Abstract
وقد تم تنفيذ زراعة الخلايا عادة من على ثنائية الأبعاد (2D) ركائز حيث تلتزم الخلايا باستخدام مستقبلات البطنية على سطح مادة بيولوجية. ولكن في الجسم الحي، فإن معظم الخلايا محاطة تماما المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مما أدى إلى ثلاثي الأبعاد (3D) توزيع مستقبلات. وهذا قد يؤدي الاختلافات في الخارج في مسارات الإشارات، وبالتالي في سلوك الخلية.
يوضح هذا المقال أن تحفيز مستقبلات الخلايا الظهرية انضمت بالفعل إلى الركيزة 2D طريق تغطية فيلم من مادة جديدة (ثقافة مثل شطيرة) يطلق تغييرات هامة فيما يتعلق الثقافات 2D القياسية. وعلاوة على ذلك، والإثارة في وقت واحد من مستقبلات بطني وظهري التحولات سلوك الخلية أقرب إلى تلك التي وجدت في بيئات 3D. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لطبيعة النظام، ثقافة مثل شطيرة هو أداة متعددة الاستعمالات التي تسمح للدراسة معايير مختلفة في الخلية / المواد الأسواق العالمية ضغطهاractions، على سبيل المثال، والتضاريس، وصلابة والطلاء بروتين مختلفة في كلا الجانبين بطني وظهري. أخيرا، منذ تستند الثقافات مثل شطيرة على ركائز 2D، عدة إجراءات التحليل وضعت بالفعل للثقافات 2D القياسية يمكن استخدامها بشكل طبيعي، والتغلب على إجراءات أكثر تعقيدا اللازمة لأنظمة 3D.
Introduction
تقليديا، وقد تم تنفيذ خلية ثقافة الخروج على ثنائية الأبعاد (2D) ركائز، رغم أن معظم microenvironments الخلوية في الجسم الحي يكون لها ثلاثية الأبعاد (3D) الطبيعة. هذه البيئة 2D غير طبيعية تثير التغيرات في سلوك الخلية كوسيلة للتكيف الذاتي إلى عالم مسطح، مما يؤثر مباشرة مصير الخلية 1،2. وبالتالي، النتائج التي تم الحصول عليها في مزارع الخلايا 2D ليست دائما قابلة للتكرار في الجسم الحي. وقد شجع هذا على تطوير أنظمة جديدة للاستزراع ذات الصلة التي تسعى إلى تقديم مزيد من الشروط مثل الفسيولوجية للحصول على مزيد من نظرة ثاقبة أي البيولوجي 3،4 آلية تعتمد على البعد.
أحد الفروق الرئيسية بين الثقافة 2D و 3D على البيئة في الجسم الحي هو توزيع مستقبلات الخلايا ترتكز على المصفوفة خارج الخلية (ECM): بينما في 2D ركائز الخلايا على الالتصاق من الناحية البطنية، والغالبية العظمى من الخلايا في الجسم الحي محاصرون تماما من قبل ECM و وبالتالي ميحدث التصاق ليرة لبنانية من خلال توزيع 3D من المستقبلات. هذا بتشغيل مختلف مسارات التصاق الخلية إشارات وبالتالي تحوير العمليات الهامة مثل نمو الخلايا، تمايز الخلايا والتعبير الجيني. خلال العقود الماضية، تم إنشاء العديد من النظم الثقافة 3D المختلفة 5-8، على الرغم من التباين والتعقيد تعيق توحيد في الإجراءات خلية ثقافة مشتركة. وعلاوة على ذلك نظم 3D هي عادة ليست سهلة في التعامل معها والإجراءات التجريبية الحالية على ركائز 2D لا يمكن تأسيس بسهولة للثقافات 3D. بالإضافة إلى ذلك، الأدب نادرا ما يقارن الثقافات 3D مع حالة 2D تعادل أو الأنظمة الأخرى 3D، مما يعوق الفهم الصحيح للسلوك الخلية في هذه النماذج.
