Abstract
Celcultuur is van oudsher uitgevoerd op twee-dimensionale (2D) substraten waar de cellen hechten behulp ventrale receptoren aan het biomateriaal oppervlak. Echter in vivo meeste cellen zijn volledig omringd door de extracellulaire matrix (ECM), resulterend in een driedimensionale (3D) verdeling receptoren. Dit kan leiden tot verschillen in de buiten-signaalroutes en dus celgedrag.
Dit artikel laat zien dat het stimuleren van de dorsale receptoren van de cellen al tot een 2D-substraat gehandeld door overlappen een film van een nieuw materiaal (een sandwich-achtige cultuur) triggers belangrijke wijzigingen ten opzichte van standaard 2D culturen. Verder is de gelijktijdige excitatie van ventrale en dorsale receptoren verschuift celgedrag dichter bij die gevonden in 3D omgevingen. Bovendien, vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal inte toelaatractions bijvoorbeeld topografie, stijfheid en ander eiwit coatings op zowel de ventrale en dorsale zijde. Ten slotte, sandwich-achtige cultures op basis van 2D substraten verscheidene analyseprocedures reeds ontwikkeld voor standaard 2D kweken kan normaal worden gebruikt, overwinnen complexere procedures die nodig zijn voor 3D-systemen.
Introduction
Traditioneel is celcultuur uitgevoerd op tweedimensionale (2D) substraten, hoewel de meeste van de in vivo cellulaire micromilieus een driedimensionale (3D) aard. Deze onnatuurlijke 2D milieu veroorzaakt veranderingen in cel gedrag als een manier van zelf-aanpassing aan een platte wereld, die rechtstreeks invloed lot van de cel 1,2. Derhalve resultaten verkregen 2D celculturen niet altijd reproduceerbaar in vivo. Dit heeft de ontwikkeling van nieuwe relevante kweeksystemen die meer fysiologische-achtige omstandigheden verder inzicht in elke dimensie afhankelijk biologisch mechanisme 3,4 krijgen verschaffen aangemoedigd.
Een van de belangrijkste verschillen tussen 2D cultuur en 3D in vivo omgeving is de verdeling van celreceptoren verankerd aan de extracellulaire matrix (ECM) dat 2D substraten cellen hechten ventraal, worden de meeste cellen in vivo volledig omringd door de ECM en dus cell hechting gebeurt door middel van een 3D verdeling van de receptoren. Dit brengt verschillende celadhesie signaalwegen daardoor belangrijke processen zoals celgroei, celdifferentiatie en genexpressie moduleren. Gedurende de laatste decennia hebben veel verschillende 3D kweeksystemen vastgesteld 5-8, hoewel hun variabiliteit en complexiteit belemmeren hun normalisatie in cultuur procedures gemeenschappelijke cel. Bovendien 3D systemen zijn gewoonlijk moeilijk te hanteren en de huidige experimentele procedures 2D substraten kunnen niet gemakkelijk worden vastgesteld voor 3D-kweken. Bovendien, literatuur zelden vergelijkt 3D culturen met het equivalent 2D conditie of andere 3D-systemen, belemmeren de juiste begrip van de cel gedrag in deze modellen.
Eens dat de cellen gehecht aan een 2D substraat, de excitatie van de dorsale receptoren - door bedekken een laag van een nieuw materiaal (sandwich-achtige kweek) - kan leiden celreacties zowel 3D-omgevingen. De reason hierachter is de gelijktijdige activatie van beide dorsale en ventrale receptoren te houden en verspreiding in de sandwich-omgeving (figuur 1) 9,10. Bijgevolg cellen ondergaan belangrijke verandering ten opzichte 2D culturen 11,12. Zo is lot van de cel bepaald tijdens de montage vanwege de sandwich cultuur, omdat de dorsale stimulatie triggers veranderingen in de belangrijkste cellulaire routes. Derhalve is het lot van de cel sterk bepaald door het tijdstip waarop de sandwich-achtige cultuur geassembleerd 11.
Vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een eenvoudig en veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal interacties zoals chemie, topografie, stijfheid en eiwitten coatings zowel de ventrale en dorsale zijde toelaat. Dit biedt een grotere mate van flexibiliteit ten opzichte van andere 3D-systemen (Figuur 2) door de onafhankelijke dorsale en ventrale combinatie van een brede variety oppervlakte condities. Bovendien kunnen verschillende cellijnen en verschillende tijdstippen de sandwich-achtige kweek monteren bestudeerd, waardoor de brede spectrum van mogelijkheden.
Een standaardprotocol van de sandwich-achtige kweek, wordt hieronder beschreven hetzij poly-L-melkzuur (PLLA) electrospun vezels of films dorsale substraten dekglaasje als ventrale substraat en fibronectine als eiwitbekleding. Sandwich-achtige culturen werden geassembleerd net na cel zaaien of na 3 uur van 2D-cultuur. Echter, er rekening mee dat andere materiële systemen en eiwitten kunnen worden gebruikt; ook de sandwich-achtige cultuur kan worden gemonteerd op verschillende tijdstippen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De productie van Dorsale Substrates
- Productie van een vlakke film van PLLA door oplosmiddel gieten.
- Werk in een zuurkast aan een oplossing van 2% (w / v) PLLA in chloroform (2 g PLLA in 100 ml chloroform) te bereiden door roeren bij kamertemperatuur (KT) tot het volledig is opgelost (ongeveer 3 uur).
- Leg de ringen op een glazen petrischaal.
Opmerking: Gebruik roestvrij stalen ringen met een inwendige diameter van 10,5 mm (iets kleiner dan de ventrale sample diameter) zodat de ring bovenop het ventrale substraat wordt geplaatst. Andere materialen zoals polytetrafluorethyleen (PTFE) of glazenreiniger kunnen eveneens worden gebruikt. - Voeg 200 ul van de PLLA oplossing in de wasmachine en laat verdampen langzaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Om de langzame verdamping van het oplosmiddel mogelijk te maken, sluit de petrischaal met aluminiumfolie met een paar gaten.
- Verwarm de monsters bij 120 ° C gedurende 5 min teneinde het oplosmiddel te verdampen sporen.
- Laat monsters koel te doenwn bij KT.
- Zodra monsters afgekoeld (30 min ongeveer), dek af met 18,2 MQ · cm water in de petrischaal en incubeer gedurende 8 min bij RT.
Opmerking: als monsters worden niet volledig afgekoeld, kunnen ze duren 18.2 MQ · cm water en neemt een rubberachtige toestand. Bovendien incuberen bij 18,2 MQ-cm water gedurende minder dan 8 min kan leiden tot onjuiste onthechting, en meer dan 8 minuten in onthechting van de wasmachine. - Met een scheermesje, wrikken de ringen om ze te pellen de petrischaal.
- Verwijder eventuele onvolkomenheden van de rand van de ring met een pincet en laat de monsters lucht drogen.
- Bewaar de monsters in een vacuüm exsiccator (80 mbar) tot de dag van het experiment omdat PLLA afbreekbaar door hydrolyse.
- Productie van PLLA vezels door electrospinning.
- Werk in een zuurkast met een oplossing van 8% (w / v) PLLA in hexafluorisopropanol (8 g PLLA in 100 ml hexafluorisopropanol) door oproeren voorbereidinging bij RT totdat het volledig is opgelost (3 uur ongeveer).
- Plaats de polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen op een aluminium plaat of een trommel voor het electrospinning om willekeurige of uitgelijnde vezels respectievelijk krijgen.
