Abstract
Hücre kültürü, geleneksel hücre biyo materyal yüzeyi ventral reseptörleri kullanarak uygun iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bununla birlikte, in vivo olarak, hücrelerin çoğu tamamen reseptörlerinin bir üç boyutlu (3D) dağılımı ile sonuçlanan hücre dışı matrisin (ECM) ile çevrilidir. Bu sinyal yolları dışında-ve böylece hücre davranış farklılıkları tetikleyebilir.
Bu makale zaten yeni bir malzeme (bir sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan bir 2B yüzeye yapıştırılır hücrelerin dorsal reseptörlerini uyararak standart 2D kültürlere göre önemli değişiklikler tetikler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, ventral ve dorsal reseptörlerinin aynı anda uyarma yakın 3D ortamlarda bulunan edilene hücre davranışını değiştirir. Buna ek olarak, bağlı sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hücre / malzeme inte farklı parametrelerin çalışma sağlar çok yönlü bir araçtırkasılma konsantrasyona, örneğin, topoğrafya, sertlik ve hem ventral ve dorsal kenarlarında farklı protein kaplamaları. Sandviç benzeri kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır çünkü nihayet, birkaç analiz prosedürleri zaten 3D sistemleri için gerekli daha karmaşık prosedürleri aşarak, normal olarak kullanılabilir standart 2D kültürler için geliştirilmiş.
Introduction
In vivo hücre mikroçevrelerde çoğu üç boyutlu (3D) bir yapıya sahip olsa Geleneksel olarak, hücre kültürü, iki-boyutlu (2B) alt tabakalar üzerinde yapılmıştır. Bu doğal olmayan 2D ortam düz bir dünya için kendini uyarlama bir yolu olarak, hücre davranış değişiklikleri, tetikler hangi doğrudan etkiler, hücre kaderi 1,2. Bu nedenle, 2B hücre kültürlerinde elde edilen sonuçlar her zaman in vivo tekrarlanabilir değildir. Bu, herhangi bir boyut bağımlı biyolojik mekanizma 3,4 içine daha fazla anlayış almak için daha fazla fizyolojik benzeri koşulların sağlanması isteyen yeni alakalı kültür sistemlerinin geliştirilmesi teşvik etmiştir.
2B hücreleri ventral yapışır yüzeylerde oysa, in vivo hücrelerin çoğunluğu tamamen ECM ve çevrili: 2B kültür ve in vivo ortamda 3D arasındaki ana farklardan biri ekstrasellüler matriks (ECM) demirlemiş hücre reseptörlerinin dağılımı Böylece ceII yapışma reseptörlerinin bir 3D dağıtım yoluyla gerçekleşir. Bu sayede, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu gibi önemli işlevleri modüle farklı hücre yapışma sinyal yollarını başlatır. Onların değişkenlik ve karmaşıklık ortak hücre kültürü prosedürlerinin kendi standardizasyon engel olsa son on yılda, pek çok farklı 3D kültür sistemleri, 5-8 kurulmuştur. Ayrıca 3D sistemler genellikle işlemek ve 2D yüzeylerde mevcut deneysel işlemler kolayca 3D kültürler için kurulmuş olamaz kolay değildir. Buna ek olarak, edebiyat nadiren bu modellerde hücre davranışını doğru anlaşılmasını engelleyen, eşdeğer 2B durumu veya diğer 3D sistemlerle 3D kültürleri karşılaştırır.
Bir kez 2B substrat, dorsal reseptörlerinin uyarılması üzerine yapıştırılır hücrelere sahip - yeni bir malzeme (sandviç gibi kültür) bir filmi kaplayan ile - hücre hem yanıtları 3D ortamlar tetikleyebilir. reaBunun arkasında oğlu dorsal ve ventral reseptörleri yapışır ve sandviç ortamında yaymak için (Şekil 1) 9,10 hem de eş zamanlı aktivasyonu olduğunu. Bunun bir sonucu olarak, hücreler 2B kültürleri 11,12 ile ilgili olarak önemli değişimler geçirirler. Dorsal uyarım önemli hücresel yollardaki değişiklikler tetikler çünkü Böylece, hücre kaderi, çünkü sandviç kültürü montajı esnasında belirlenir. Bu nedenle, hücre kaderi yüksek sandviçe benzer kültürü 11 monte edilir zaman ile tespit edilir.