مرة واحدة لديها خلايا الالتزام على ركيزة 2D، وإثارة المستقبلات الظهرية - طريق تغطية فيلم من مادة جديدة (الثقافة مثل شطيرة) - يمكن أن تؤدي إلى استجابات الخلايا حد سواء بيئات 3D. الجرميةنجل وراء ذلك هو تفعيل في وقت واحد في كل من ظهري وبطني مستقبلات التمسك ونشر ضمن بيئة شطيرة (الشكل 1) 9،10. ونتيجة لذلك، والخلايا تخضع التغييرات الهامة فيما يتعلق الثقافات 2D 11،12. وبالتالي، يتم تحديد مصير الخلايا خلال التجمع بسبب ثقافة شطيرة، لأن التحفيز ظهري يحرض تغيرات في مسارات الخلوية الأساسية. لذلك، يتم تحديد حد كبير مصير الخلية الوقت الذي يتم تجميعها ثقافة مثل شطيرة 11.
نظرا لطبيعة النظام، ثقافة مثل شطيرة هو أداة بسيطة ومرنة تسمح دراسة معايير مختلفة في التفاعلات خلية / مواد مثل الكيمياء، والتضاريس، وصلابة والبروتين الطلاء في الجانبين بطني وظهري. وهذا يوفر درجة عالية من التنوع مقارنة بالأنظمة الأخرى 3D (الشكل 2) وذلك بسبب ظهري مستقل والجمع بين بطني من الخامس واسعةariety ظروف السطح. بالإضافة إلى ذلك، خطوط مختلفة من الخلايا وأوقات مختلفة لتجميع الثقافة مثل شطيرة يمكن دراستها، مما يزيد من أطياف واسعة من الاحتمالات.
وترد تفاصيل بروتوكول قياسي للثقافة مثل شطيرة أدناه باستخدام إما بولي-L-حمض اللاكتيك (PLLA) ألياف electrospun أو الأفلام بمثابة ركائز ظهري، ساترة الزجاج كما الركيزة بطني وفبرونيكتين كما البروتين الطلاء. تم تجميع الثقافات مثل شطيرة فقط بعد البذر الخلية أو بعد 3 ساعات من ثقافة 2D. ومع ذلك، لاحظ أن أنظمة المواد الأخرى والبروتينات يمكن أن تستخدم. وبالمثل ثقافة مثل شطيرة يمكن تجميعها في نقاط زمنية مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنتاج في ظهري ركائز
- إنتاج فيلم شقة من PLLA من قبل الصب المذيبات.
- العمل في غطاء الدخان لإعداد محلول 2٪ (وزن / حجم) PLLA في الكلوروفورم (2 ز PLLA في 100 مل كلوروفورم) عن طريق اثارة في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى يذوب تماما (3 ساعات تقريبا).
- وضع غسالات على طبق بتري الزجاج.
ملاحظة: استخدام غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ مع قطرها الداخلي 10.5 مم (أصغر قليلا من قطر عينة بطني) بحيث يتم وضع الغسالة على رأس الركيزة بطني. غيرها من المواد مثل تترافلوروإيثيلين (PTFE) أو غسالات الزجاج يمكن أن تستخدم أيضا. - إضافة 200 ميكرولتر من محلول PLLA في الغسالة الكهربائية والسماح تتبخر ببطء لمدة 30 دقيقة في RT. من أجل السماح التبخر البطيء للمذيب، أغلق طبق بتري مع رقائق الألومنيوم مع بضعة ثقوب.
- تسخين العينات عند 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى تتبخر آثار المذيبات.
- السماح عينات بارد تفعلسفل في RT.
- بمجرد أن يبرد العينات إلى أسفل (30 دقيقة تقريبا)، مع تغطية 18.2 MΩ · سم الماء في طبق بتري واحتضان لمدة 8 دقائق في RT.
ملاحظة: إذا لم يتم تبريد العينات تماما أسفل، فإنها قد يستغرق فترة تصل 18.2 MΩ · سم المياه واعتماد الدولة مطاطي. بالإضافة إلى ذلك، يحتضنها 18.2 MΩ · سم الماء لمدة أقل من 8 دقائق قد يؤدي إلى انفصال غير لائق، ومنذ أكثر من 8 دقائق في مفرزة من الغسالة. - بشفرة حلاقة، نقب غسالات لقشر أجبرتها على الفرار طبق بيتري.
