir. 4 bir tercih sunulur ŞekilAra hücre kalınlığına karşılık gelen nik kesittir. Eksojen hLF ilave edildikten sonra, hLF önemli miktarda hepatositlerin sitoplazmasında içinde tespit edildi. Özdeş enstrümantal ayarları kullanırken hiçbir HLF tedavi edilmezse hücreler içinde gözlenmiştir. Birlikte, bu veriler hepatositler onların dışı ortamdan HLF edinme kapasitesine sahip olduğunu teyit etmektedir.

HCV içi çoğaltma yanında olduğunu inhibe hLF kabiliyeti Epifloresans mikroskobu kullanılarak izlenir. Çoğaltma (HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B proteini eksprese eden) HCV subgenomik replikon destek Huh-7 hücreleri, 0, 2 ya da 24 saat süre ile 3 uM hLF ile muamele edilmiştir. HLF ve HCV NS5A proteinleri çift immunofloresan boyama Epifloresans mikroskobu ile analiz edilmiştir. HLF ile muamele edilen hücrelerde indirgendi (HCV yapısal olmayan 5A proteini bağışıklık fluorışıması yoluyla ölçülen) Bu sonuçlar, HCV subgenomik replikon boyama göstermektedir. Şekil 5 trong> hLF tedavi 24 saat sonra, HCV boyama yoğunluğu yaklaşık% 50 bir azalma ortaya koymaktadır niteliksel. Bu hLF genel kabul gören farmakolojik hedeflerdir HCV E1 ve E2 zarf glikoproteinleri, eksik bu subgenomik replikon sistemi olarak ilginç bir gözlemdir. HCV boyanma solma ile eşzamanlı, HLF birikimi 2 saat sonra tespit edilmeye başlandı ve güçlü HLF birikimi 24 saat sonra gözlenmiştir.

figür 1
Şekil Epifloresans mikroskopi 1. İlke. Mikroskopi Bu tip uyarma filtreler (floresan etiketli antikorlar barındıran tissus veya hücreleri) numune heyecanlandıran belirli dalga boyu seçin. Ayrıca, emisyon filtreleri örneği etiketlemek için kullanılan fluorofor spektral emisyon özelliklerini eşleştirmek için seçilir.yük / 53053 / 53053fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Konfokal mikroskopi Şekil 2. ilkesi. Mikroskopi Bu tip out-of-focus ışık sinyalini ortadan kaldırmak için bir emisyon iğne deliği kullanır. Odak düzlemi çok yakın floresan tarafından üretilen sadece hafif tespit edilebilir olduğundan, görüntü optik çözünürlük Epifloresans mikroskoplar çok daha iyidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Dolaylı ve dolaysız immünfloresans Şekil 3. şematik. Doğrudan immünofloresan içerirÇevrede (birincil antikor) molekülü özgü bir fluorokrom ile etiketlenmiş antikorun sadece bir tür. Bunun aksine, dolaylı immunofluoresans işaretsiz birincil antikor türe özgü florokromlar ile işaretlenmiş sekonder antikorlar içerir. Daha bir ikincil antikor floresan sinyalini artıran her birincil antikor ekleyebilirsiniz daha. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Eksojen hLF. Huh-7 hücreleri Şekil 4. Hepatosellüler alımı 18 saat yeniden yapışmaya bırakıldı ve immünofloresans maruz kalan 5 dakika tripsin tedavisi için sunulan, iki kez, 24 saat boyunca 0 uM veya 3 uM hLF ile muamele yıkanmıştır. Çekirdekler w boyandıplazma zarları WGA (yeşil kanal) ve hLF ile etiketlenmiş i DAPI (mavi kanal) bir anti-hLF antikoru (kırmızı kanalı) ile boyanmıştır. Görüntüler 60x orijinal büyütme konfokal mikroskopi tarafından satın alındı. Yatay optik kesitler hücrelerinin orta kalınlıkta temsil etmektedir. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (11) modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. hLF tedavisi HCV boyama azaltır. HCV subgenomik replikon replikasyonu destekleyen Huh-7 hücreleri, 0, 2 ya da 24 saat süre ile 3 uM hLF ile işlemden geçirildi ve imüno tabi tutuldu. Çekirdekler DAPI (mavi kanal), HCV bir anti-NS5A antikoru (kırmızı kanal) tarafından ortaya çıkarıldı ve HLF bir anti-HLF a ile boyandı ile boyandıntibody (yeşil kanal). Görüntüler 60x orijinal büyütme Epifloresans mikroskobu ile elde edildi. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (11) modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HCV salgın siroz, karaciğer yetmezliği veya hepatosellüler karsinom riski koyarak, kronik enfeksiyon gelişen yeni enfekte hastaların% 80'i, küresel bir tehdit olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda iki NS3 N-terminal proteaz inhibitörleri (boseprevir ve Telaprevir) düzenleyici onayı ile gösterildiği gibi doğrudan etki eden HCV replikasyonu ve olgunlaşmasını hedefleyen antiviral ajanlar, başbakan anti-HCV ajanlardır. HLF, anti-HCV aktivitesi şu virionlar dolaşımdaki ve hepatoselüler hedef haline girmesini önleyecek biçimde bağlanması, viral giriş inhibitörü olarak davranırlar inanılmaktadır. HLF Bizim araştırma (hücre dışı virion nötralizasyondan ayrı) bir eylem yeni hücre içi anti-HCV mekanizmasını ⁷ sunuyor.

