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Medicine

As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

Um desafio crucial no cancro da próstata (PCA) manejo clínico é representada pela inadequação dos biomarcadores atualmente utilizados para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento. Nos últimos anos, microARNs (miARNs) surgiram como biomarcadores alternativos promissores para o diagnóstico e prognóstico do cancro da próstata. No entanto, o desenvolvimento de miARNs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata depende fortemente de sua detecção precisa em tecidos clínicos. analisa miRNA em amostras clínicas de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O objetivo deste artigo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de miRNA em FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado usando uma combinação de -PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridação in situ (ISH). Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e congelado tissu próstataes e expressão análises por sonda Taqman-base miRNA RT-PCR. Além disso, nós descrevemos um método otimizado para ISH analisa detecção formiRNA em tecidos da próstata, utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) - sondas de base. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA).

Introduction

O câncer de próstata é um tumor maligno masculino comumente diagnosticado que é uma das principais causas de mortalidade relacionada com câncer entre os homens. Nos EUA, uma 220,800 novos casos estimados e 27.540 mortes serão relatados em 2015 1.

O câncer de próstata é uma doença heterogênea com doença altamente variável course- tumores podem ser indolente ou muito agressivo. Um desafio crítico no manejo clínico do câncer de próstata é representada pela inadequação dos atualmente utilizados métodos / biomarcadores para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento 2. Métodos de rastreio atuais incluem antígeno (PSA), em específico da próstata e um exame de toque retal (DRE), seguido de biópsias de próstata 3. Antígeno específico da próstata (PSA) é o biomarcador de câncer de próstata mais amplamente utilizado que revolucionou significativamente a gestão clínica e melhoria das taxas de sobrevivência 4. No entanto, devido às limitações inerentes de PSA incluindo lack de especificidade, o rastreio baseada em PSA levou a mais de diagnóstico e tratamento ao longo da doença. Em vista disso, os esforços intensivos estão sendo direcionados para a busca de biomarcadores de câncer de próstata alternativos, especialmente aqueles que podem prever a agressividade da doença e tomar melhores decisões de tratamento 4,5. Ao longo dos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram como promissoras biomarcadores de câncer de próstata suplentes.

Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservadas de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão gênica pós-transcricionalmente através de interacções específicas para a sequência com os 3'- não traduzidas (UTRs regiões) de alvos de RNAm cognatos. Estima-se que> 60% de mRNAs são alvos de miARNs 6 conservada. miRNA genes estão localizados em regiões intergénicas ou dentro de exões intrões ou de proteína / proteína não-codificantes genes 7. Estes genes são preferencialmente transcrito pela ARN-polimerase II em primamiRNAs ry (pri-miRNAs, vários quilobases de comprimento) que as estruturas secundárias de loop haste em forma de forma hairpin. Estes miRNAs pri-são transformados em miRNAs precursoras (pré-miRNAs, 60-75 nucleótidos de comprimento) que são exportados para o citoplasma e novamente transformadas em miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de comprimento) 8-10. miARNs regular processos celulares chave, incluindo a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose 11. Estudos sugerem uma desregulação generalizada de perfis de expressão de miARN em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata 12-15. perfis de expressão de miARN têm sido relatados para ser amplamente desregulado no cancro da próstata primário e metastático. MiRNA expressão alterada têm sido relacionados com a progressão do câncer de próstata, agressividade e recorrência destacando o potencial prognóstico de miRNAs 12,14,16-19. Um crescente corpo de evidências indicam que os miRNAs desempenham papéis importantes mecanicistas na iniciação do câncer de próstata, o desenvolvimento, o progressoião e metástase. No geral, os miRNAs estão emergindo como biomarcadores alternativas promissoras para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata que podem distinguir entre tecidos e ajuda normais e cancerosas na estratificação de tumores de próstata 12. Além disso, os miRNAs são alvos importantes para o desenvolvimento de terapias eficazes contra o câncer de próstata 20.