- إزالة أي عيوب من حافة غسالة مع ملاقط والسماح للعينات الهواء الجاف.
- تخزين العينات في فراغ مجفف (80 مليبار) حتى يوم من التجربة بسبب PLLA هو تحلل من قبل التحلل.
- إنتاج ألياف PLLA من قبل electrospinning.
- العمل في غطاء الدخان لإعداد محلول 8٪ (وزن / حجم) PLLA في hexafluoroisopropanol (8 ز PLLA في 100 مل hexafluoroisopropanol) من خلال stirrحتى يذوب تماما جي في RT (3 ساعات تقريبا).
- وضع تترافلوروإيثيلين (PTFE) غسالات على ورقة الألمنيوم أو على الطبول من أجل electrospinning من أجل الحصول على ألياف عشوائية أو الانحياز على التوالي.
ملاحظة: استخدام تترافلوروإيثيلين (PTFE) غسالات مع قطرها الداخلي 10.5 مم (أصغر قليلا من قطر عينة بطني) بحيث يتم وضع الغسالة على رأس الركيزة بطني. غيرها من المواد مثل غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ والزجاج يمكن أن تستخدم أيضا. طبل يجب تدوير في سرعة الزاوي من 160.7 ثانية -1 (نصف قطرها = 7 سم) من أجل الحصول على ألياف الانحياز. A سرعة أبطأ قد لا تؤدي إلى محاذاة الألياف وسوف سرعة أسرع يؤدي إلى كسر الألياف. - تحميل المحاقن مع الحل البوليمر ووضعه على ضخ حقنة.
- Electrospin الحل PLLA باستخدام معدل تدفق 0.9 مل / ساعة مع الجهد 30 كيلو فولت وبعد جمع 12 سم.
- وقف الخلف عملية electrospinningإيه 20-30 دقيقة، حالما يتم التوصل إلى كثافة الألياف الجيدة (منذ الخلايا لديها للتفاعل مع العديد من الألياف في وقت واحد).
- تسخين العينات عند 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى تتبخر آثار المذيبات.
- تخزين العينات في فراغ مجفف (80 مليبار) حتى يوم من التجربة بسبب PLLA هو تحلل من قبل التحلل.
الثقافة 2. ساندويتش
- تجميع الثقافة مثل شطيرة مرة واحدة يتم الالتزام الخلايا إلى 2D الركيزة بطني.
- العمل في غطاء الثقافة لضمان ظروف معقمة وتعقيم جميع المواد (coverslips الزجاج، ركائز ظهري، ملاقط، الخ) من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- معطف الركيزة بطني وظهري مع فبرونيكتين من أجل توجيه معين التصاق خلايا البروتين. للقيام بذلك، واحتضان العينات في 20 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين الذائبة في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (200 ميكرولتر / ثانيةوافرة) لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: نظرا لعملية التصنيع، ركائز ظهري لديها الجانبين العلوي والسفلي المعينة لأن مذيب محمل فيلم وelectrospun الألياف تعلق على أحد جانبي غسالة. ولهذا الجانب هو واحد التي تواجه الخلايا (الشكل 3).- بعد طلاء البروتين، وغسل العينات مرتين مع DPBS من أجل إزالة البروتين في الزائدة. ثم احتضان العينات في DPBS حتى استخدامها من أجل منع عينات من الحصول الجافة لأن هذا يسبب البروتين سحب الجنسية. استخدام DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ منذ الكاتيونات ثنائي التكافؤ تنظم البروتين للطي.
- خلايا البذور على الزجاج coverslips 13.
ملاحظة: كما يستند ثقافة مثل شطيرة على ركائز 2D، سيتم تنفيذ بذر خلايا مماثلة كما في عينة 2D. على سبيل المثال، المصنف C2C12 بالخلايا العضلية الجذعية في 17500 الخلايا المصنف سم -1 للتجارب التمايز وNIH3T3 الليفية في 7000 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية سم -1 للثقافات منعزلة لدراسة مورفولوجيا الخلايا والالتصاق. - وضع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ وتسمح للخلايا على الانضمام إلى الركيزة بطني لمدة 3 ساعة.
- وضع الركيزة المصنفة بطني في بئر جديد من لوحة 12 متعددة جيدا (حيث تناسب غسالات).
