Abstract
Imunofluorescência é uma técnica de laboratório vulgarmente usados para estudar vários aspectos da biologia. É tipicamente usado para visualizar a distribuição e / ou a localização de uma molécula alvo em células e tecidos. Imunofluorescência baseia-se na especificidade de anticorpos fluorescentes marcado contra os seus antigénios correspondentes no interior de uma célula. Ambas abordagens directas e indirectas de imunofluorescência pode ser usado que se baseiam no uso de anticorpos ligados a um fluorocromo. A imunofluorescência direta é menos freqüentemente usado porque fornece sinal inferior, envolve custos mais elevados e menos flexibilidade. Em contraste, imunofluorescência indireta é mais comumente utilizado devido à sua alta sensibilidade e fornece um sinal amplificado desde mais de um anticorpo secundário pode anexar a cada anticorpo primário. Neste texto, tanto microscopia de epifluorescência e microscopia confocal foi utilizada para monitorizar a internalização da lactoferrina humana, um componente importante da resposta imunesistema, em células hepáticas. Além disso, nós monitorizado o potencial inibitório da hLF na replicação intracelular do vírus da hepatite C por meio de imunofluorescência. Ambas as vantagens e desvantagens associadas a estes métodos são discutidos.
Protocol
1. Células e Preparação de tratamento
- Numa placa de 24 poços, colocar uma tampa de vidro no fundo dos poços. Lavar cada poço com tampão fosfato salino (PBS).
- Semente células Huh-7 que suportam o replicão de VHC subgen�ico em cada poço a uma densidade de 5 x 10 4 células / poço. Se não houver tratamento a fazer, as células podem ser semeadas a uma densidade mais elevada. O meio de cultura é de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), L-glutamina 2mM, piruvato de sódio 1 mM e 250 mg / mL de G-418 (para manter o replicão).
- Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. No dia seguinte, as células com o tratamento de 3 ^ M da hLF purificado a partir de leite humano.
2. O paraformaldeído / Sacarose Preparação (12% de PAF e 12% de sacarose)
- Coloque 500 ml de PBS num recipiente e aquecê-la compreendida entre 20 ° C e 30 ° C. Dissolve-se 60 g de sacarose em PBS. Dissolve-se 60 g de paraformaldehyde (PAF) na / solução de sacarose PBS. Adiciona-se lentamente NaOH 2 N (3 a 7 ml) até que uma solução clara é obtida.
- Ajustar o pH para 7,4 com HCl. Completar o volume a 500 ml com PBS. Filtrar por gravidade sobre filtro Whatman. Antes do uso, dilui-se a solução com PBS até uma concentração final de 4% de PAF e 4% de sacarose (de armazenamento de 4 ° C durante 1 semana no máximo).
3. Imunofluorescência
- No momento desejado (0 horas, 2 horas ou 24 horas de tratamento), lavar células duas vezes (1 minuto), com PBS e fixar com PBS / 4% de PAF / 4% de sacarose durante 20 min à TA. As células são tipicamente a 30-40% de confluência e 5 1,5x10 células são utilizadas.
- Permeabilizar as células com 0,15% de Triton X-100 em PBS durante 5 min à temperatura ambiente e em bloco de 10% de soro de cabra normal (NGS) em PBS durante 20 min.
- Dilui-se o anticorpo primário da proteína de interesse em 10% NGS (exemplo: rato primária anticorpo anti-hLF diluída 1: 1.000). Aplicar o anticorpo primário às células.
- Após 4 horas à temperatura ambiente ou O /N a 4 ° C, lavar as células três vezes durante 5 min com 10% de NGS. Corar as células com o anticorpo secundário marcado com fluorocromo diluído em 10% NGS (exemplo: Fluorocromo com um comprimento de onda de excitação de 488 nm ligada a um anticorpo anti-rato de 1: 1000) durante 1 h à TA no escuro.
- Lavar as células uma vez durante 5 min com PBS e as células com manchar 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 ug / ml) durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
- Lavar as células duas vezes durante 5 min com PBS. Mount cobrir vidros no SlowFade meio de montagem antes de visualização através da microscopia. As células estão agora prontos para análise por epifluorescência ou microscopia confocal.
- Use diferentes controlos para assegurar a especificidade da detecção. Por exemplo, todos os anticorpos podem ser omitidos a fim de detectar a autofluorescência. O anticorpo primário pode ser omitido para determinar a coloração não específica por o anticorpo secundário. Finalmente, se possível, controlar as células ou tecidos que não fazerexpressar a molécula de interesse, também pode ser usado.
- Visualize as amostras que usam o microscópio de fluorescência apropriado (epifluorescência ou confocal) e filtros adequados para a etiqueta fluorescente utilizado. As lâminas podem também ser armazenadas numa caixa de corrediça a <-20 ° C para análise posterior.