Devido ao seu pequeno tamanho e resistência à actividade da RNase endógena, miARNs biomarcadores são estáveis ​​que podem ser facilmente detectadas em tecidos fixados em formalina 21 e 22 em biópsias da próstata. Além disso, os perfis de expressão miARNs foram comparadas em tecidos congelados e fixados em formalina e foram encontrados para ser fortemente correlacionada 21. No entanto, a expressão miRNA perfis em tecidos clínicos de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata fortemente reliES na sua detecção precisa em tecidos clínicos. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho simplificado utilizado em nosso laboratório para a expressão miRNA de perfis FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado. Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e a hibridização in situ para miARN análises de amostras clínicas, com a ex-rendendo mais informações quantitativas e o último para visualizar a expressão diferencial de biomarcadores potenciais miARN em uma variedade de tecidos. Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e tecidos da próstata congelados, analisa expressão por Taqman-sonda baseada miRNA RT-PCR e miRNA in situ utilizando técnica de hibridização de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) à base de sondas 23. Sondas à base de LNA oferecem maior sensibilidade e especificidade em relação ao ADN ou RNA-sondas base e permite a detecção robusta de todas as seqüências de miRNA, independentemente do seu conteúdo GC e também permitir que discriminação de famílias de miARN. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último que oferece o potencial para acelerar miARN descoberta biomarcador.

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Protocol

Foram obtidas amostras de câncer de próstata fresco congelado-fixada em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou a partir do SFVAMC. Amostras eram de pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical em SFVAMC. Termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê UCSF em Pesquisa com Seres Humanos. Alternativamente, tecidos de câncer de próstata microarrays foram adquiridos a partir de fontes comerciais e utilizados para análises de miRNA por ISH. Informações clínico-patológico e acompanhamento para pacientes com câncer de próstata analisados ​​foram coletados.

1. As amostras de tecidos

  1. Cortar amostras de tecido da próstata câncer em 10 mm seções usando um micrótomo e mancha com H & E seguindo o protocolo do fabricante.
  2. Comente lâminas coradas para a identificação de focos de câncer de próstata, bem como epitélio glandular normal adjacente.
    Nota: A placa certificada patologista deve rever os slides H & E manchada e maRK para o tumor e zonas normais. Use os slides marcados como guias nas seções subseqüentes para miRNA análises de tumor vs áreas normais.

2. miRNA expressão quantitativa Análises por PCR em tempo real

Nota: Esse fluxo de trabalho envolve as seguintes etapas: Captura de Laser microdissection, isolamento de RNA total (incluindo miRNA e mRNA), ensaio de miRNAs maduros usando os ensaios de expressão TaqMan MicroRNA conforme detalhado nas seções seguintes.