ملاحظة: تجميع الثقافة مثل شطيرة في بئر الجديد هي طريقة واحدة للتخلص من الخلايا التي انضمت إلى قاع البئر بعد البذر لأن هذه سوف تستهلك المواد الغذائية وتفرز عوامل النمو والنفايات التي تؤثر على الخلايا المزروعة داخل شطيرة مثل النظام. وهذا هو أيضا لا بد منه لإخراج الخلوية من أجل ليز فقط الخلايا مثقف ضمن بيئة تشبه شطيرة. - بعناية وبمساعدة من زوج من ملاقط، تراكب الركيزة ظهري على الخلايا. إعادة ملء مع المتوسط (1 مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
ملاحظة: سوف وزن الغسالة منع ظهري الفرعيةSTRATE من العائمة. - تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع كما هو الحال في الثقافات 2D القياسية. لا تتحرك الركيزة ظهري لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا.
- تجميع الثقافة مثل شطيرة فقط بعد البذر الخلية.
- العمل في غطاء الثقافة لضمان ظروف معقمة وتعقيم جميع المواد (coverslips الزجاج، ركائز ظهري، ملاقط، الخ) من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- معطف الركيزة بطني وظهري مع فبرونيكتين من أجل توجيه معين التصاق خلايا البروتين. للقيام بذلك، واحتضان العينات في 20 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين الذائبة في DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (200 ميكرولتر / عينة) لمدة 1 ساعة.
- بعد طلاء البروتين، وغسل العينات مرتين مع DPBS من أجل إزالة البروتين في الزائدة. ثم احتضان العينات في DPBS حتى استخدامها من أجل منع عينات من الحصول الجافة لأن هذا يسبب البروتين سحب الجنسية. استخدام DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+
- بعد طلاء البروتين، وغسل العينات مرتين مع DPBS من أجل إزالة البروتين في الزائدة. ثم احتضان العينات في DPBS حتى استخدامها من أجل منع عينات من الحصول الجافة لأن هذا يسبب البروتين سحب الجنسية. استخدام DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+
- خلايا البذور على coverslips الزجاج في بئر من لوحة 12 متعددة جيدا (حيث تناسب غسالات). للقيام بذلك، استخدم تعليق الخلوي عالية التركيز لتجنب فقدان الخلية بعد أن وضع الركيزة الظهرية.
- بعناية وبمساعدة من زوج من ملاقط، تراكب الركيزة ظهري على الخلايا. إعادة ملء مع المتوسط (1 مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
ملاحظة: سوف وزن الغسالة منع الركيزة الظهرية من العائمة. - تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع كما هو الحال في الثقافات 2D القياسية.
ملاحظة: لا تقم بتحريك الركيزة ظهري لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا.
تحليل 3.
ملاحظة: تستند الثقافات مثل ساندويتش على ركائز 2D، وهكذا يمكن تحليلها عادة من قبل الإجراءات التي وضعت بالفعل للثقافات 2D القياسية. على سبيل المثال، منذ PLLA شفافة وسلمقيدة ليرة سورية للتحرك داخل الطائرة س ص، ويتم الفحص المجهري كما على ركائز 2D. يمكن هجرة الخلايا وبالتالي تحليلها كما للثقافات 2D، من دون الحاجة إلى تتبع الخلايا في ض محور بالنسبة للثقافات 3D، الذي يبسط تحليل التجربة والصورة. لدراسة التئام الجروح فحص من قبل فحص الصفر اتبع هذا البروتوكول:
- الهجرة دراسة الخلية (التئام الجروح الفحص) داخل ثقافة مثل شطيرة.
- العمل في غطاء الثقافة لضمان ظروف معقمة وتعقيم جميع المواد (coverslips الزجاج، ركائز ظهري، ملاقط، الخ) من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- معطف الركيزة بطني وظهري مع فبرونيكتين من أجل توجيه معين التصاق خلايا البروتين. للقيام بذلك، واحتضان العينات في 20 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين الذائبة في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ لمدة 1 ساعة.