Opmerking: Gebruik polytetrafluorethyleen (PTFE) ringen met een inwendige diameter van 10,5 mm (iets kleiner dan de ventrale sample diameter) zodat de ring bovenop het ventrale substraat wordt geplaatst. Andere materialen zoals roestvrij staal of glas ringen kunnen ook worden gebruikt. De trommel moet draaien met een hoeksnelheid van 160,7 sec -1 (radius = 7 cm) teneinde uitgelijnde vezels te verkrijgen. Een lagere snelheid kan glasvezel uitlijning niet leiden en een hogere snelheid zal resulteren in gebroken vezels. - Laad de spuit met het polymeer-oplossing en plaats het op de injectiepomp.
- Electrospin de PLLA oplossing met een 0,9 ml / uur stroomsnelheid een spanning van 30 kV en een collector afstand van 12 cm.
- Stop de elektrospinproces achterdeker 20-30 min, tot er een goede vezeldichtheid wordt bereikt (omdat cellen tegelijkertijd communiceren met een aantal vezels).
- Verwarm de monsters bij 120 ° C gedurende 5 min teneinde het oplosmiddel te verdampen sporen.
- Bewaar de monsters in een vacuüm exsiccator (80 mbar) tot de dag van het experiment omdat PLLA afbreekbaar door hydrolyse.
2. Sandwich Cultuur
- Monteer de sandwich-achtige cultuur eenmaal cellen worden nageleefd het ventrale 2D-substraat.
- Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min.
- Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2 + en Mg2 + (200 ul / svoldoende) gedurende 1 uur.
Opmerking: Als gevolg van het fabricageproces, dorsale substraten aangewezen boven- en onderzijde, omdat het oplosmiddel gegoten film en electrospun vezels bevestigd aan één van de zijden van de ring. Deze zijde is daarom één op de cellen (Figuur 3).- Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg 2+ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing.
- Zaad cellen op de dekglaasjes 13.
Opmerking: Als de sandwich-achtige cultuur gebaseerd 2D substraten zal zaaien van cellen op soortgelijke wijze worden uitgevoerd als een 2D monster. Zo worden C2C12 myoblast gezaaid met 17.500 cellen cm -1 differentiatie experimenten en NIH3T3 fibroblasten worden uitgezet met 7000 cells cm -1 voor geïsoleerde culturen naar cel morfologie en de hechting te bestuderen. - Plaats de monsters in een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 en laat cellen hechten aan de ventrale substraat voor 3 uur.
- Plaats de ventrale gezaaide substraat in een nieuw putje van een 12 plaat met meerdere holtes (indien sluitringen past).
Opmerking: Montage van de sandwich-achtige cultuur in een nieuwe put is een manier om zich te ontdoen van de cellen die zijn toegetreden tot de bodem van de put na het zaaien, omdat deze voedingsstoffen verbruikt en scheiden groeifactoren en afval dat cellen gekweekt in het beïnvloeden sandwich-achtig systeem. Dit is ook een must voor mobiele extracties om alleen de cellen gekweekt in de sandwich-achtige omgeving lyseren. - Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen. Bijvullen medium (1 ml) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2.
Opmerking: Het gewicht van de ring wordt voorkomen dat de dorsale subStrate drijven. - Verander het medium tweemaal per week in standaard 2D kweken. Verplaats de dorsale substraat omdat dit kan leiden tot beschadiging van cellen.
- Monteer de sandwich-achtige cultuur net na cel zaaien.
- Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min.
- Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in DPBS bevat Ca2 + en Mg2 + (200 ul / monster) gedurende 1 uur.
- Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg
- Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBS om eiwit te verwijderen boven. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zorgt ervoor eiwit denaturalisatie. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg
- Zaad cellen op dekglaasjes in een putje van een 12 multi-well plaat (waar ringen past). Om dit te doen, gebruik maken van een zeer geconcentreerd cellulaire schorsing naar cel verlies na het leggen van de dorsale substraat te vermijden.
- Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen. Bijvullen medium (1 ml) en incubeer bij 37 ° C met 5% CO 2.
Opmerking: Het gewicht van de ring voorkomt dat de dorsale ondergrond drijven. - Verander het medium tweemaal per week in standaard 2D kweken.
Opmerking: Verplaats de dorsale substraat omdat dit kan leiden tot beschadiging van cellen.