  1. Extração de RNA
    1. Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos FFPE
      1. Captura Laser microdissection (LCM)
        Nota: Siga as etapas 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 em um exaustor química.
        1. Preparar lâminas de tecido (10 mm seções) para LCM. Deparrafinize secções de tecido por imersão em xileno (2x), durante 10 min cada, em seguida, re-hidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada água(5 min).
        2. Após reidratação, as secções com hematoxilina mancha durante 30 seg seguido de água.
        3. Coloque tecidos em etanol graduado (70%, 95%, 90%, 80%, 70%) (5 min cada) e xileno (5 min).
        4. Lâminas secas em um exaustor e, em seguida, colocar no instrumento LCM para microdissection.
        5. Execute microdissecações com o Sistema de LCM de acordo com as instruções do fabricante 24. Uso patologista marcado lâminas como guias para a identificação de focos de cancro da próstata, bem como o tecido normal adjacente. Use o feixe de laser em uma pulsos 10-20 mm de diâmetro com uma potência de 70-90 mW.
        6. Áreas de captura de interesse com pulsos de laser infravermelho em bonés LCM. Combinar células de 2-5 cápsulas para a extração de miRNA por amostra. Para garantir a integridade de ARN extraído, imediatamente processar células capturadas para extracção miARN.
        7. Alternativamente, as células lisam em tampão de extracção de miARN (de acordo com o protocolo do fabricante) e STOre lisados ​​a -80 ºC.
      2. miARN Extracção e análises de LCM microdissecadas tecidos
        1. Extrair o ARN total a partir de tecidos FFPE microdissected utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
          Nota: O rendimento de RNA de captura a laser miscrodissection é geralmente baixa. Portanto, o RNA é fluido em volumes baixos (20-30 ul) e utilizada para criação de perfil de expressão, utilizando ensaios de expressão de microRNA Taqman seguintes instruções do fabricante (também descrito na seção 2.2). Optimização de ARN de entrada para detecção por PCR em tempo real de miARNs maduras sugere que o 5 ul do ARN eluído é óptima para cada reacção de transcrição reversa miARN-específicos. Como um controle endógeno, RNU48 / RNU24 é usado. Para as reacções de controlo, 2 ul do ARN eluído foi utilizado para a reacção de transcrição reversa.
    2. Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos congelados
      1. Homogenhecer tecidos da próstata ressecados congelados por trituração dos tecidos em azoto líquido usando um almofariz e pilão. Transferir tecido homogeneizado para um tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula arrefecida. Manter a argamassa / pilão e uma espátula à mesma temperatura por imersão em azoto líquido então homogeneizado de tecido pode ser facilmente transferido.
      2. Adicionar comercial de isotiocianato de guanidina-fenol reagente (1 mL / 0,1 g de tecido) para o tecido homogeneizado e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
        Nota: Os tecidos homogeneizados em reagente isotiocianato de guanidina-f enol comercial pode ser armazenado a -80 ° C durante vários meses.
      3. Adicionar clorofórmio ao homogeneizado (0,2 ml de clorofórmio / mL) e agitar vigorosamente durante 30 segundos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 3-5 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC.
      4. Transferir a fase aquosa superior a um tubo de 1,5 ml estéril fresco livre de RNase.
      5. Adicionar um volume igual de álcool isopropílico. Misturar e incubar por 10 miN, à TA, seguido por centrifugação a 12.000 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar a ARN.
      6. Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN com 1 mL de etanol a 70%. Centrifuga-se a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC.
      7. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Sedimentos de RNA secar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Dissolver RNA em 50-100 ul de água livre de nuclease.
      8. Realizar quantificação de ARN utilizando um espectrofotómetro NanoDrop determinar a integridade de ARN e com um Bioanalyzer. Ajustar a concentração de ARN e 10 ng / ul. Use 10-50 ng RNA para miRNA- reação cDNA específico seguido por análises em tempo real PCR (Seção 2.2).
  2. PCR quantitativa em tempo real para análises de expressão de miARN
    Nota: miARNs maduros ensaio utilizando um protocolo de duas etapas de RT-PCR tal como descrito abaixo.
    1. Transcrição Reversa (RT)
      1. Realizar a transcrição reversa de ARN a partir de ADNc utilizando um kit de transcrição reversa miARN em conformidade com as instruções do fabricante.Use de 10-50 ng de ARN total com miARN iniciador específico do kit MicroRNA Ensaios e RT. Use RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Dilui-se ADNc de 1: 5 a 1:10 (dependendo da abundância de miARN analisados) e utilizar na detecção em tempo real de PCR tal como descrito no passo seguinte.
    2. PCR em tempo real para detecção de miRNA maduro
      1. Amplificar produtos de PCR de amostras de ADNc utilizando os ensaios MicroRNA com uma mistura mestre universal de modo rápido de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar amostras para RNU48 / RNU24 controle / RNU6B. Usar o método comparativo Ct (limiar de ciclo) para calcular as alterações relativas na expressão do gene no rápido tempo real do sistema de PCR. Analisar cada amostra em triplicado.