Nedeniyle sistemin doğası gereği, bir sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal tarafı böyle kimya, topoğrafya, sertlik ve protein kaplamalar gibi hücre / malzeme etkileşimleri farklı parametrelerin çalışma sağlayan basit ve çok yönlü bir araçtır. Bu, geniş bir v bağımsız olarak dorsal ve ventral kombinasyonu diğer 3D Systems (Şekil 2) göre çok yönlü bir yüksek derecesiYüzey koşullarının ariety. Buna ek olarak, farklı hücre hatları ve sandviç-benzeri kültür monte farklı zamanlarda olanakları geniş spektrumunu artan incelenebilir.
Sandviçe benzer kültür standart bir protokol kullanılarak aşağıda ayrıntılı olarak, ya sırt alt tabakalar, protein kaplama olarak ventral alt-tabaka ve fibronektin gibi cam lamel gibi asit (PLLA) electrospun elyaflar ya da filmler-L-laktik poli. Sandviç gibi kültürler, sadece hücre tohumlama sonra veya 2B kültür 3 saat sonra monte edilmiştir. Bununla birlikte, diğer malzeme sistemleri ve proteinler kullanılabilir dikkat ediniz; aynı şekilde sandviç benzeri bir kültürü, farklı zaman noktalarında monte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dorsal Yüzeyler 1. Üretimi
- Çözücü döküm tarafından PLLA düz bir filmin üretimi.
- Oda sıcaklığında tam olarak (yaklaşık 3 saat) çözününceye kadar (RT) karıştırılarak% 2 bir çözeltisi, kloroform içinde (ağ / hac) PLLA (100 mi kloroform içinde 2 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışır.
- Cam Petri kabı pulları yerleştirin.
Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm'lik bir iç çapa sahip ve paslanmaz çelik çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin politetrafloroetilen (PTFE) veya cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. - Yıkayıcı PLLA çözeltisi 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça buharlaşmasına izin verin. Çözücünün düşük buharlaşmasını sağlamak amacıyla, birkaç delik ile alüminyum folyo ile Petri kabı kapatmak.
- Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C 'de örnekleri ısıtın.
- Numuneler yapmak serin yapalımRT'de wn.
- Numuneler (30 dk yaklaşık) soğuduktan sonra, Petri kabındaki · cm su M 18.2 ile kaplayın ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe.
Not: örnekler tamamen soğuduktan değilse, bunlar · yukarı cm su M 18.2 alıp bir lastik devleti kabul edebilir. Buna ek olarak, daha az 8 dakika boyunca · cm su 18.2 kuluçka uygunsuz dekolmanı ve yıkama ayrıldıktan fazla 8 dakika boyunca neden olabilir. - Bir jilet ile, Petri kabı onları kalkmasına pulları kaldırın.
- Cımbız ile yıkama kenarından herhangi bir kusurları çıkarın ve numuneler hava kurumaya bırakın.
- PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın.
- Elektrospinning tarafından PLLA liflerinin üretimi.
- Karışması sağlandı göre heksaflorizopropanol içinde bir% 8 çözeltisi (ağırlık / hacim) PLLA (100 mi heksaflorizopropanol içinde 8 g PLLA) hazırlamak üzere, bir çeker ocak içinde çalışmatamamen çözülene kadar oda sıcaklığında ing (3 saat, yaklaşık).
- Sırasıyla, rastgele ya da düzenli fiber elde etmek için, bir alüminyum levha veya Elektrospinning bir tambur üzerinde, politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır makineleri yerleştirin.
Not: (ventral Örnek çapından biraz daha küçüktür) 10.5 mm'lik bir iç çapa sahip kullanımlar politetrafloroetilen (PTFE), çamaşır yıkama ventral alt-tabakanın üzerine yerleştirilir ve böylece. Örneğin, paslanmaz çelik ya da cam pullar gibi başka malzemeler de kullanılabilir. Tambur hizalanmış fiberler elde etmek için 160.7 saniye -1 (yarıçap = 7 cm) 'lik bir açısal hızda dönmelidir. Daha yavaş bir hızlı fiber hizalama tetikleyebilir olmayabilir ve daha hızlı kırık lifleri neden olacaktır. - Polimer çözeltisi ile şırınga yükleyin ve şırınga pompası üzerine yerleştirin.