3. Analyse
Opmerking: sandwich-achtige cultures op basis van 2D-substraten, en zo kunnen gezamenlijk worden geanalyseerd door reeds ontwikkeld voor standaard 2D-kweken procedures. Bijvoorbeeld, omdat PLLA transparant en CELls worden gedwongen om te verhuizen binnen het xy-vlak, wordt microscopie gedaan Op 2D substraten. Celmigratie kan derhalve worden opgevat als 2D kweken, zonder het bijhouden cellen in de z-as als voor 3D-culturen, waarbij het experiment en beeldanalyse vereenvoudigt. Om de wondgenezing assay bestuderen door een kras-test volgt dit protocol:
- Studie celmigratie (wondgenezing assay) binnen de sandwich-achtige cultuur.
- Werken in een cultuur kap te zorgen steriele omstandigheden en steriliseer alle materialen (glas dekglaasjes, rug- substraten, pincet, etc.) door UV-blootstelling gedurende 30 min.
- Coat om de ventrale en dorsale substraat met fibronectine aan specifieke cel-eiwit hechting direct. Hiertoe incubeer de monsters in 20 ug / ml fibronectine opgelost in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2 + en Mg2 + gedurende 1 uur.
- Nadat het eiwit bekleden, was de monsters tweemaal met DPBSom eiwitten te verwijderen in overmaat. Dan incubeer monsters in DPBS tot het gebruik ervan in om de monsters te voorkomen van het krijgen van een droge, omdat dit zou kunnen eiwit denaturalisatie veroorzaken. Gebruik DPBS met Ca 2+ en Mg 2+ sinds divalente kationen reguleren eiwitvouwing.
- Zaad cellen op de dekglaasjes bij een hoge dichtheid 13.
- Plaats de monsters in een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 en laat cellen confluentie bereiken.
- Gebruik een pipet om krassen op de cel monolaag om 2 celpopulaties gescheiden door een spleet te krijgen.
- Plaats de ventrale geplaatste substraat in een nieuw goed geschikt is voor de time-lapse acquisitie en waar de dorsale substraten passen (dwz 12 multi-well plaat).
- Zorgvuldig en met behulp van een pincet, bedekken de dorsale substraat de cellen en vervolgens vullen met medium (1 ml van een 12 multi-well plate).
Opmerking: Het gewicht van de ring voorkomt tHij dorsale ondergrond drijven. - Het monster wordt in de time-lapse microscoop (ingesteld op 37 ° C en 5% CO2) en neemt beelden van de gap closure elke 20 min.
- Analyseer de gap closure met behulp van specifieke software zoals de plugin MiToBo van ImageJ. 14
Opmerking: Eiwit en nucleïnezuur extractie wordt op soortgelijke wijze uitgevoerd als 2D substraten. Er is maar één extra stap die bestaat uit het demonteren van de sandwich-achtige cultuur aan de lysis buffer direct aan de cellen toe te voegen om de extractie-efficiëntie te verhogen. Bijvoorbeeld voor mRNA extractie:
- Uittreksel mRNA van Sandwich-achtige culturen
- Bereid de buffers van de commerciële kit volgens instructies van de fabrikant.
- Neem de sandwich-achtige cultuur uit de incubator.
- Verwijder het kweekmedium van de monsters.
- Was de monsters eenmaal met DPBS bevattende Ca2+ en Mg 2+ (1 ml) en verwijder alle oplossing.
- Met behulp van een pincet, verwijder de dorsale substraat en voeg de lysis buffer (350 pl) aan de ventrale substraat. Overlay opnieuw de dorsale substraat op de ventrale substraat teneinde ook lyseren van de cellen gehecht aan de dorsale substraat.
- Verwijder de dorsale substraat om de lysisoplossing isoleren.
- Volg de instructies van de fabrikant om het mRNA te krijgen.
