Sandwich-achtige microenvironments Harness Cell / Material Interactions
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Celcultuur is van oudsher uitgevoerd op twee-dimensionale (2D) substraten waar de cellen hechten behulp ventrale receptoren aan het biomateriaal oppervlak. Echter in vivo meeste cellen zijn volledig omringd door de extracellulaire matrix (ECM), resulterend in een driedimensionale (3D) verdeling receptoren. Dit kan leiden tot verschillen in de buiten-signaalroutes en dus celgedrag.
Dit artikel laat zien dat het stimuleren van de dorsale receptoren van de cellen al tot een 2D-substraat gehandeld door overlappen een film van een nieuw materiaal (een sandwich-achtige cultuur) triggers belangrijke wijzigingen ten opzichte van standaard 2D culturen. Verder is de gelijktijdige excitatie van ventrale en dorsale receptoren verschuift celgedrag dichter bij die gevonden in 3D omgevingen. Bovendien, vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal inte toelaatractions bijvoorbeeld topografie, stijfheid en ander eiwit coatings op zowel de ventrale en dorsale zijde. Ten slotte, sandwich-achtige cultures op basis van 2D substraten verscheidene analyseprocedures reeds ontwikkeld voor standaard 2D kweken kan normaal worden gebruikt, overwinnen complexere procedures die nodig zijn voor 3D-systemen.
Introduction
Traditioneel is celcultuur uitgevoerd op tweedimensionale (2D) substraten, hoewel de meeste van de in vivo cellulaire micromilieus een driedimensionale (3D) aard. Deze onnatuurlijke 2D milieu veroorzaakt veranderingen in cel gedrag als een manier van zelf-aanpassing aan een platte wereld, die rechtstreeks invloed lot van de cel 1,2. Derhalve resultaten verkregen 2D celculturen niet altijd reproduceerbaar in vivo. Dit heeft de ontwikkeling van nieuwe relevante kweeksystemen die meer fysiologische-achtige omstandigheden verder inzicht in elke dimensie afhankelijk biologisch mechanisme 3,4 krijgen verschaffen aangemoedigd.
Een van de belangrijkste verschillen tussen 2D cultuur en 3D in vivo omgeving is de verdeling van celreceptoren verankerd aan de extracellulaire matrix (ECM) dat 2D substraten cellen hechten ventraal, worden de meeste cellen in vivo volledig omringd door de ECM en dus cell hechting gebeurt door middel van een 3D verdeling van de receptoren. Dit brengt verschillende celadhesie signaalwegen daardoor belangrijke processen zoals celgroei, celdifferentiatie en genexpressie moduleren. Gedurende de laatste decennia hebben veel verschillende 3D kweeksystemen vastgesteld 5-8, hoewel hun variabiliteit en complexiteit belemmeren hun normalisatie in cultuur procedures gemeenschappelijke cel. Bovendien 3D systemen zijn gewoonlijk moeilijk te hanteren en de huidige experimentele procedures 2D substraten kunnen niet gemakkelijk worden vastgesteld voor 3D-kweken. Bovendien, literatuur zelden vergelijkt 3D culturen met het equivalent 2D conditie of andere 3D-systemen, belemmeren de juiste begrip van de cel gedrag in deze modellen.
Eens dat de cellen gehecht aan een 2D substraat, de excitatie van de dorsale receptoren – door bedekken een laag van een nieuw materiaal (sandwich-achtige kweek) – kan leiden celreacties zowel 3D-omgevingen. De reason hierachter is de gelijktijdige activatie van beide dorsale en ventrale receptoren te houden en verspreiding in de sandwich-omgeving (figuur 1) 9,10. Bijgevolg cellen ondergaan belangrijke verandering ten opzichte 2D culturen 11,12. Zo is lot van de cel bepaald tijdens de montage vanwege de sandwich cultuur, omdat de dorsale stimulatie triggers veranderingen in de belangrijkste cellulaire routes. Derhalve is het lot van de cel sterk bepaald door het tijdstip waarop de sandwich-achtige cultuur geassembleerd 11.
Vanwege de aard van het systeem, een sandwich-achtige cultuur is een eenvoudig en veelzijdig instrument dat de studie van verschillende parameters in cel / materiaal interacties zoals chemie, topografie, stijfheid en eiwitten coatings zowel de ventrale en dorsale zijde toelaat. Dit biedt een grotere mate van flexibiliteit ten opzichte van andere 3D-systemen (Figuur 2) door de onafhankelijke dorsale en ventrale combinatie van een brede variety oppervlakte condities. Bovendien kunnen verschillende cellijnen en verschillende tijdstippen de sandwich-achtige kweek monteren bestudeerd, waardoor de brede spectrum van mogelijkheden.
Een standaardprotocol van de sandwich-achtige kweek, wordt hieronder beschreven hetzij poly-L-melkzuur (PLLA) electrospun vezels of films dorsale substraten dekglaasje als ventrale substraat en fibronectine als eiwitbekleding. Sandwich-achtige culturen werden geassembleerd net na cel zaaien of na 3 uur van 2D-cultuur. Echter, er rekening mee dat andere materiële systemen en eiwitten kunnen worden gebruikt; ook de sandwich-achtige cultuur kan worden gemonteerd op verschillende tijdstippen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tegenwoordig 3D cultuur is een belangrijk onderwerp voor de farmaceutische en biotechnologische industrie, alsmede onderzoek in de celbiologie, met inbegrip van kanker en stamcellen. Bijgevolg meerdere 3D kweeksystemen ontwikkeld. Helaas, de verschillen tussen de 3D-systemen meestal resulteren in verschillende cel gedrag, belemmeren het begrip van cel lot. Trouwens, experimentele procedures zijn meestal niet zo eenvoudig als voor 2D kweeksystemen. Vandaar ontwikkeling van nieuwe kweeksystemen die overwinnen sommige van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