- 30 kV voltaj ve 12 cm'lik bir toplayıcı mesafe ile, bir 0.9 ml / saat akış oranı kullanılarak PLLA çözeltisi Electrospin.
- Elektrospinning süreci kıç Durdurer 20-30 dk (hücreler aynı anda birkaç lifleri ile etkileşim var çünkü) bir zamanlar iyi bir lif yoğunluğu elde edilir.
- Çözücü izleri buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 120 ° C 'de örnekleri ısıtın.
- PLLA hidroliz ile parçalanabilir olduğu için deney gününe kadar bir vakum kurutma cihazı (80 mbar) örnekleri saklayın.
2. Sandviç Kültürü
- Hücreler ventral 2B yüzeye yapıştırılır kez sandviç gibi kültür birleştirin.
- Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek.
- Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca içeren 2+ ve Mg2 + (200 ul / sn içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe1 st için) yeterli.
Not: Çözücü döküm film ve electrospun elyaflar yıkama yanlarından birine bağlanır, çünkü nedeniyle imalat işlemine, sırt alt-tabakalar belirlenmiş bir üst ve alt kenara sahiptir. Bu taraf, bu nedenle hücreleri (Şekil 3) bakan bir tanesidir.- Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri 2+ Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler.
- Camına Tohum hücreleri 13 lamelleri.
Not: sandviçe benzer kültürü 2B alt tabakalar üzerine dayandığı için, hücre ekim Benzer 2B örnek olarak yapılacaktır. Örneğin, C2C12 miyoblast cm-1 farklılaşma deneyleri ve NIH3T3 fibroblast için 7000 ° C'de tohumlanır 17.500 hücre düşecek şekilde,arşın cm -1 izole kültürleri hücre morfolojisi ve yapışma incelemek için. - % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka numuneler ve hücreler 3 saat ventral substrata yapışmasına izin verir.
- (Çamaşır uygun yerlerde), bir 12 çok oyuklu bir plakanın yeni bir kuyu ventral tohumlu yerleştirilmesidir.
Not: Yeni bir kuyuda sandviç gibi kültür Montaj bu besinleri tüketmek ve içinde kültüre hücreleri etkileyen büyüme faktörleri ve atık salgılarlar beri iyi tohumlama sonrası dibine yapıştırılır var hücrelerin kurtulmak için tek yoldur sandviç gibi sistem. Bu aynı zamanda sandviç benzeri ortamında kültüre sadece hücreleri lize amacıyla hücresel çekimi için bir zorunluluktur. - Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
Not: yıkama ağırlığı dorsal alt önleyecektiryüzen tedir. - Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin. Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin.
- Sadece hücre tohumlama sonrası sandviç gibi kültür birleştirin.
- Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek.
- Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, Ca + 2 ve Mg + 2, 1 saat boyunca (200 ul / numune) ihtiva eden DPBS içinde eritilmiş fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin.
- Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS
- Protein Kaplamadan sonra, fazla proteini uzaklaştırmak amacıyla DPBS ile iki kez numune yıkayın. Daha sonra, bu protein, Doğallıktan neden olduğu, kuru alma örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS
- (Çamaşır uygun) 12, çok oyuklu bir plaka iyi cam lameller üzerine tohum hücreleri. Bunu yapmak için, dorsal substratı döşeme sonra hücre kaybını önlemek için son derece konsantre hücresel süspansiyon kullanın.
- Dikkatle ve bir cımbız yardımıyla, hücreler üzerinde dorsal alt tabakayı bindirme. Ortam (1 mi) ile doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
Not: Yıkama ağırlığı yüzen dorsal alt tabakayı önleyecektir. - Standart 2D kültürlerde olduğu gibi haftada iki kez orta değiştirin.
Not: Bu hücre hasarına neden olabilir çünkü dorsal substrat hareket ettirmeyin.