- بعد طلاء البروتين، وغسل العينات مرتين مع DPBSمن أجل إزالة البروتين في الزائدة. ثم احتضان العينات في DPBS حتى استخدامها من أجل منع عينات من الحصول الجافة لأن ذلك يمكن أن يسبب البروتين سحب الجنسية. استخدام DPBS التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ منذ الكاتيونات ثنائي التكافؤ تنظم البروتين للطي.
- خلايا البذور على coverslips الزجاج في مناطق ذات كثافة عالية (13).
- وضع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ وتسمح للخلايا لتحقيق التقاء.
- استخدام غيض ماصة الى نقطة الصفر أحادي الطبقة الخلية من أجل الحصول على 2 السكان خلية مفصولة الفجوة.
- وضع الركيزة المصنفة بطني بشكل جديد مناسبة جيدة لاقتناء مرور الزمن، وحيث تناسب ركائز ظهري (أي 12 لوحة متعددة جيدا).
- بعناية وبمساعدة من زوج من ملاقط، تراكب الركيزة ظهري على الخلايا ومن ثم إعادة ملء مع المتوسط (1 مل لوحة 12 متعددة أيضا).
ملاحظة: سوف وزن الغسالة منع رانه الظهرية الركيزة من العائمة. - وضع العينة في المجهر مرور الزمن (مجموعة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2)، والتقاط صور لإغلاق الفجوة كل 20 دقيقة.
- تحليل إغلاق الفجوة باستخدام برامج معينة مثل MiToBo المساعد من يماغيج 14
ملاحظة: يتم تنفيذ البروتين واستخراج الحمض النووي بالمثل كما على ركائز 2D. هناك خطوة إضافية واحدة فقط التي تتكون في تفكيك ثقافة مثل شطيرة لإضافة العازلة تحلل بشكل مباشر على الخلايا من أجل زيادة كفاءة الاستخراج. على سبيل المثال، لاستخراج مرنا:
- استخراج مرنا من الثقافات مثل ساندويتش
- إعداد جميع المخازن المؤقتة من عدة التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تأخذ الثقافة مثل شطيرة الخروج من الحاضنة.
- إزالة وسائل الإعلام الثقافة من العينات.
- غسل العينات مرة واحدة مع DPBS التي تحتوي على الكالسيوم2+ والمغنيسيوم 2+ (1 مل)، وإزالة كافة الحل.
- مع مساعدة من زوج من ملاقط، وإزالة الركيزة ظهري وإضافة تحلل العازلة (350 ميكرولتر) إلى الركيزة بطني. تراكب مرة أخرى الركيزة ظهري على الركيزة بطني من أجل ليز أيضا الخلايا انضمت إلى الركيزة الظهرية.
- إزالة الركيزة ظهري لعزل حل تحلل.
- اتبع تعليمات الشركة الصانعة للحصول على مرنا.
ملاحظة: مناعي للبروتينات لا يمكن أن يؤديها أيضا على ركائز 2D. منذ الثقافات مثل شطيرة يمكن أن تعيق نشر الصحيح من الأضداد، ومخازن، وينبغي زيادة مرات الحضانة. أيضا، شطيرة يمكن تفكيكها قبل البدء في بروتوكول تلطيخ ولكن في هذه الحالة الأخيرة بعض الخلايا ستبقى تعلق على الركيزة ظهري والبعض الركيزة بطني.
- البروتينات Immunodetect داخل ثقافة مثل شطيرة
ملاحظة: يمكن إزالة الركيزة ظهري أثناء عملية التثبيت بحيث يتم تجنب مشاكل نشرها. - شطف مع DPBS (1 مل) ثم permeabilize مع 0.5٪ تريتون X-100 في DPBS (1 مل) لمدة 5 دقائق على RT.
- حجب المواقع غير الملزمة محددة مع 1٪ الزلال في DPBS (1 مل) لمدة 30 دقيقة في RT.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (2 ميكروغرام / مل؛ 1 مل) في عرقلة الحل لمدة 3 ساعة على RT.
- يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة مع DPBS / 0.5٪ توين 20 (1 مل).
- احتضان 2 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية (2 ميكروغرام / مل)، و1 ميكروغرام / مل دابي في عرقلة الحل (1 مل) في RT.
- يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في DPBS / 0.5٪ توين 20 (1 مل).
