כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
תרבית תאים בוצעה באופן מסורתי על מצעים דו-ממדי (2D) שבו תאים לדבוק באמצעות קולטנים הגחון אל פני השטח בחומר ביולוגי. עם זאת in vivo, רוב התאים מוקפים לחלוטין על ידי מטריקס (ECM), וכתוצאה מכך הפצה תלת ממדי (3D) של קולטנים. זה עלול לעורר הבדלים במחוץ-במסלולי איתות וכך בהתנהגות תא.
מאמר זה מראה שגירוי קולטני הגב של תאים כבר דבקו מצע 2D ידי כיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) מפעיל שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D סטנדרטיים. יתר על כן, העירור הזמני של קולטני הגחון ועל גב משמרות התנהגות תא קרוב יותר לזה שנמצא בסביבות 3D. בנוסף, בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך הוא כלי רב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים בתא / inte חומרractions, למשל, טופוגרפיה, נוקשות וציפוי חלבון שונה בשני הצדדים הגחון ועל גב. לבסוף, מאז תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, מספר הליכי ניתוח כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים יכול לשמש בדרך כלל, להתגבר על הליכים מורכבים יותר הנדרשים למערכות 3D.
Introduction
באופן מסורתי, תרבית תאים בוצעה על מצעים דו-ממדיים (2D), שרוב microenvironments הסלולרי in vivo יש לי טבע תלת ממדי (3D). סביבת 2D לא טבעית זה גורמת לשינויים בהתנהגות תא כדרך של הסתגלות עצמית לעולם שטוח, המשפיעה ישירות על תא גורל 1,2. לפיכך, תוצאות שהתקבלו בתרביות תאי 2D לא תמיד לשחזור in vivo. זה עודד את הפיתוח של מערכות תרבות הרלוונטיות חדשות המבקשות לספק תנאים כמו-פיסיולוגיים יותר כדי לקבל תובנות נוספות כל 3,4 מנגנון ביולוגי ממד תלוי.
אחד ההבדלים העיקריים בין תרבות 2D ו3D בסביבת vivo הוא ההפצה של קולטני תא מעוגן למטריצה תאית (ECM): בעוד ב2D מצעי תאים לדבוק ventrally, רוב התאים בגוף חי מוקפות לחלוטין על ידי ECM ו כך לסה"נהידבקות ll מתרחשת באמצעות הפצת 3D של הקולטנים. זה מעורר מסלולי איתות הידבקות תאים שונים ובכך ויסות תהליכים חשובים כגון צמיחת תאים, התמיינות תאים וביטוי גנים. במהלך העשורים האחרונים, מערכות תרבות 3D שונות הוקמו 5-8, אם כי שונות והמורכבות שלהם לעכב סטנדרטיזציה שלהם בהליכי תרבות תא משותף. יתר על כן מערכות 3D הן בדרך כלל לא קלה לטפל ופרוצדורות הנוכחיות על מצעי 2D לא ניתן לקבוע בקלות לתרבויות 3D. בנוסף, רק לעתים נדירות ספרות משווה תרבויות 3D עם מצב 2D שווה הערך או מערכות אחרות 3D, פוגע ההבנה הנכונה של התנהגות תא במודלים אלה.
ברגע שיש את התאים דבקים על מצע 2D, העירור של קולטני גב – על ידי שכיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) – יכול לעורר תגובות תא אחד סביבות 3D. המחשבהבן מאחורי זה הוא ההפעלה בו זמנית של שני גב וגחון קולטנים לדבוק והתפשט בתוך סביבת הכריך (איור 1) 9,10. כתוצאה מכך, תאים עוברים שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D 11,12. כך, גורל תא נקבע במהלך עצרת בגלל תרבות הכריך, מאז גירוי הגב מפעיל שינויים במסלולים סלולריים מפתח. לכן, גורל התא נקבע מאוד על ידי הזמן שבו התרבות כמו הכריך מורכבת 11.
בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך היא כלי פשוט ורב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים באינטראקציות תא / חומר כגון ציפויי כימיה, טופוגרפיה, נוקשות וחלבון בשני הצדדים הגחון ועל גב. זו מציעה רמה גבוהה יותר של גמישות בהשוואה למערכות אחרות 3D (איור 2) בשל הגב העצמאי ושילוב הגחון של נ 'רחבariety של תנאי שטח. בנוסף, ניתן ללמוד שורות תאים שונות ובזמנים שונים כדי להרכיב את התרבות כמו כריך, הגדלת הספקטרום הרחב של אפשרויות.
פרוטוקול סטנדרטי של התרבות כמו כריך מפורט להלן או באמצעות פולי-L-לקטית סיבי electrospun חומצה (PLLA) או סרטים כמו מצעי גב, coverslip זכוכית כמצע הגחון ופיברונקטין כציפוי חלבון. תרבויות כמו כריך נאספו רק לאחר זריעת תאים או אחרי 3 שעות של תרבות 2D. עם זאת, שימו לב שיכולים לשמש מערכות חומר אחרות וחלבונים; כמו כן התרבות כמו כריך ניתן להרכיב בנקודות זמן שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיום, תרבות 3D הוא נושא חשוב לתעשיית התרופות ביוטכנולוגיות וכמו גם מחקר בביולוגיה של תא, כוללים סרטן ותאי גזע. כתוצאה מכך כמה מערכות תרבות 3D פותחו. למרבה הצער, הבדלים בין מערכות 3D בדרך כלל התוצאה של התנהגות תא שונה, מעכבת את ההבנה של גורל תא. חוץ מזה, הפרוצדורות הן בדרך כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
