Abstract
細胞培養物は、伝統的に、細胞が生体材料の表面に腹受容体を使用して接着する二次元（2D）基板上で行われています。しかしながら、インビボで 、細胞のほとんどは完全に受容体の三次元（3D）分布をもたらす、細胞外マトリックス（ECM）によって囲まれています。これは、シグナル伝達経路における外、したがって細胞の挙動での違いをトリガすることができます。
この記事では、すでに新素材（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ね合わせることによって、2D基板に付着した細胞の背側の受容体を刺激すると、標準の2D文化に対する重要な変更をトリガーすることを示しています。また、腹側と背側の受容体の同時励起が近い3D環境で見られるものと細胞の挙動をシフトします。また、原因システムの性質上、サンドイッチ状の培養は、細胞/材料INTEで異なるパラメータの研究を可能にする汎用性の高いツールです。ractions、 例えば 、地形、剛性との両方の腹と背側面に異なるタンパク質コーティング。サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているので、最終的に、既に標準的な2D培養のために開発され、いくつかの分析手順は、3Dシステムのために必要な、より複雑な手順を克服し、正常に使用することができます。
Introduction
インビボ細胞微小環境の大部分は3次元（3D）の性質を持っているのに伝統的に、細胞培養物は、二次元（2D）基板上で行われています。この不自然な2D環境では、フラット世界に自己適応の方法として、細胞の挙動の変化をトリガし、これに直接影響を与える細胞の運命1,2。したがって、2D細胞培養に得られた結果は、 生体内で常に再現性がありません。これは、任意の次元に依存する生物学的メカニズムの3,4へのさらなる洞察を得るために、より生理的に似た条件を提供しようとしている新しい関連する培養システムの開発を奨励してきました。
2Dおよび3D培養における生体内環境との間の主な違いの1つは、細胞外マトリックス（ECM）に固定細胞受容体の分布である：2Dに細胞が腹側に付着する基質に対して、 インビボでの細胞の大部分は、完全にECMに囲まれているとこのように、CELLの接着は、受容体の三次元分布を介して行われます。これにより、細胞増殖、細胞分化および遺伝子発現のような重要なプロセスを調節する別の細胞接着シグナル伝達経路を誘発します。その変動性と複雑さは、一般的な細胞培養手順での標準化を妨げるのに、最後の十年の間に、多くの異なる三次元培養系は、5-8を確立されています。また3Dシステムは、通常、取り扱いが容易ではなく、2D基板上に現在の実験手順は、簡単に3Dの文化のために確立することはできません。さらに、文献はほとんどこれらのモデルにおける細胞の挙動の適切な理解を妨げ、同等の2D条件や他の3Dシステムと3Dの文化を比較しません。
一度2D基板上に付着した細胞を持つ、背側の受容体の励起 - 新材料（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ねることでは - 似た3D環境の細胞応答を誘発することができます。 REAこの背後にある息子は背側と腹側の受容体付着およびサンドイッチ環境内で拡散する（ 図1）9,10の両方の同時活性化です。結果として、細胞は、2D培養物11,12に対する重要な変更を受けます。背側刺激が重要な細胞経路の変化をトリガするのでこのように、細胞の運命は、理由サンドイッチ文化の組み立て中に決定されます。したがって、細胞の運命は非常にサンドイッチ状培養11を組み立てられた時点で決定されます。
によるシステムの性質上、サンドイッチ状文化は両方腹と背側部で、このような化学、地形、剛性およびタンパク質のコーティングなどの細胞/材料の相互作用における異なるパラメータの研究を可能にする、シンプルで汎用性の高いツールです。これは、幅の広いVの独立した背と腹の組み合わせに他の3Dシステム（ 図2）に比べて汎用性の高い学位を提供しています表面状態のariety。また、サンドイッチ状培養を組み立てるために、異なる細胞株および異なる時間での可能性の広いスペクトルを増加させる、研究することができます。
サンドイッチ様培養の標準プロトコルは、タンパク質コーティングなどの腹側基板およびフィブロネクチンのような背側基板としてカバーガラスをポリ-L-乳酸（PLLA）エレクトロ繊維またはフィルムのいずれかを用いて以下に詳述します。サンドイッチ状の文化だけで、細胞播種後または2D培養3時間後に組み立てました。しかし、他の材料系およびタンパク質を使用できることに注意。同様にサンドイッチ状培養を異なる時点で組み立てることができます。
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Protocol
背の基板1の製造
- 溶媒キャスティングによるPLLAのフラットフィルムの製造。
- 完全に溶解するまで（約3時間）、室温（RT）で攪拌し、クロロホルム中の2％（w / v）のPLLA（100mLのクロロホルム中の2gのPLLA）の溶液を調製し、ドラフト中で作業。
- ガラスシャーレ上にワッシャーを配置します。
注：（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径で使用ステンレス鋼ワッシャをワッシャが腹側基板の上に配置されるようになっています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）またはガラス洗濯機のような他の材料も同様に使用することができます。 - 洗濯機でPLLA溶液200μlを加え、室温で30分間ゆっくりと蒸発させます。溶媒をゆっくり蒸発を可能にするために、いくつかの穴を持つアルミホイルでペトリ皿を閉じ。