- يغسل في DPBS.
ملاحظة: عينات يمكن تركيبه على شريحة مع Vectashield ومختومة مع طلاء الأظافر عندما تتم إزالة ركائز الظهرية قبل أن مناعي. - مراقبة تحت مضان الصغيرنطاق بالنسبة للركائز 2D القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحفيز مستقبلات ظهري داخل الثقافة مثل شطيرة يحرض تغيرات في شكل الخلية، التصاق الخلايا ومسارات الإشارات بين الخلايا (مثل كيناز الالتصاق التنسيق، FAK) 10-12. على سبيل المثال، الخلايا الليفية مثقف داخل منظومة تشبه شطيرة overexpressed في إنتغرين الوحيدات α 5 مقارنة 2D، كما لوحظ للثقافات الأخرى 3D 15،16.
مصير الخلايا يعتمد بشكل كبير على الوقت عندما يتم تحفيز مستقبلات ظهري وخصائص التفاعل ظهري، وعلى نحو مماثل يحدث في أنظمة 3D أخرى مثل الهلاميات المائية. على سبيل المثال، الهلاميات المائية حيث لا بد البروتينات بإحكام عادة ما تظهر خلايا صغيرة مدورة ومع متخلفة الأكتين الهيكل الخلوي ومنتشر الالتصاقات البؤرية. وهذا يمكن أن تحاكي في ثقافة استخدام ركائز مثل شطيرة أن تمتص البروتينات بإحكام، بحيث الخلايا ليست قادرة على إعادة تنظيم ميكانيكيا هذه الطبقة من البروتينات وsprea الخليةإن ما يعرقل قرع. وبالمثل، الهلاميات المائية حيث الخلايا يمكن أن يعيد ECM يمكن تحاكي مع نظام ساندويتش باستخدام ركائز أن تمتص البروتينات أكثر فضفاضة 10.
وقد تبين تحفيز مستقبلات ظهري لتعديل C2C12 مصير الخلية. الظهرية الألياف PLLA electrospun محاذاة الخلية مباشرة عندما المغلفة مع فبرونيكتين ولكن ليس عندما المغلفة مع ألبومين المصل البقري (بروتين غير لاصقة). وتشير هذه النتيجة من الخلايا تفعل بمعنى بيولوجيا والرد على مدخلات الظهرية (الشكل 4) 9. بالإضافة إلى ذلك، تسببت الثقافات مثل شطيرة مع الظهرية الطائرة PLLA زيادة في مستوى تكون العضل. هذا يعتمد أيضا على المحفزات البيولوجية ظهري منذ التفاعل مع النتائج البروتينات ظهري مختلفة في معدلات التمايز متميزة (الشكل 5) 9.
يتم تبديل هجرة الخلايا داخل الثقافة مثل شطيرة أيضا بالمقارنة مع الثقافة 2D. لها أن تكون أون أظهرت أن في فحص التئام الجروح، والخلايا داخل الثقافة شطيرة تعتمد التشكل ممدود للغاية وتهاجر مسافات أقصر من على ركائز 2D (أفلام 1 و 2). معدلات الهجرة الخلية ترتبط كذلك إلى طبيعة التحفيز بطني وظهري 12.
وبالمثل كما في 3D فبرونيكتين والكولاجين والمواد الهلامية 17،18 والثقافة مثل شطيرة يزيد بوساطة الخلايا ECM إعادة التنظيم (أي فبرونيكتين بطني) فيما يتعلق الشرط 2D (الشكل 6) 12. وتعتمد هذه العملية على المحفزات الميكانيكية ظهري والاستقرار الهيكل الخلوي لأن استخدام مثبطات انقباض (blebbistatin، Y27632) أعاقت العملية. ومن المثير للاهتمام، أعيد تنظيم فبرونيكتين بطني أيضا عند استخدام مختلف الطلاء البروتين ظهري (أي vitronectin والمصل البقري الزلال) وحتى إذا ما تركت غير المصقول 12.