Immunofluorescence verimli, bir biyolojik numunedeki bir hedef moleküle dağılımı ve / veya lokalizasyonunu görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Diğer birçok floresan teknikleri ana yanlısı biri bulundu gibiimmünofloresan ile bağlantılı unl arı (florokrom fotokimyasal imha) ⁸ ışıkla ağartma edilir. Photobleaching neden aktivite bu kayıp photobleaching veya yoğunluğunu veya ışığa maruz kalma zaman dilimini azaltarak daha az eğilimli daha sağlam fluorochromes kullanılarak ya atlatılabilir. Antikorlar, hücre membranını geçemediği olabilir Dahası, immünofloresan genel olarak sadece sabit hücreler ile sınırlıdır. Alternatif yaklaşımlar bu nedenle genellikle, yeşil flüoresan protein (GFP) ⁹ gibi floresan proteini bölgeleri içeren proteinlerin ekspresyonu dayanan canlı hücrelerde proteinlerin dağıtım / lokalizasyonunu izlemek için. Bununla birlikte, bu GFP epitoplarının eklenmesi, bazen proteinlerin lokalizasyonu ve aktivitesindeki bir modifikasyon ile ilişkilidir. Immunofluorescence doku bölümleri dahil olmak üzere, farklı numune, kültürlenmiş hücre çizgileri ya da tek tek hücrelerin bir dizi kullanılabilir aynı zamanda sık sık izlenmesi için kullanılırproteinler, glikanlar, ve küçük moleküller lokalizasyon / dağıtıcı. Bu tekniğin başlıca avantajları basitlik ve floresan boyama (örneğin, bir DNA boyama) diğer olmayan antikor yöntemleri ile kombinasyon halinde kullanılabilir olduğu gerçeğinde yatar. Ayrıca, ticari olarak üretilen ikincil antikorlar renklerin geniş bir dizi nispeten ucuz ve kullanılabilir.

Bu çalışmada, bir HCV alt-genomik replikon destekleyici hepatik hücreleri immünofloresan hLF ile işlenmesi üzerine HCV boyama yoğunluğuna niteliksel bir azalma ortaya çıkardı. Bu hLF genel kabul gören farmakolojik hedeflerdir HCV E1 ve E2 zarf glikoproteinleri, eksik bu subgenomik replikon sistemi olarak ilginç bir gözlemdir. Hücre dışı virion nötralizasyon faaliyeti aksine, HLF viral replikasyonu zarar amacıyla HCV ile infekte hepatositler tarafından içselleştirilmesi gerekir. Fuorescence mikroskopi kullanımı bize değerlendirmeleri mevcuttur izinbu olasılığı yedi. HCV ile enfekte olmuş hepatositlere öncesi inkübasyon üzerine, eksojen hLF başarılı bir içsel ve hücre içi viral replikasyonu bozduğu gösterilmiştir. Bu roman HLF antiviral aktivite anlayışı bu doğuştan gelen bağışıklık proteini inhibe küresel (ve büyük olasılıkla pleitropik) mekanizmasının anlaşılmasında bir adım ileri oluşturmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca²⁺& Mg²⁺
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4 (2013).
Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
Green Remington, S. J. fluorescent protein: a perspective. Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).