ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
אתגר קריטי בסרטן ערמונית ניהול קליני (PCA) הוא שמציב את חוסר ההתאמה של סמנים ביולוגיים המשמשים כיום להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה. עם זאת, הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית מסתמך במידה רבה על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. מירנה ניתוחים בדגימות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגרת בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו 'סטרומה מטרתו של מאמר זה היא לתאר את זרימת עבודה פשוטה למירנה הניתוחים בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים באמצעות שילוב של בזמן אמת PCR (RT-PCR) וכלאה באתר (עורך). בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE וtissu ערמונית קפואהes וביטוי מנתחים ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR מבוסס. בנוסף, אנו מתארים שיטה מותאמת לISH מנתחת זיהוי formiRNA ברקמות ערמונית באמצעות חומצת גרעין נעול (LNA) – בדיקות מבוססות. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA).
Introduction
הסרטן של בלוטת הערמונית הוא גידול ממאיר נפוצה זכר אובחן כי הוא אחד הגורמים עיקריים לתמותה מהסרטן הקשורים בקרב גברים. בארה"ב, מוערך 220800 מקרים חדשים ו27540 מקרי מוות ידווחו בשנת 2015 1.
סרטן הערמונית הוא מחלה הטרוגנית עם מחלה משתנה מאוד כמובן את הגידולים יכולים להיות עצלים או מאוד אגרסיביים. אתגר קריטי בניהול קליני בסרטן הערמונית הוא שמציב את חוסר ההתאמה של שיטות המשמשים כיום / סמנים ביולוגיים להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול 2. שיטות הקרנה נוכחית כוללות אנטיגן ספציפי לערמונית בדיקה (PSA) ובדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE) ואחריו ביופסיות ערמונית 3. אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לסרטן הערמונית הנפוץ ביותר שיש מהפכה ניהול ושיעורי הישרדות משופרת 4 קליניים משמעותי. עם זאת, בשל מגבלות מובנות של Lac PSA כוללk של סגוליות, הקרנה מבוססת ה- PSA הוביל לעל אבחון ועל טיפול במחלה. לאור זאת, מאמצים אינטנסיביים מתבצעים מכוונים חיפוש עבור סמנים לסרטן הערמונית חלופיים, במיוחד אלה שיכולים לחזות את האגרסיביות של המחלה וקבלת החלטות טובות יותר לטיפול 4,5. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים מבטיחים.
מיקרו RNA (miRNAs) מהווה כיתה אבולוציונית שימור של RNAs קידוד שאינו קטן המדכאים ביטוי גנים לאחר תעתיק באמצעות אינטראקציות רצף ספציפי עם 3'- האזורים מתורגמים (UTRs) של מטרות mRNA מקור. הערכה היא כי> 60% של mRNAs נשמרים מטרות של miRNAs 6. גני מירנה ממוקמים באזורי intergenic או בתוך אינטרונים או אקסונים חלבון / חלבון שאינו של קידוד גנים 7. גנים אלה עיבד מועדף על ידי RNA פולימראז II לפרימהmiRNAs ר"י (פרי-miRNAs, ארוך כמה קילו-בסיס) שמבנים משניים גזע לולאה בצורת סיכת ראש הטופס. פרי-miRNAs אלה מעובדים לmiRNAs המבשר (טרום miRNAs, ארוך 60-75 נוקלאוטיד) שמיוצאים לציטופלסמה ועיבוד נוסף לmiRNAs הבוגר (18-25 נוקליאוטידים ארוך) 8-10. miRNAs לווסת תהליכים תאיים מרכזיים, כולל התפשטות, פיתוח, בידול ואפופטוזיס 11. מחקרים מראים חוסר ויסות נרחבת של פרופילי ביטוי מירנה בגידולים ממאירים אנושיים שונים, כוללים סרטן הערמונית 12-15. פרופילי ביטוי מירנה כבר דיווחו להיות dysregulated נרחב בסרטן הערמונית גרורתי ראשוני ו. ביטוי שינה מירנה נקשר עם התקדמות סרטן הערמונית, תוקפנות והישנות המדגישה את הפוטנציאל פרוגנוסטיים של miRNAs 12,14,16-19. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שmiRNAs לשחק תפקידים מכניסטית חשובים בייזום סרטן הערמונית, פיתוח, התקדמותיון וגרורות. בסך הכל, miRNAs הם מתעוררים סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה שיכול להבחין בין רקמות וסיוע נורמלים וסרטן בריבוד של גידולי ערמונית 12. כמו כן, miRNAs הם מטרות חשובות לפיתוח תרופות יעילות נגד סרטן הערמונית 20.
בשל גודלם הקטן והתנגדות לפעילות RNase אנדוגני, miRNAs הם סמנים ביולוגיים יציבים שניתן לאתר בקלות ברקמות-קבוע פורמלין 21 ובביופסיות ערמונית 22. יתר על כן, פרופילי הביטוי של miRNAs כבר לעומת ברקמות קפואות ופורמלין קבוע ונמצאו להיות מתואמים חזק 21. עם זאת, ביטוי מירנה פרופיל ברקמות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגר בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו 'סטרומה הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית רלי כבדותes על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. כאן אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה המשמשת במעבדה שלנו לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. אנו מעסיקים שילוב של זמן אמת כמותי PCR וכלאה באתר למירנה ניתוחים של דגימות קליניות, עם המידע לשעבר מניב כמותית נוספת והאחרון להמחשת ביטוי ההפרש של סמנים ביולוגיים מירנה פוטנציאליות במערך של רקמות. בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE ורקמות ערמונית קפוא, ביטוי מנתח ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR ומירנה בטכניקת הכלאה באתר מבוסס באמצעות חומצות גרעין נעולים (LNA) מבוסס בדיקות 23. בדיקות מבוססות LNA מציעות רגישות וסגוליות מוגברות בהשוואה לדנ"א או בדיקות המבוססות RNA- ומאפשרת זיהוי חזק של כל רצפי מירנה, ללא קשר לתוכן GC שלהם וגם לאפשר discrimination של משפחות מירנה. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA), עם האחרונים מציע את הפוטנציאל להאצת גילוי סמן ביולוגי מירנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או רקמות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. בסרטן הערמונית, מספר מחקרים מצביעים על תפקיד חשוב של מיקרו-רנ"א בסרטן ערמונית ייזום, התקדמות וגרורות. עם זאת, תוצאות סותרות לעתים קרובות מתקבלות על 22…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר רוג'ר אריקסון על תמיכתו וסיוע בהכנת כתב היד.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן במכונים הלאומי לבריאות
(גרנט מספר RO1CA177984; RO1CA138642), פרויקט תכנית VA בסרטן הערמונית (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