3. Analiz
Not: Sandviç gibi kültürler 2D yüzeylerde dayanmaktadır ve bu nedenle yaygın olarak zaten standart 2D kültürler için geliştirilmiş prosedürler ile analiz edilebilir. Örneğin, beri PLLA şeffaf ve cel olduğunuls xy düzlemi içinde hareket etmek kısıtlanır, mikroskopi 2B yüzeylerde olarak yapılır. Hücre göçü, bu nedenle deneme ve görüntü analizi kolaylaştırır 3D kültürleri için z-ekseni hücreler izleme gerek kalmadan, 2B kültürleri gibi analiz edilebilir. Bir çizik testi ile yara iyileşmesi tahlil incelemek için bu protokolü uygulayın:
- Sandviç gibi kültür içinde Çalışma hücre göçü (yara iyileşmesi deneyi).
- Bir kültürü kaputu çalışmak steril koşulları sağlamak ve 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz kalma ile tüm malzemeleri (cam lamelleri, dorsal yüzeylerde, cımbız, vs.) sterilize etmek.
- Sırayla kaplayın fibronektin ile ventral ve dorsal substrat spesifik hücre-protein yapışmasını yönlendirmek. Bunu yapmak için, 1 saat süre ile Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) Ca + 2 ve Mg içeren 2+ içinde eritildi fibronektinin 20 ug / ml numune inkübe edin.
- Protein Kaplamadan sonra, DPBS ile iki kez numune yıkayınamacıyla fazla proteinin ayrılması için. Daha sonra, protein Doğallıktan neden olabilir, bu, kurutma elde örnekleri önlemek için bunların kullanıma kadar DPBS örnekleri inkübe edin. Iki değerli katyonların beri 2+ Ca 2+ ve Mg içeren Kullanımı DPBS protein katlanmasını düzenler.
- Yüksek yoğunlukta 13 cam lamelleri Tohum hücreleri.
- % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka numuneler ve hücreler kaynaşmaya elde etmek için izin verir.
- Bir boşlukla ayrılan 2 hücre popülasyonlarının almak için hücre tek tabaka kazımak için bir pipet kullanın.
- Time-lapse edinimi için yeni bir kuyu uygun ventral numaralı seribaşı substrat yerleştirin ve dorsal yüzeylerde (yani 12 çoklu plaka) uygun yerlerde.
- Dikkatli ve bir çift cımbız yardımı ile, hücreler üzerindeki sırt alt tabaka kaplaması ve daha sonra (bir 12 çok-delikli plaka için 1 mi) ortam ile doldurun.
Not: yıkama ağırlığı önleyecektir tO yüzen alt tabakayı dorsal. - Time-lapse mikroskop örnek yerleştirin (37 ° C olarak ayarlanmış ve% 5 CO 2) ve boşluk kapatma her 20 dk görüntüleri alır.
- Böyle ImageJ gelen eklenti MiToBo olarak özel bir yazılım kullanılarak boşluk kapatma analiz edin. 14
Not: protein ve nükleik asit ekstraksiyon 2B alt tabakalar üzerinde benzer şekilde gerçekleştirilir. Ekstraksiyon verimini artırmak amacıyla hücreleri üzerinde doğrudan lizis tamponu eklemek için sandviç gibi kültür demontaj oluşur tek fazladan bir adım vardır. Örneğin mRNA çıkarımı için:
- Sandviç gibi Kültürler mRNA Özü
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit ile ilgili tüm tamponları hazırlayın.
- Inkübatör dışarı sandviç gibi kültür atın.
- Örneklerden kültür ortamı çıkarın.
- DPBS Ca içeren bir kez numune yıkayın2 + ve Mg2 + (1 mi) ve bütün çözelti çıkarın.
- Bir çift cımbız yardımı ile, sırt alt-tabakanın çıkarın ve ventral substrata liziz tamponu (350 ul) ilave edin. Ayrıca, sırt alt-tabakaya yapışan hücreler lize etmek için yeniden ventral alt-tabaka üzerine sırt alt tabaka kaplaması.
- Lizis çözeltisi izole etmek için, dorsal substrat çıkarın.
- MRNA almak için üreticinin talimatlarına uyun.
Not: Proteinlerin imüno-da 2 boyutlu yüzeylere olduğu gibi gerçekleştirilebilir. Sandviç gibi kültürler antikorlar ve tampon doğru difüzyon engel olabilir için, inkübasyon süreleri arttırılmalıdır. Ayrıca, sandviç boyama protokolü başlamadan önce demonte edilebilir, ancak bu ikinci durumda bazı hücreler dorsal ve ventral substrat alt tabakaya bazı bağlı kalacaktır.