ف together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1:.. كروكي للمعيار (2D) والثقافات مثل شطيرة تحفيز مستقبلات ظهري داخل الثقافة مثل شطيرة يطلق إضافية مما يشير الى التصاق الخلية التي ينظم العمليات الخلوية هامة يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ثقافة مثل ساندويتش هو نظام متعدد الاستعمالات التي تسمح بدراسة البارامترات المختلفة تسيطر عليها بشكل جيد (المدخلات الطبوغرافية، وصلابة، التدرجات ...) على كل من ركائز بطني وظهري.
> 
الرقم 3: يتم رسمت ركائز ظهري لكل من أعلى والمقطع العرضي عرض من أجل إظهار أن لديهم أعلى المعينة والجانب السفلي (A) فيلم شقة PLLA و (B) electrospun الألياف.
الرقم 4: C2C12 التشكل في ظل ظروف ثقافة مختلفة بما في ذلك طائرة (ع) والألياف الانحياز (أ) من PLLA التي كانت تستخدم لبطني (منخفض) أو الظهرية (مرتفع) ركائز خطوط منقط تمثل الألياف التوجه عند الضرورة. الخلايا المستزرعة على الركيزة الطائرة ومضافين مع الألياف الانحياز من PLLA (SW ص أ) الشعور المحفزات الظهرية. بشكل خاص، خلايا تتحسس الألياف ظهري عندما المغلفة مع فبرونيكتين ولكن ليس عندما المغلفة وايال ألبومين المصل البقري (بروتين غير لاصقة). وبناء على ذلك خلايا التمسك الألياف مغلفة فبرونيكتين وتوائم في نفس الاتجاه. صورة مقتبسة من الإشارة 9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تمايز الخلايا في الثقافات مثل شطيرة بعد 4 أيام في وسائل الإعلام التمايز. وقد تم تحليل الظروف والثقافة المختلفة بما في ذلك طائرة (ع) والألياف الانحياز (أ) من PLLA التي كانت تستخدم ل(منخفض) بطني أو ظهري (مرتفع) ركائز. وقد تم طلاء العينات مع فبرونيكتين في جميع الحالات. (A) الإسفار تلطيخ تظهر خلايا الميوسين الساركومير الإيجابية (الخضراء) ونوى الخلايا (الحمراء). (B) المتمايزةخلايا التوجه وفقا لحسابات تحويل فورييه السريع. (C) تكون العضل على النحو الذي تحدده النسبة المئوية للخلايا-الميوسين إيجابي الساركومير. البيانات غير طبيعية لسيطرة الذهب القياسية. يشار إلى فروق ذات دلالة إحصائية مع *** P <0.001. صورة مقتبسة من الإشارة 9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إعادة تنظيم فبرونيكتين بطني. ثقافة شطيرة مشغلات بطني FN إعادة التنظيم من خلال تشكيل الألياف فبرونيكتين جديدة (وسم مثل فرشاة؛ أشار مع السهام البيضاء)، وتنظيم فبرونيكتين بطني داخل الثقافات مثل شطيرة مع مختلف طلاء البروتين الظهرية (فبرونيكتين، vitronectin وألبومين المصل البقري)أو حتى عندما يتم ترك الركيزة ظهري غير المصقول. الهيكل الخلوي أكتين (الأخضر)، والنوى (الأزرق) وFN (أحمر) وترد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: الهجرة خلية على 2D. L929 الليفية المهاجرة على فبرونيكتين المغلفة الزجاج ساترة في التئام الجروح الفحص. تم الحصول على الصور لمدة 16 ساعة (مع إطار اتخاذ كل 20 دقيقة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
كانت الهجرة خلية داخل الثقافة مثل شطيرة L929 الليفية المهاجرة في التئام الجروح فحص داخل ثقافة مثل شطيرة كانت الركيزة بطني فبرونيكتين المغلفة الزجاج ساترة والركيزة ظهري فبرونيكتين المغلفة فيلم PLLA: فيلم 2. تم الحصول على صور لمدة 16 ساعة (مع إطار اتخاذ كل 20 دقيقة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الوقت الحاضر، والثقافة 3D هو موضوع مهم لصناعة الأدوية والتكنولوجيا الحيوية، وكذلك البحث في بيولوجيا الخلايا، بما في ذلك السرطان والخلايا الجذعية. ونتيجة لذلك تم تطوير عدة أنظمة ثقافة 3D. لسوء الحظ، فإن الاختلافات بين النظم 3D يؤدي عادة في سلوك الخلية مختلفة، مما يعوق فهم مصير الخلية. الى جانب ذلك، الإجراءات التجريبية هي عادة ليست مباشرة كما لأنظمة الثقافة 2D. تطوير أنظمة جديدة للاستزراع بالتالي تسعى إلى التغلب على بعض هذه العيوب من المهم للغاية.