Opmerking: Immunodetectie van eiwitten kan ook worden uitgevoerd vanaf Op 2D substraten. Aangezien sandwich-achtige culturen juiste verspreiding van de antilichamen en buffers kunnen belemmeren, incubatietijden worden verhoogd. Ook kan de sandwich worden gedemonteerd alvorens de kleuringsprotocol maar in dit laatste geval enige cellen blijven aan de dorsale substraat en een aantal op de ventrale substraat.
- Immunodetect eiwitten binnen een sandwich-achtige cultuur
Opmerking: dorsale substraat gedurende het fixatieproces zodat diffusieprobleem vermeden worden verwijderd. - Spoelen met DPBS (1 ml) en vervolgens doorlaatbaar met 0,5% Triton X-100 in DPBS (1 ml) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 1% albumine in DPBS (1 ml) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Incubeer met primaire antilichaam (2 ug / ml, 1 ml) in blokkerende oplossing gedurende 3 uur bij KT.
- Was 3 maal gedurende 10 min met DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
- Incubeer 2 uur met secundaire antilichamen (2 gg / ml) en 1 ug / ml DAPI in blokkeeroplossing (1 ml) bij RT.
- Was 3 maal gedurende 10 min in DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
- Was in DPBS.
Opmerking: Monsters kunnen op een dia met Vectashield gemonteerd worden en verzegeld met nagellak wanneer dorsale substraten voorafgaand worden verwijderd van de immunodetectie. - Let op onder de fluorescentie microtoepassingsgebied voor standaard 2D substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het stimuleren van de dorsale receptoren binnen de sandwich-achtige cultuur triggers veranderingen in de cel morfologie, celadhesie en intracellulaire signaalwegen (bijv focale adhesie kinase, FAK) 10-12. Als voorbeeld, fibroblasten gekweekt in de sandwich-achtig systeem overexpressie de α 5 integrine subeenheid vergeleken met 2D, zoals waargenomen voor andere 3D culturen 15,16.
Cell lot is sterk afhankelijk van het tijdstip waarop de dorsale receptoren worden gestimuleerd en de eigenschappen van de dorsale interactie, net zoals in andere 3D-systemen zoals hydrogels. Bijvoorbeeld, hydrogels, waar eiwitten stevig meestal gebonden tonen kleiner en afgeronde cellen met onontwikkelde actine cytoskelet en diffuse focale adhesies. Dit kan worden nagebootst in een sandwich-achtige cultuur middels substraten die eiwitten sterk adsorberen, zodat de cellen niet in staat mechanisch reorganiseren deze laag van eiwitten en cellen Spreading wordt belemmerd. Evenzo kan hydrogelen waar de cellen de ECM kunnen verbouwen worden nagebootst met sandwich systeem met substraten die eiwitten losser 10 adsorberen.
De stimulatie van de dorsale receptoren is aangetoond dat C2C12 lot van de cel moduleren. Dorsale electrospun PLLA vezels direct celuitlijning wanneer bekleed met fibronectine maar niet wanneer bekleed met runderserumalbumine (een niet-hechtende eiwit). Dit resultaat wijst cellen biologisch zin en reageren op de dorsale ingangen (figuur 4) 9. Bovendien sandwich-achtige cultures with plane dorsale PLLA veroorzaakt een verhoging van het niveau van myogenesis. Dit hangt ook af van de dorsale biologische stimuli aangezien de interactie met andere eiwitten dorsale resultaten in verschillende differentiatie rates (figuur 5) 9.
Migratiecel in de sandwich-achtige kweek wordt ook veranderd in vergelijking met de 2D-kweek. Het heeft zijn(2 Films 1 en) en aangetoond dat in een wondgenezing assay, cellen in de sandwich cultuur nemen een zeer langgerekte morfologie en migreren kortere afstanden dan op 2D substraten. Celmigratie tarieven zijn voorts betrekking op de aard van de ventrale en dorsale stimulatie 12.