4. Microscopia de Fluorescência
- Manter as amostras no escuro para evitar a fotodegradação. Ligue a fonte de luz do microscópio escolhido (epifluorescência ou confocal).
- Ligue o microscópio. Ligue a câmera para o microscópio. Coloque o slide no microscópio para visualização. Adicionar o óleo de imersão sobre a corrediça para aumentar a abertura numérica da lente objectiva.
- Selecione os filtros apropriados. Ajuste o foco e objetivo adequado. Ajuste as persianas, a fim de detectar o fluorocromo adequado, mas evitar a fotodegradação. Mantenha fora luzes do teto para minimizar fundo claro quando se olha para amostra.
- Alterar thOs filtros para visualizar vários fluorocromos (por exemplo DAPI e para um comprimento de onda de excitação de 488 nm). Tire fotos com a câmera.
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Representative Results
A capacidade do Huh-7 linha celular hepática para internalizar exogenamente administrada hLF foi monitorizada utilizando imunofluorescência em um miscroscope confocal. hLF foi adicionado ao meio de cultura e a internalização foi deixada por 24 horas, após o que, a hLF extracelular foi lavada com PBS e a membrana ligada a hLF residual foi degradada com um tratamento com tripsina 5 min (1 mL). As células foram re-semeadas e deixou-se voltar a aderir durante 18 h antes de coloração por imunofluorescência. A fim de delinear os limites citoplasmáticos, as membranas de células foram coradas com aglutinina de gérmen de trigo (WGA) fluorocromo de um comprimento de onda de excitação de 488 nm conjugado. A coloração foi conseguido hLF utilizando um anticorpo primário anti-hLF e um fluorocromo com um comprimento de onda de 633 nm, ligado ao anticorpo secundário. De modo a determinar a localização precisa da hLF, células foram fotografadas seguinte sequencial de 0,5 um corte transversal horizontal através de microscopia confocal. A Figura 4 apresenta um optsecção transversal-ical correspondente à espessura de célula médio. A seguir à adição de exógeno hLF, uma quantidade significativa da hLF foi detectado no interior do citoplasma de hepatócitos. Sem hLF foi observada no interior das células não tratadas quando usando as configurações instrumentais idênticas. Em conjunto, estes dados confirmam que os hepatócitos têm a capacidade de adquirir a hLF do seu ambiente extracelular.
A capacidade da hLF para inibir a replicação intracelular do VHC foi próxima monitorizada utilizando microscopia de epifluorescência. Células Huh-7 que suportam o replicão de VHC subgenómico (expressando HCV NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B proteínas) replicação foram tratados com 3 uM da hLF para 0, 2 ou 24 horas. A coloração dupla imunofluorescência para proteínas hLF e NS5A do HCV foi analisada por microscopia de epifluorescência. Estes resultados indicam que a coloração de HCV subgen�ico replicão (conforme medido por imunofluorescência do HCV não estrutural 5A proteína) foi reduzida nas células tratadas com a hLF. Figura 5 Trong> revela uma redução qualitativa de aproximadamente 50% na intensidade de coloração do VHC após 24 horas de tratamento da hLF. Esta é uma observação interessante como este sistema replicão subgenómico que falta o HCV E1 e E2 glicoproteínas do envelope, que são os alvos farmacológicos geralmente aceites da hLF. Concomitante com o desaparecimento da coloração do HCV, a acumulação da hLF começou a ser detectada após 2 horas, e a acumulação da hLF forte foi observada após 24 h.