وقد تبين الثقافة مثل شطيرة على التأثير بقوة العمليات الرئيسية الخلوية مثل تمايز الخلايا، مورفولوجيا الخلايا، مما يشير الى الخلية والهجرة الخلية. وعلاوة على ذلك حصة خلايا التشابه مع الخلايا المستزرعة في أنظمة 3D، ودعم بيان أن الثقافة مثل شطيرة تربط 2D مع أنظمة الثقافة 3D. الأنسجة الفسيولوجية لها المسام في حدود 3-14 μم هذا القيد الخلايا وبالتالي تؤثر العمليات الخلوية مثل الهجرة. ولخص هذا بطريقة أو بأخرى باستخدام نظام مثل شطيرة كما ظهري وبطني المحفزات يمثل في حد ذاته بيئة مقيدة يحد من مورفولوجيا الخلايا وستؤثر بالضرورة الهجرة الخلية بغض النظر عن الطلاء البروتين.
بسبب التحفيز في وقت واحد من ظهري وبطني مستقبلات والثقافة مثل شطيرة هي تقنية قوية للتحقيق في دور الأبعاد في سلوك الخلية. وعلاوة على ذلك، لأنه يقوم على ركائز 2D، وهذا النظام هو ثقافة تنوعا للغاية لدراسة مختلف خصائص المواد والمدخلات ECM السماح للدراسة سلوك الخلية تحت microenvironments مختلفة. الى جانب ذلك، تأثير الوقت الذي يتم تحفيز مستقبلات ظهري على مصير الخلايا يمكن التحقيق من قبل تتراكب الركيزة الظهرية عند نقاط زمنية مختلفة. وبالتالي، على عكس الأنظمة الأخرى 3D، ويوفر النظام مثل شطيرة مجموعة واسعةمن يسيطر جيدا microenvironments الخلوية. وبالتالي فإن نظام يشبه ساندويتش مثيرة للاهتمام منصة زراعة الخلايا لمحاكاة بيئات الفسيولوجية المختلفة لدراسة بيولوجيا الخلية ومصير خلية الاختبار في ظل ظروف ثقافة مختلفة.
كما ذكرت من قبل، ميزة واحدة لهذا النظام هو أن مختلف ركائز البطنية والظهرية يمكن دراستها باستخدام الطلاء البروتين المختلفة. ولذلك، المعالم الهامة لمصير الخلية مثل كثافة يجند يمكن ضبطها من خلال التحكم في كثافة يجند كل واحد من ركائز 2D المستخدمة (مثل ركائز بطني وظهري). ومع ذلك، لاحظ أن ركائز مختلفة قد تحتاج التغييرات في البروتوكول. على سبيل المثال، وذلك باستخدام ركائز الظهرية أكبر قد يؤدي إلى الحاجة إلى ضبط الوقت الحضانة المناسبة لقشر عينات من طبق بيتري. وبالمثل، يمكن ركائز بطني اكبر ينتج في مناطق ميتة في مركز العينة بسبب نفاذية الأكسجين محدودة من بطنيالركيزة (بسبب ساترة الزجاج). بالإضافة إلى ذلك، سوف إجراءات التحليل تعتمد على خصائص الركيزة. على سبيل المثال، وذلك باستخدام ركائز ظهري مبهمة سوف تعيق بروتوكولات الفحص المجهري القياسية على الرغم من أنه لا يزال يسمح البروتين / استخراج الأحماض النووية. عامل رئيسي آخر هو نفاذية الركيزة ظهري منذ ينبغي أن يسمح للخلايا للحصول على المواد الغذائية من المتوسطة وتجاهل النفايات.
وخلاصة القول، ثقافة مثل شطيرة هو نظام بسيط هو أن يوفر إمكانية لمحاكاة مختلف microenvironments مثل 3D للتحقيق في مصير الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