- 溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。
- サンプルはクールやってみましょうRTでWN。
- サンプルは（30分程度）まで冷却した後、ペトリ皿中·cmの水18.2MΩで覆い、室温で8分間インキュベートします。
注：サンプルを完全に冷却されていない場合は、·cmの水18.2MΩを取るとゴム状態を採用することができます。さらに、8未満分·cmの水18.2MΩでインキュベートして、不適切な脱離で、ワッシャから離脱以上の8分なることがあります。 - かみそりの刃で、ペトリ皿を、それらを剥離するワッシャを取り外します。
- ピンセットでワッシャの端から任意の欠陥を除去し、試料は空気乾燥してみましょう。
- PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。
- エレクトロスピニングによるPLLA繊維の製造。
- stirrによりヘキサフルオロイソプロパノール中の（w / v）のPLLA（100ミリリットルヘキサ8グラムPLLA）8％の溶液を調製し、ヒュームフード内で作業完全に溶解するまで（約3時間）は室温でる。
- それぞれランダムまたは整列した繊維を得るために、アルミニウムシート上に、またはエレクトロスピニングのためのドラムにポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、洗濯機を置きます。
注：使用し、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ワッシャー（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径を有するワッシャを腹側基板の上に配置されるようになっています。例えば、ステンレス鋼又はガラスワッシャーのような他の材料も同様に使用することができます。ドラムは、整列した繊維を得るためには160.7秒-1（半径= 7センチ）の角速度で回転させるべきです。遅い速度は、繊維配向と壊れた繊維になります高速化は発生しません。 - ポリマー溶液と注射器をロードして、シリンジポンプの上に置きます。
- 30キロボルトの電圧を0.9ミリリットル/時間の流速及び12cmのコレクタ距離を用いてPLLA溶液をエレクトロスピニング。
- エレクトロスピニング法の後方を停止ER 20〜30分、（細胞は、同時に複数の繊維と相互作用する必要があるため）一度良好な繊維密度が達成されます。
- 溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。
- PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。
2.サンドイッチ文化
- 細胞は腹側2D基板に接着されるとサンドイッチ状文化を組み立てます。
- 培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。
- 特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa 2+およびMg 2+（200μL/秒を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベート1時間）十分。
注：溶剤キャストフィルムとエレクトロ繊維は洗濯機の側面の一方に取り付けられているためにより製造工程に、背側基板は、指定された上部と下部の側面を持っています。この辺は、したがって、細胞（ 図3）に対向するものです。- タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa 2+およびMg 2+を含む使用DPBS。
- ガラスの種子細胞は13をカバースリップ。
注：サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているように、細胞播種は、2Dサンプル上と同様に行われます。例えば、C2C12筋芽は-1分化実験およびNIH3T3線維芽細胞のためには、7,000℃で播種された17,500個の細胞で播種し、ellsの-1細胞形態との密着性を研究するために、単離された培養物について。 - 5％CO 2で37℃のインキュベーターでサンプルを置き、細胞が3時間腹基板に接着することができます。
- （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートの新しいウェル内腹シードの基板を配置します。
注：新しい十分にサンドイッチ状文化を組み立てることは、これらの栄養素を消費し、内の培養細胞に影響を与える増殖因子および廃棄物を分泌するため、播種後ウェルの底に付着した細胞を取り除くために一つの方法ですサンドイッチのようなシステム。これは、サンドイッチのような環境内で培養した細胞のみを溶解するために、また、細胞抽出のための絶対必要です。 - 慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO 2、37℃でインキュベートします。
注意：ワッシャーの重量は背側のサブを防ぐことができますフローティングからstrate。 - 標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。これは細胞の損傷につながる可能性があるので、背側基板を移動しないでください。