Figura 1. Princípio de microscopia de epifluorescência. A este tipo de microscopia, filtros de excitação seleccionar o comprimento de onda específico, que excita o espécime (Tissus anticorpos ou células que albergam marcado com fluorescência). Além disso, os filtros de emissão são escolhidas para corresponder às características espectrais de emissão do fluoróforo utilizado para marcar o espécime.carga / 53053 / "target =" _ blank 53053fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Princípio da microscopia confocal. Este tipo de microscopia usa uma pinhole emissão para eliminar out-of-focus sinal de luz. Uma vez que apenas luz produzida por fluorescência muito perto do plano focal pode ser detectada, a resolução óptica da imagem é muito melhor do que a dos microscópios epifluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Esquema da imunofluorescência indireta e direta. A imunofluorescência direta envolveapenas um tipo de anticorpo marcado com um fluorocromo que é específico para a molécula de interesse (anticorpo primário). Em contraste, imunofluorescência indirecta envolve anticorpos secundários marcados com fluorocromos que são específicos para as espécies de o anticorpo primário não marcado. Mais de um anticorpo secundário pode anexar a cada anticorpo primário que aumenta o sinal de fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. hepatocelular absorção da hLF. Exógenos células Huh-7 foram tratados com 0 uM ou 3 uM da hLF, durante 24 h, lavou-se duas vezes, submetida a um tratamento com tripsina 5 min, deixou-se voltar a aderir durante 18 horas e submetidos a imunofluorescência. Os núcleos foram coradas wom DAPI (azul canal), membranas plasmáticas foram marcadas com WGA (canal verde) e hLF foi corado com um anticorpo anti-hLF (canal vermelho). As imagens foram adquiridas por microscopia confocal a um aumento original de 60x. As secções transversais ópticos horizontais representam a média de espessura das células. Barra de escala, 10 um. Modificado de (11). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Tratamento hLF reduz coloração VHC. Células Huh-7 que suportam a replicação de HCV replicão subgen�ico foram tratados com 3 uM da hLF para 0, 2, ou 24 h e submetida a imunofluorescência. Os núcleos foram coradas com DAPI (azul canal), o HCV foi revelada por um anticorpo anti-NS5A (canal vermelho) e hLF foi corado com um anticorpo anti-hLF umntibody (canal verde). As imagens foram adquiridas por microscopia de epifluorescência a um aumento original de 60x. Barra de escala, 10 um. Modificado de (11). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A epidemia de HCV permanece uma ameaça global, com 80% dos pacientes recém-infectadas desenvolvem uma infecção crônica, colocando-os em risco de cirrose, insuficiência hepática ou carcinoma hepatocelular. Por acção directa agentes antivirais combatem a replicação do HCV e maturação representam agentes anti-HCV de primeira linha, como recentemente demonstrado pela aprovação regulamentar de dois NS3 N-terminal inibidores da protease (boceprevir e telaprevir). A actividade anti-VHC hLF é actualmente acredita-se que se comportam como um inibidor de entrada viral, ligando circulam viriões e impedindo-os de entrar no seu alvo hepatocelular. A nossa pesquisa sobre a hLF apresenta um novo mecanismo intracelular anti-HCV de acção (distinta da neutralização virião extracelular) 7.
Imunofluorescência pode ser eficientemente usado para visualizar a distribuição e / ou a localização de uma molécula-alvo numa amostra biológica. Conforme encontrado em muitas outras técnicas de fluorescência, um dos pró principalblemas associados com a imunofluorescência é fotobranqueamento (destruição fotoquímica do fluorocromo) 8. Essa perda de actividade causada por fotobranqueamento pode ser contornado, quer através do emprego de fluorocromos mais robustas que são menos propensas a fotobranqueamento ou através da redução da intensidade ou do tempo de exposição do vão de luz. Além disso, uma vez que os anticorpos não podem atravessar a membrana celular, a imunofluorescência é geralmente apenas limitado às células fixadas. Abordagens alternativas para monitorar a distribuição / localização de proteínas em células vivas, por conseguinte, em geral contam com a expressão de proteínas contendo domínios de proteínas fluorescentes, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) 9. No entanto, a adição de tais epitopos GFP está por vezes associada a uma modificação na localização e actividade das proteínas. Imunofluorescência também pode ser utilizado num número de diferentes amostras de tecido, incluindo secções de linhas de células cultivadas ou de células individuais, é também frequentemente utilizada para monitorizara localização / distribuição de proteínas, glicanos, e pequenas moléculas. As principais vantagens desta técnica reside no seu simplicidade e o facto de que pode ser usado em combinação com outros métodos, que não anticorpos de coloração fluorescente (por exemplo, coloração de ADN). Além disso, os anticorpos secundários produzidos comercialmente são relativamente barato e disponível em uma vasta gama de cores.
No estudo actual, a imunofluorescência de células hepáticas de apoio a um replicão de VHC subgen�ico revelou uma redução qualitativa na intensidade de coloração do VHC após tratamento com hLF. Esta é uma observação interessante como este sistema replicão subgenómico que falta o HCV E1 e E2 glicoproteínas do envelope, que são os alvos farmacológicos geralmente aceites da hLF. Ao contrário da actividade de neutralização do virião extracelular, a hLF teriam de ser interiorizada pelos hepatócitos infectados com o VHC, a fim de impedir a replicação viral. O uso de microscopia fuorescence nos permitiu avacomeu essa possibilidade. Após a pré-incubação de hepatócitos infectados pelo HCV, a hLF exógeno foi internalizado com sucesso, e mostrado para impedir a replicação viral intracelular. A compreensão deste romance atividade antiviral hLF constitui um passo em frente na compreensão do mecanismo (pleiotropic e provável) mundial de inibição dessa proteína imunidade inata.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Without Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-labeled anti-mouse | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit | Invitrogeb | A21069 | |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potentially mutagenic |
| Anti-NS5A rabbit | Abcam | ab2594 | |
| Anti-hLF mouse | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst stain | Life Techn. | H1399 | Potentially mutagenic and carcinogenic |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope | Nikon | TE2000-E | |
| epifluorescence/confocal microscope | Olympus | FV1000 |
References
- Odell, I. D., Cook, D.
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A.
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
- Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Green Remington, S. J.
