Sandwich liknande mikromiljöer att utnyttja Cell / Material Interaktioner
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Cellodling har traditionellt utförts på tvådimensionell (2D) substrat där celler följer använder ventrala receptorer till biomaterialytan. Emellertid in vivo, de flesta av cellerna är helt omgiven av den extracellulära matrisen (ECM), vilket resulterar i en tredimensionell (3D) fördelning av receptorer. Detta kan utlösa skillnader i utsidan-i signalvägar och därmed i cellbeteende.
Den här artikeln visar att stimulera rygg receptorer celler som redan anslutit sig till ett 2D-substrat genom att lägga en film av ett nytt material (en sandwich-liknande kultur) utlöser viktiga förändringar när det gäller vanliga 2D kulturer. Vidare, den samtidiga exciteringen av ventrala och dorsala receptorer skiftar cellbeteende närmare den som finns i 3D-miljöer. Dessutom, på grund av utformningen av systemet, är en sandwich-liknande kultur ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt att studera olika parametrar i cellen / material integreractions, t.ex., topografi, styvhet och olika proteinbeläggningar på både de ventrala och dorsala sidor. Slutligen, eftersom sandwichliknande kulturer bygger på 2D underlag, flera analysprocedurer redan utvecklat för standard 2D kulturer kan användas som vanligt, att övervinna mer komplicerade förfaranden som behövs för 3D-system.
Introduction
Traditionellt har cellkultur utförts på bi-dimensionell (2D) substrat, även om de flesta av de cellulära mikromiljöer in vivo har en tredimensionell (3D) natur. Denna onaturliga 2D miljö utlöser förändringar i cellens beteende som ett sätt att själv anpassning till en platt värld, som direkt påverkar cell öde 1,2. Därför resultat som erhållits på 2D cellkulturer är inte alltid reproducerbar in vivo. Detta har uppmuntrat utvecklingen av nya relevanta odlingssystem som vill ge mer fysiologisk liknande förhållanden för att få ytterligare insikter i någon dimension beroende biologisk mekanism 3,4.
En av de viktigaste skillnaderna mellan 2D kultur och 3D in vivo miljö är fördelningen av cellreceptorer förankrade till den extracellulära matrisen (ECM): medan 2D substrat celler vidhäftar ventralt, är majoriteten av celler in vivo helt omgiven av ECM och sålunda cell vidhäftning sker genom en 3D-fördelning av receptorer. Detta utlöser olika celladhesion signalvägar och därigenom modulerar viktiga processer såsom celltillväxt, celldifferentiering och genuttryck. Under de senaste decennierna har många olika 3D odlingssystem etablerats 5-8, även om deras varierande egenskaper och komplexitet hindrar deras standardisering gemensamt cellodlingsförfaranden. Dessutom 3D-system är oftast inte lätt att hantera och nuvarande experimentella procedurer på 2D-substrat kan inte vara lätt att fastställas för 3D-kulturer. Dessutom litteratur jämför sällan 3D kulturer med motsvarande 2D tillstånd eller andra 3D-system, vilket hindrar riktig förståelse av cellens beteende i dessa modeller.
När med cellerna vidhäftade på en 2D-substrat, exciteringen av de dorsala receptorer – genom att överlagra en film av ett nytt material (sandwichliknande kultur) – kan utlösa cellsvar både 3D-miljöer. REAson bakom detta är samtidig aktivering av både rygg och ventrala receptorer att följa och sprida inom sandwich miljön (Figur 1) 9,10. Som en följd av celler genomgå betydande förändringar när det gäller 2D kulturer 11,12. Således cell öde bestäms vid montering på grund av sandwich kultur, eftersom rygg stimulering utlöser förändringar i viktiga cellulära vägar. Därför är cellöde starkt bestäms av den tidpunkt då den sandwichliknande kultur monteras 11.
På grund av karaktären hos systemet, är en sandwich-liknande kultur ett enkelt och mångsidigt verktyg som tillåter studiet av olika parametrar i cellen / material interaktioner såsom kemi, topografi, stelhet och proteinbeläggningar på både de ventrala och dorsala sidor. Detta erbjuder en högre grad av mångsidighet jämfört med andra 3D-system (figur 2) på grund av den oberoende dorsala och ventrala kombinationen av ett brett variety av ytförhållandena. Dessutom kan studeras olika cellinjer och olika tider för att montera den sandwichliknande kultur, ökar det breda spektra av möjligheter.
En standardprotokoll av sandwich-liknande kultur i detalj nedan med hjälp av antingen poly-L-mjölksyra (PLLA) elektrospunna fibrer eller filmer som rygg substrat, täckglas som ventrala substrat och fibronektin som proteinbeläggning. Sandwich-liknande kulturer samlades strax efter cellsådd eller efter 3 h av 2D kultur. Observera dock att andra materialsystem och proteiner kan användas; likaledes sandwichliknande kulturen kan monteras vid olika tidpunkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numera är 3D kultur ett viktigt ämne för läkemedels- och bioteknikindustrin samt forskning i cellbiologi, inklusive cancer och stamceller. Som en konsekvens flera 3D odlingssystem har utvecklats. Tyvärr, skillnader mellan 3D-system brukar resultera i olika cellbeteende, vilket hindrar förståelsen av cell öde. Dessutom, experimentella procedurer är oftast inte så enkelt som för 2D odlingssystem. Därför utvecklar nya odlingssystem som söker att övervinna några av dessa nackdelar är mycket viktigt.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