- ちょうど細胞播種後にサンドイッチ状文化を組み立てます。
- 培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。
- 特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa 2+およびMg 2+を 1時間（200μL/サンプル）を含むDPBSに溶解フィブロネクチンの20 / mlの中でサンプルをインキュベートします。
- タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。のCa 2+およびMgを含む使用DPBS
- タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。のCa 2+およびMgを含む使用DPBS
- （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートのウェル中のガラスカバースリップ上にシード細胞。これを行うには、背側基板を敷設した後、細胞の損失を回避するために、高度に濃縮された細胞懸濁液を使用しています。
- 慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO 2、37℃でインキュベートします。
注意：ワッシャーの重量はフローティングから背側基板を防ぐことができます。 - 標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。
注：これは、細胞損傷をもたらす可能性があるので、背側基板を移動しないでください。
3.分析
注：サンドイッチ状培養物を2D基板に基づいており、そのため一般に、既に標準2D培養のために開発された手順によって分析することができます。例えば、PLLAは透明とセル画であるため、LSは、xy平面内で移動するように拘束され、顕微鏡検査は2D基板上のように行われます。細胞移動は、従って、実験および画像解析を簡素化し、3D培養の場合と同様に、z軸に細胞を追跡する必要性なしに、2D培養の場合と同様に分析することができます。スクラッチアッセイによってアッセイ創傷治癒を研究するため、このプロトコルは、次のとおりです。
- サンドイッチ状の培養内の研究細胞の移動（創傷治癒アッセイ）。
- 培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。
- 特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、1時間2+のCa 2+およびMgを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベートします。
- タンパク質コーティングの後、DPBSで二回サンプルを洗浄過剰なタンパク質を除去するためです。そして、これはタンパク質の変性を引き起こす可能性があるので、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa 2+およびMg 2+を含む使用DPBS。
- 高密度13でガラスカバースリップ上の細胞をシード。
- 5％CO 2で37℃のインキュベーター内でサンプルを置き、細胞がコンフルエンスを達成することを可能にします。
- ギャップによって分離2細胞集団を得るために細胞単層を傷つけピペットチップを使用してください。
- タイムラプス取得のための新しい同様に適切で腹シードの基板を配置し、背側の基板（ すなわち 12マルチウェルプレート）を取り付けてあります。
- 慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイしてから（12マルチウェルプレートには1 ml）を培地に補充します。
注意：ワッシャーの重量はTを防ぐことができます彼は、フローティングから基板を背側。 - （37℃、5％CO 2に設定）タイムラプス顕微鏡でサンプルを置き、隙間閉鎖の画像ごとに20分を取ります。
- このようなImageJのプラグインからのMiToBoとして、特定のソフトウェアを使用して、隙間閉鎖を分析します。14
注：タンパク質および核酸抽出を2次元基板上と同様に行われます。抽出効率を向上させるために細胞に直接、溶解緩衝液を添加することがサンドイッチ状培養物を分解することからなる唯一の余分なステップがあります。例えば、mRNA抽出のために：
- サンドイッチ状の培養からmRNAを抽出します
- 製造業者の説明書に従って市販のキットからすべてのバッファを準備します。
- インキュベーターからサンドイッチ状文化を取り出します。
- サンプルから培地を除去します。
- カルシウムを含むDPBSで一度サンプルを洗います2+およびMg 2+（1ml）およびすべてのソリューションを削除します。
- ピンセットの助けを借りて、背側基板を除去し、腹側基板に溶解バッファー（350μl）を追加します。また、背側基板に付着した細胞を溶解するために、再び腹基板上に背側基板をオーバーレイ。
- 溶解液を分離するために背側基板を取り外します。
- のmRNAを取得するには、製造元の指示に従ってください。
注：タンパク質の免疫検出はまた、2D基板上のように行うことができます。サンドイッチ状の文化が、抗体および緩衝液の正確な拡散を妨げる可能性があるため、インキュベーション時間を増やす必要があります。また、サンドイッチは、染色プロトコルを開始する前に分解することができるが、後者の場合には、いくつかの細胞が背側基板と腹側の基板にはいくつかに付着したままになります。