Evenals in 3D fibronectine en collageen gels 17,18, sandwich-achtige kweek verhoogt celgemedieerde ECM reorganisatie (de ventrale fibronectine) met betrekking tot de 2D toestand (figuur 6) 12. Deze werkwijze berust op het dorsale mechanische stimuli cytoskelet stabiliteit omdat het gebruik van contractiliteit remmers (blebbistatin, Y27632) verhinderden proces. Interessant is dat de ventrale fibronectine eveneens gereorganiseerd bij verschillende dorsale eiwit coatings (bijv vitronectine en runder serum albumine) en zelfs als ze ongestreken 12.
Figuur 1:.. Schets van standaard (2D) en sandwich-achtige culturen stimulatie van de dorsale receptoren binnen de sandwich-achtige cultuur triggers extra celadhesie signalering die belangrijke cellulaire processen moduleert Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: sandwich-achtige cultuur is een veelzijdig systeem dat de studie van verschillende goed gecontroleerde parameters (topografische inputs, stijfheid, gradients ...) zowel de ventrale en dorsale substraten mogelijk maakt.
Figuur 3:. Dorsale substraten worden geschetst voor zowel de boven-en dwarsdoorsnede om te laten zien dat een aangewezen boven- en onderzijde hebben (A) Flat PLLA film en (B) electrospun vezels.
Figuur 4:. C2C12 morfologie onder verschillende kweekomstandigheden zoals vlak (p) en uitgelijnde vezels (a) van PLLA die werden gebruikt als ventrale (subscript) en dorsale (superscript) substraten streeplijnen de vezels oriëntatie indien nodig. Cellen gekweekt op het vliegtuig substraat en bedekt met uitgelijnde vezels van PLLA (SW p a) voelen de dorsale stimuli. Vooral cellen voelen de dorsale vezels wanneer bekleed met fibronectine maar niet wanneer gecoat with runderserumalbumine (een niet-hechtende eiwit). Derhalve cellen hechten aan de met fibronectine beklede vezels en lijn in dezelfde richting. Afbeelding aangepast van referentie-9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Celdifferentiatie in sandwich-achtige culturen na 4 dagen in differentiatie media. Verschillende kweekomstandigheden werden geanalyseerd zoals vlak (p) en uitgelijnde vezels (a) van PLLA die werden gebruikt als ventrale (subscript) en dorsale (superscript) substraten. De monsters werden bekleed met fibronectine in alle gevallen. (A) Fluorescentie kleuring tonen sarcomere myosine positieve cellen (groen) en celkernen (rood). (B) Gedifferentieerdecellen oriëntatie berekend door Fast Fourier Transform. (C) myogenesis zoals bepaald door het percentage sarcomeer myosine-positieve cellen. Gegevens zijn genormaliseerd naar de gouden standaard controle. Statistisch significante verschillen worden aangeduid met *** P <0,001. Afbeelding aangepast van referentie-9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Reorganisatie van ventrale fibronectine. Sandwich cultuur triggers ventrale FN reorganisatie door de vorming van nieuwe fibronectine fibrillen (borstel-achtige labeling; gewezen met witte pijlen). Ventral fibronectine wordt gereorganiseerd binnen sandwich-achtige culturen met verschillende dorsale eiwit coating (fibronectine, vitronectine en bovine serumalbumine)of zelfs wanneer de dorsale substraat onbekleed gelaten. Actine cytoskelet (groen), kernen (blauw) en FN (rood) getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1: Cel migratie op 2D. L929 fibroblast migreren op een fibronectine gecoat glas dekglaasje in een wondgenezing assay. Beelden werden verworven voor 16 uur (met een frame genomen elke 20 min). Klik hier om deze video te bekijken.