- Bir sandviç gibi kültürün içinde Immunodetect proteinler
Not: Sırt alt-tabaka difüzyon problemleri önlenebilir, böylece sabitleme işlemi esnasında çıkarılabilir. - DPBS (1 mi) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS içinde% 0.5 Triton X-100 (1 mi) ile geçirgenliği.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DPBS içinde% 1 albümini (1 mi) ile spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder.
- Primer antikor ile inkübe (2 ug / ml; 1 mi), oda sıcaklığında 3 saat çözüm engelleme.
- DPBS ile 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında çözeltisi (1 mi) bloke sekonder antikor (2 ug / ml) ve 1 ug / ml DAPI ile 2 saat inkübe edin.
- DPBS içinde 10 dakika /% 0.5 Tween 20 (1 mi) 3 kez yıkayın.
- DPBS yıkayın.
Not: Numuneler Vectashield bir slayt üzerine monte edilir ve dorsal yüzeyler önce immunodeteksiyon çıkarıldığında oje ile kapatılabilir. - Floresan mikro altında gözlemleyinstandart 2D yüzeyler gibi kapsamı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması, hücre morfolojisi, hücre yapışması ve hücre içi sinyal yolları (örneğin fokal yapışma kinaz, FAK) 10-12 değişiklikleri tetikler. Diğer 3D kültürler 15,16 için görüldüğü gibi, bir örnek olarak, sandviç benzeri bir sistem içinde kültürlendi fibroblastlar, 2D göre α 5 integrin alt birimi aşın.
Hücre kaderi, hidroj eller gibi diğer 3D sistemlerinde olur Benzer şekilde, sırt reseptörleri uyarılır zaman ve sırt etkileşim özellikleri ile son derece bağlıdır. Örneğin, proteinler, sıkı bir şekilde, genellikle bağlı hidrojeller gelişmemiş aktin hücre iskeleti ile daha küçük ve yuvarlak hücrenin ve fokal yapışmalarda yayılır. Hücreler mekanik proteinler ve hücre SPREA bu katmanı yeniden mümkün değildir, böylece bu, sıkı proteinleri adsorbe bir sandviç gibi kültür kullanan yüzeylerde taklit edilebilirding engellendiği. Benzer bir şekilde, hücreler ECM yeni model olabilir hidrojeller proteinleri daha gevşek 10 adsorbe substratlar ile sandviç sistemi ile taklit edilebilir.
Dorsal reseptörlerinin uyarılması C2C12 hücre kaderine modüle ettiği gösterilmiştir. Fibronektin ile kaplı ancak sığır serum albümini (yapışkan olmayan bir protein) ile kaplanmış olmadığında electrospun PLLA liflerin doğrudan hücre hizalama Dorsal. Bu sonuç hücreleri (Şekil 4) biyolojik anlamda yapmak ve dorsal girişlerine tepki işaret 9. Ayrıca, uçak dorsal PLLA sandviç benzeri kültürler Miyogenesis düzeyinde bir artışa neden oldu. Bu ayrı farklılaşma oranlarında farklı dorsal proteinler sonuçları (Şekil 5) 9 ile etkileşim beri dorsal biyolojik uyaranlara de bağlıdır.
2B kültürüne göre sandviç gibi kültür içinde hücre göçü de değişir. Bu edildiğiniyara iyileştirici tahlilinde göstermiştir tr, sandviç kültürü içindeki hücreler, oldukça uzun bir morfolojiye kabul ve 2D substratlar üzerinde daha kısa mesafeler geçirmek (Film 1 ve 2). Hücre göç hızları ayrıca ventral ve dorsal stimülasyon 12 doğasına bağlıdır.