- サンドイッチ状文化内Immunodetectタンパク質
注：背側基板は、拡散の問題が回避されるように、固定プロセスの間に除去することができます。 - DPBS（1ml）ですすぎ、次いで室温で5分間、DPBS中0.5％トリトンX-100（1 ml）で透過性。
- RTで30分間、DPBS中の1％アルブミン（1mL）で非特異的結合部位をブロックします。
- 一次抗体とインキュベート（2 / mlの、1ミリリットル）を室温で3時間ブロッキング溶液中で。
- DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。
- 室温で溶液（1 ml）を遮断する二次抗体（2μg/ ml）および1 / mlのDAPIで2時間インキュベートします。
- DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。
- DPBSで洗浄します。
注：サンプルは、ベクタシールドでスライド上にマウントし、背側基板は、従来の免疫削除されたときにマニキュアで封止することができます。 - 蛍光マイクロ下で観察します標準の2D基板用としてスコープ。
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Representative Results
サンドイッチ状の培養内の背側の受容体の刺激は、細胞形態の変化、細胞接着および細胞内シグナル伝達経路（ 例えば、焦点接着キナーゼ、FAK）10〜12をトリガーします。他の3Dの文化15,16のために観察されるような例として、サンドイッチ状システム内で培養した線維芽細胞は、2Dと比較して、α5インテグリンサブユニットを過剰発現しました。
細胞の運命は、ヒドロゲルなどの他の3Dシステムで起こるのと同様に、背側の受容体が刺激される時間におよび背側の相互作用の性質によって大きく依存しています。例えば、タンパク質が強固に結合されたヒドロゲルは、通常、未開発のアクチン細胞骨格と小さく、丸みを帯びた細胞を示し、焦点癒着を拡散します。細胞は機械的に、このタンパク質の層と細胞spreaを再編成することができないようにするために、しっかりとタンパク質を吸着基板を用いたサンドイッチ状培養中で模倣することができます鼎が阻害されます。同様に、細胞がECMを再構築することができるヒドロゲルはタンパク質をより緩やかに10を吸着した基板を用いて、サンドイッチ方式で模倣することができます。
背受容体の刺激は、C2C12細胞の運命を調節することが示されています。フィブロネクチンでコーティングした場合には、ウシ血清アルブミン（非接着性タンパク質）で被覆されていないときにエレクトロPLLA繊維を直接細胞を背側アラインメント。この結果は、細胞は、生物学的な意味を行い、背側入力（ 図4）9に反応指摘します。さらに、平面背PLLAとサンドイッチ状培養は筋形成のレベルの増加を引き起こしました。これは明確な分化率の異なる背タンパク質の結果（ 図5）9との相互作用するので、背の生物学的刺激にも依存します。
2D培養物と比較した場合、サンドイッチ状培養内の細胞遊走も変更されます。それがあることがあり創傷治癒アッセイにおいて、サンドイッチ培養中の細胞は非常に細長い形態を採用し、2Dの基板（ 作品1及び2）よりも短い距離を移動することを示すアン。細胞遊走率はさらに腹側と背側の刺激12の性質に関連しています。
同様に、3Dのフィブロネクチンおよびコラーゲンゲル17,18内のように、サンドイッチ状の培養は、2Dの状態（ 図6）12に対してで細胞媒介性のECMの再編成（ すなわち、腹側フィブロネクチン）を増加させます。収縮抑制剤（ブレビスタチン、Y27632）の使用は、プロセスを妨害するので、このプロセスは、背の機械的刺激と細胞骨格の安定性に依存しています。興味深いことに、腹フィブロネクチンは、異なる背タンパク質コーティングを使用した場合（ すなわち、ビトロネクチンおよびウシ血清アルブミン）を再編成し、12コーティングされていない場合であっても放置しました。
図1：標準のスケッチ（2D）とサンドイッチ状文化サンドイッチ状培養内の背側の受容体の刺激が重要な細胞プロセスを調節する追加の細胞接着シグナル伝達を誘発する。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2：サンドイッチ状文化は両方の腹側と背側の基板上の異なるよく制御されたパラメータ（地形入力、剛性、勾配...）の研究を可能にする汎用性の高いシステムです。
図3：背側の基板は、指定された上部と下部の側面を持って示すために、上部及び断面図の両方のために描かれている（A）フラットPLLAフィルムと（B）エレクトロ繊維。
図4：平面（P）および腹側（添字）または背側（上付き文字）を基質として使用したPLLAの整列した繊維（A）を含む、異なる培養条件下でC2C12形態点線は必要な繊維の向きを表します。平面基板とPLLAの整列した繊維を重層（SW Pが A）上で培養した細胞は、背の刺激を感知します。特に、細胞は、フィブロネクチンで被覆されたが、のWiコーティングされていないときに背繊維を感知します目のウシ血清アルブミン（非接着性タンパク質）。その結果、細胞は、フィブロネクチンでコーティングされた繊維に付着し、同じ方向に整列します。参照9から適応イメージ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5：分化培地で4日後にサンドイッチ状培養における細胞分化。様々な培養条件は、面（P）および腹側（添字）または背側（上付き文字）の基質として使用したPLLAの整列した繊維（A）を含む分析した。