Movie 2:. Migratie Cell binnen de sandwich-achtige cultuur L929 fibroblast migreren in een wondgenezing assay binnen een sandwich-achtige cultuur waren de ventrale substraat was een fibronectine gecoat glas dekglaasje en de dorsale substraat een fibronectine gecoate PLLA film. Beelden werden verworven gedurende 16 uur (met een frame die elk 20 min). Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tegenwoordig 3D cultuur is een belangrijk onderwerp voor de farmaceutische en biotechnologische industrie, alsmede onderzoek in de celbiologie, met inbegrip van kanker en stamcellen. Bijgevolg meerdere 3D kweeksystemen ontwikkeld. Helaas, de verschillen tussen de 3D-systemen meestal resulteren in verschillende cel gedrag, belemmeren het begrip van cel lot. Trouwens, experimentele procedures zijn meestal niet zo eenvoudig als voor 2D kweeksystemen. Vandaar ontwikkeling van nieuwe kweeksystemen die overwinnen sommige van deze nadelen is van groot belang.
Sandwich-achtige cultuur blijkt sterk beïnvloeden belangrijke cellulaire processen zoals celdifferentiatie, celmorfologie, cel signalering en celmigratie. Verder cellen delen gelijkenissen met cellen gekweekt in 3D-systemen, het ondersteunen van de verklaring dat sandwich-achtige cultuur verbindt 2D met 3D-cultuur systemen. Fysiologische weefsels poriën in het traject van 3 tot 14 μm dat cellen constraint en dus invloed op cellulaire processen zoals migratie. Dit is een of andere manier recapituleerde met behulp van de sandwich-achtig systeem als dorsale en ventrale stimuli vertegenwoordigen per se een beperkte omgeving die celmorfologie beperkt en zal noodzakelijkerwijs beïnvloeden celmigratie onafhankelijk van het eiwit coatings.
Door het simultaan stimuleren van dorsale en ventrale receptoren sandwich-achtige cultuur is een robuuste techniek om de rol van de dimensionaliteit in celgedrag te onderzoeken. Zoals het gebaseerd 2D substraten, dit kweeksysteem zeer veelzijdig te bestuderen materiaaleigenschappen en ECM inputs die de studie van celgedrag onder verschillende micro-omgevingen anders. Bovendien kan de invloed van het tijdstip waarop dorsale receptoren worden gestimuleerd op lot van de cel worden onderzocht door overlappen de dorsale substraat op verschillende tijdstippen. Vandaar dat in tegenstelling tot andere 3D-systemen, de sandwich-achtige produceren een breder spectrumvan goed gecontroleerde cellulaire micro-omgevingen. Bijgevolg de sandwich-achtig systeem is een interessant celcultuur platform om verschillende fysiologische omstandigheden na te bootsen om celbiologie en test lot van de cel onder verschillende kweekomstandigheden bestuderen.
Zoals eerder vermeld, een voordeel van dit systeem is dat verschillende ventrale en dorsale onderlagen worden onderzocht met verschillende eiwitten coatings. Daarom kunnen belangrijke parameters voor cellulaire lot zoals liganddichtheid gevarieerd worden door het regelen van de ligand dichtheid van elk van de 2D gebruikte substraten (bv ventrale en dorsale substraten). Echter, er rekening mee dat verschillende substraten veranderingen in het protocol nodig heeft. Bijvoorbeeld met behulp grotere dorsale substraten kan resulteren in de noodzaak om de juiste incubatietijd de monsters loslaten van de petrischaal stellen. Evenzo kan groter ventrale substraten resulteert in hypoxische gebieden in het midden van het monster door de beperkte zuurstofdoorlaatbaarheid van de ventralesubstraat (vanwege de glazen dekglaasje). Daarnaast zal analyseprocedures afhangen van de substraateigenschappen. Bijvoorbeeld met gebruikmaking opaque dorsale substraten standaard protocollen microscopy belemmeren maar het zal nog steeds de mogelijkheid eiwit / nucleïnezuur extractie. Een andere belangrijke factor is de permeabiliteit van de dorsale substraat omdat cellen moeten kunnen voedingsstoffen uit het medium af en gooi afval.
Kortom, een sandwich-achtige cultuur is een eenvoudig systeem dat de mogelijkheid biedt om verschillende 3D-achtige microenvironments nabootsen om lot van de cel te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