Benzer şekilde 3B fibronektin ve kolajen jellerin içindeki olarak 17,18, sandviç benzeri bir kültürü (Şekil 6) 12 2B durumuna göre hücre aracılı ECM yeniden düzenlenmesi (örneğin, ventral fibronektin) artar. Bu süreç kontraktilitesi inhibitörleri (blebbistatin, Y27632) süreci engellenmiş kullanımı beri dorsal mekanik uyaranlara ve hücre iskeletinin istikrar dayanır. İlginç bir şekilde, farklı bir dorsal proteini kaplama (örneğin, vitronektin ve sığır serum albümini) kullanıldığında ventral fibronektin, aynı zamanda yeniden yapılanmış ve bile, kaplanmamış 12 bıraktı.
Şekil 1:.. Standart (2B) Sketch ve sandviç gibi kültürler sandviç gibi kültürün içinde dorsal reseptörlerinin uyarılması önemli hücresel süreçleri modüle ek hücre yapışması sinyallerini tetikler , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Sandviç gibi kültür hem ventral ve dorsal yüzeylerde farklı iyi kontrol parametreleri (topografik girdiler, sertlik, degradeler ...) çalışma sağlayan çok yönlü bir sistemdir.
Şekil 3:. Sırt yüzeyler belirlenen üst ve alt tarafı göstermek için üst ve kesit görünümü hem de kabataslak (A) Düz PLLA film ve (B) electrospun lifleri.
Şekil 4:. Gerektiğinde düzlemde (p) ve hizalanmış lifleri (a) PLLA ventral (indis) olarak kullanıldığına dair veya dorsal (üst simge) yüzeylerde dahil olmak üzere farklı kültür koşulları altında C2C12 morfolojisi Noktalı çizgiler liflerin yönünü temsil etmektedir. Hücreler düzlem yüzeye kültüre ve PLLA ve hizalanmış lifleri (SW p a) dorsal uyaranlara anlamda ile kaplanmış. Özel olarak, hücreler, fibronektinle kaplanmış, ancak wi kaplı olmayan zaman sırt lifleri duyuinci sığır serum albümini (yapışkan olmayan bir protein). Sonuç olarak hücreler, fibronektinle kaplanmış elyaflara uygun ve aynı yönde hizalanır. Referans 9 uyarlanmıştır Görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: farklılaşma ortam içinde 4 gün sonra sandviç gibi kültürlerde hücre farklılaşması. Farklı kültür koşulları düzlemine (P) ve sıralanmış liflerden (a) PLLA ventral (simge) veya dorsal (numaralar) olarak kullanıldığı alt-tabakalar. Örnekler her durumda fibronektin ile kaplandı da dahil olmak üzere analiz edilmiştir. (A) Floresans sarkomerik miyozin pozitif hücreler (yeşil) ve hücre çekirdekleri (kırmızı) gösteren lekeleme. (B) FarklılaştırılmışHızlı Fourier Dönüşümü hesaplanan hücreler oryantasyon. (C) Miyogenesis sarkomerik miyozin-pozitif hücrelerin yüzdesi ile belirlenen. Veri altın standart kontrol normalize edilir. Istatistiksel olarak anlamlı farklılık *** P <0.001 ile gösterilir. Referans 9 uyarlanmıştır Görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: ventral fibronektin Reorganizasyon. Sandviç kültürü yeni fibronektin fibriller oluşturarak ventral FN reorganizasyon tetikler. (Fırça gibi etiketleme, beyaz oklarla işaret) ventral fibronektin farklı dorsal protein kaplama (fibronektin, vitronektinin ve sığır serum albümini) ile sandviç benzeri kültürler içinde yeniden düzenlenirya da dorsal substrat kaplanmamış sol bile. Aktin hücre iskeleti (yeşil), çekirdekleri (mavi) ve FN (kırmızı) gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: 2B Hücre göçü. L929 fibroblast iyileşmesi deneyini yara bir fibronektin kaplı cam lamel göç. Görüntüler (her 20 dakikada alınan bir çerçeve ile) 16 saat boyunca elde edildi. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 2:. Sandviç gibi kültür içinde hücre göçü, bir sandviç gibi kültür içinde iyileşmesi deneyini yara göç L929 fibroblast ventral alt tabaka bir fibronektin kaplı cam lamel ve dorsal substrat bir fibronektin kaplı PLLA filmdi vardı. Görüntüler (her 20 dakikada bir alınan bir çerçeve ile) 16 saat süre ile elde edilen. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Günümüzde, 3D kültür kanseri dahil olmak üzere hücre biyolojisinde önemli bir ilaç ve biyoteknolojik sanayi için konu yanı sıra araştırma, ve kök hücre. Bunun bir sonucu olarak çok sayıda 3D kültür sistemleri geliştirilmiştir. Ne yazık ki, 3D sistemleri arasındaki farklılıklar genellikle hücre kader anlayışı engelleyen, farklı hücre davranışı neden olur. Ayrıca, deneysel işlemler genellikle 2B kültür sistemleri gibi basit değildir. Bu nedenle bu bazı sakıncaları çok önemlidir aşmak isteyen yeni kültür sistemlerinin geliştirilmesi.