サンプルは、すべての場合において、フィブロネクチンでコーティングしました。 （A）筋節ミオシン陽性細胞（緑色）および細胞核（赤）を示す蛍光染色。 （B）差別化高速フーリエ変換することによって計算されるセルの配向。筋節ミオシン陽性細胞の割合によって決定される（C）筋形成。データは、金標準コントロールに正規化されます。統計的に有意な差は、*** P <0.001で示されています。参照9から適応イメージ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6：腹フィブロネクチンの再編。 （ブラシ状標識、白い矢印で指摘）サンドイッチ文化は新しいフィブロネクチン原線維を形成することにより、腹側FNの再編成をトリガー腹フィブロネクチンが異なる背タンパク質コーティング（フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびウシ血清アルブミン）でサンドイッチ状の文化の中に再編成されます。または背面基板は、コーティングされていない残っている場合でも。アクチン細胞骨格（緑）、核（青）とFN（赤）が示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
映画1：2Dの細胞遊走。 L929は、線維芽細胞創傷治癒アッセイでフィブロネクチンコーティングしたガラスカバースリップ上に移行する。画像は（20分毎に撮影したフレームで）16時間を取得した。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
ムービー2：サンドイッチ状培養内の細胞遊走サンドイッチ状文化の中で創傷治癒アッセイに移行L929線維芽細胞は、腹側基板は、フィブロネクチンでコーティングされたガラスカバースリップと背側基板フィブロネクチンコーティングしたPLLAフィルムでした。画像は（20分毎に撮影したフレームで）16時間に取得しました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在、3D培養は、癌および幹細胞を含む医薬品やバイオテクノロジーの業界だけでなく、細胞生物学の研究のための重要なトピックです。結果として、いくつかの3D培養系が開発されています。残念ながら、3Dシステムの違いは、通常、細胞の運命の理解を妨げ、別の細胞の挙動をもたらします。また、実験手順は、通常の2D培養システムのためのほど簡単ではありません。したがって、これらの欠点のいくつかを克服しようとしている新しい培養システムを開発することは非常に重要です。
サンドイッチ様培養物は、細胞分化、細胞形態、細胞シグナル伝達および細胞遊走などの重要な細胞プロセスに強く影響を及ぼすことが示されています。サンドイッチ状文化が3D培養システムと2Dを結ぶという声明を支持する3Dシステムで培養した細胞とさらに細胞株の類似性。生理的な組織が3〜14のμの範囲の孔を有しますしたがって、細胞を制約し、mは、そのような移行などの細胞プロセスに影響を与えます。これは、何らかの形で背側と腹側の刺激のようにサンドイッチ状システムを使用して再現しさそれ自体が細胞の形態を制限し、必ずしもかかわらず、タンパク質コーティングの細胞遊走に影響を与える環境に制約を表します。
による背側と腹側の受容体の同時刺激に、サンドイッチ状の培養は、細胞の挙動における次元の役割を調査するための堅牢な技術です。それは2Dの基板に基づいている。また、この培養システムは、異なる微小環境下で細胞の挙動の研究を可能にする異なる材料特性およびECM入力を研究するために、汎用性の高いです。また、背受容体は細胞の運命に刺激される時間の影響は、異なる時点で背面基板を重ね合わせることによって調べることができます。そのため、他の3Dシステムとは異なり、サンドイッチ状システムは、広いスペクトルを提供しますの細胞微小環境を十分に制御されました。従ってサンドイッチ状システムは、異なる培養条件下で細胞生物学および試験細胞の運命を調べるために、異なる生理学的環境を模倣するために興味深い細胞培養プラットフォームです。
前述したように、本システムの一つの利点は、異なる腹側と背側の基板が異なるタンパク質コーティングを用いて研究することができることです。したがって、そのようなリガンド密度などの細胞運命のための重要なパラメータは、使用される2次元基板の各々 （ 例えば、腹側と背側の基板）のリガンド密度を制御することにより調整することができます。しかし、異なる基板は、プロトコルの変更を必要とするかもしれないことに注意。例えば、より大きな背基板を使用してペトリ皿から試料を剥離するための適切なインキュベーション時間を設定する必要が生じ得ます。同様に、大きな腹側基板があるため、腹側の限られた酸素透過性のサンプルの中心に低酸素領域をもたらす可能性が基板（ガラスカバースリップに起因します）。さらに、分析手順は、基板の性質に依存するであろう。それはまだ、タンパク質/核酸抽出が可能になりますけれども、例えば、不透明な背基板を使用すると、標準的な顕微鏡検査プロトコルの妨げになります。細胞は培地から栄養素を取得し、廃棄物を廃棄するために許可する必要がありますので、もう一つの重要な要因は、背側基板の透過性です。
要約すると、サンドイッチ状の培養は、細胞の運命を調査するために、異なる3Dのような微小環境を模倣する可能性を提供するシンプルなシステムです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
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