Sandviç-benzeri kültür güçlü, hücre farklılaşması, hücre morfolojisi, hücre sinyal iletimi ve hücre göçü gibi önemli hücresel süreçleri etkilemeye gösterilmiştir. Sandviç gibi kültür 3D kültür sistemleri ile 2D bağlantıları bu ifadeyi destekleyen 3D sistemlerde kültür hücreleri ile Dahası hücreler paylaşmak benzerlikler. Fizyolojik dokuları 3-14 μ aralığında gözeneklere sahipBu nedenle hücrelerin sınırlandırılmasına ve m, göç gibi hücresel süreçleri etkilerler. Dorsal ve ventral uyaranlar başına hücre morfolojisi sınırlar ve mutlaka ne olursa olsun, protein kaplamaların hücre göçü etkileyecek bir kısıtlı bir ortamda temsil gibi bu şekilde sandviç benzeri bir sistem kullanılarak değinmeyecek.
Nedeniyle dorsal ve ventral reseptörlerinin eşzamanlı uyarılmasına, sandviç gibi kültür hücre davranış boyutluluk rolünü araştırmak için sağlam bir teknolojidir. 2B yüzeylerde dayanmaktadır Dahası, bu kültür sistemi malzeme özellikleri ve farklı mikroçevrelerde altında hücre davranışının çalışma izin ECM girişleri farklı çalışma son derece çok yönlüdür. Ayrıca, dorsal reseptörleri hücre kaderi üzerinde uyarılır hangi zaman etkisi farklı zaman noktalarında dorsal alt tabakayı kaplayan tarafından incelenebilir. Bu nedenle, diğer 3D sistemlerinden farklı olarak, sandviç benzeri bir sistem geniş bir tayfıhücresel mikroçevrelerde iyi kontrol edilir. Sonuç olarak sandviç gibi sistem farklı kültür koşulları altında hücre biyolojisi ve test hücresi kaderi incelemek amacıyla farklı fizyolojik ortamlarda taklit etmek için ilginç bir hücre kültürü platformudur.
Daha önce de belirtildiği gibi, bu sistemin bir avantajı da, farklı ventral ve dorsal alt-tabakalar farklı protein kaplamalar kullanılarak incelenebilir olmasıdır. Bu nedenle, ligand yoğunluğu gibi hücre kaderi için önemli parametreler kullanılan 2B substratların her biri (örn ventral ve dorsal yüzeyler) ligand yoğunluğunu kontrol ederek ayarlanmış olabilir. Ancak, farklı yüzeyler protokolde değişiklik gerekebilir unutmayın. Örneğin, büyük dorsal substratlar kullanılarak Petri kabı kapalı örnekleri soymak için uygun inkübasyon süresi ayarlamak için ihtiyaç neden olabilir. Benzer şekilde, daha büyük bir ventral alt tabakalar için ventral sınırlı oksijen geçirgenliği numunenin merkezinde hipoksik bölgelerinde sonuçlanabilirAlt tabaka (cam lamel nedeniyle). Ayrıca, analiz prosedürleri substrat özelliklerine bağlıdır. Hala protein / nükleik asitler çıkarma sağlayacak olsa Örneğin, opak dorsal substratlar kullanılarak standart mikroskopi protokolleri engel olacaktır. Hücreler ortamdan besin almak ve atık atmak için izin verilmelidir çünkü bir diğer önemli faktör dorsal substratın geçirgenliği.
Özetle, bir sandviç gibi kültür hücre kaderi araştırmak için farklı 3D benzeri mikroçevrelerde taklit imkanı sunuyor basit bir sistemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