3. miRNA expressão análises por hibridação in situ (ISH)

  1. Pré-tratamento de tecidos
    1. Corte 5 mm de blocos de tecido de câncer de próstata FFPE usando um micrótomo.
      2. Nota: As lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante várias semanas para análises miARN.
    2. Deparrafinize os tecidos por imersão das lâminas com xileno (2 x), durante 15 min cada.
    3. Reidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), seguido por água destilada (5 minutos).
    4. Fixar as lâminas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 20 min.
    5. Lavam-se as lâminas com PBS (2x) à temperatura ambiente durante 5 min cada.
    6. Tratar as lâminas com 10 ug / ml de Proteinase K a 37 ° C durante 10 min em tampão de proteinase K pré-aquecido (5 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl a 1 mM).
    7. Seguindo o tratamento com proteinase-K, enxaguar as lâminas com 0,2% de glicina em PBS durante 30 segundos.
    8. Lavagem das lâminas em PBS (1x) à temperatura ambiente durante 5 min.
    9. Fixar as lâminas com paraformaldeído 4% em PBS durante 15 min.
    10. Lavar as lâminas comPBS durante 5 min.
  2. Hibridização
    1. Pré-hibridar as lâminas com solução de pré-hibridação durante 3-4 horas a 55 ° C numa câmara humidificada. Use lenços de laboratório de tecido embebido em formamida 50% / 50% 5x SSC para manter a câmara úmida.
    2. Use 5 'sondas marcadas com digoxigenina a uma concentração de 20-50 nM em tampão de hibridação. Diluir sonda específica para miRNA (20-50 nM) e sonda de controlo U6 pequeno RNA nuclear (20 nM), aquecer a 90 ºC durante 4 minutos, coloque-o no gelo, e adicionar ao gelo tampão de hibridação frio (2-4 ng / mL ).
    3. Remoção da solução de pré-hibridação, adicionar solução de hibridação (sonda + tampão de hibridação, 100 ul por slide), incubar durante 12-16 horas a sonda de temperatura específicas de hibridação (temperatura = hibridação sonda-21 Tm ºC). Realizar hibridações em uma câmara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC).
  3. Lavar Passos
    1. Lavam-se as lâminas com 2x SSC durante 10 min a 45 ºC.
    2. Wash tele desliza com SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC.
    3. Lavar as lâminas com SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada.
    4. Incubar as lâminas com solução de bloqueio 1x durante 1-2 horas à temperatura ambiente
  4. Detecção
    1. Incubar as lâminas com 1: 100 PBS diluído anticorpo anti-digoxigenina conjugado AP-para 1-4 horas ou durante a noite a 4 ºC.
    2. Lavam-se as lâminas com PBS (3x), temperatura ambiente, durante 10 min cada.
    3. Lavar as lâminas (2x) com fosfatase alcalina de tampão (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à temperatura ambiente durante 5 min cada.
    4. Incubar as lâminas em substrato BM roxo AP no escuro à temperatura ambiente durante 1-20 horas.
    5. Lavar as lâminas com PBS contendo 0,1% de Tween-20 e de lavagem (2x) em água.
    6. Montar as lâminas utilizando uma mídia de montagem aquosas e examinar ao microscópio.

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Representative Results

Perfil de expressão de miR-203 em amostras clínicas LCM cancro da próstata primário por RT-PCR análises (Figura 1)

Análises de RT-PCR da expressão relativa de miR-203 em LCM tecidos de cancro da próstata primário e as regiões adjacentes normais correspondentes foi realizada como descrito no Saini et ai. RNU48 15 foi utilizada como um controlo. A tabela abaixo resume a expressão de miR-203 em relação a tecidos de tumor de cancro da próstata relativamente a tecidos normais adjacentes.

Comparação da expressão de miR-383 por RT-PCR em análises microdissecados vs captura a laser microdissecados tecidos PCA (Figura 2)

Tecidos de cancro da próstata ou foram microdissecadas ao microscópio, ou foram submetidas a LCM seguido por análises de RT-PCR de miR-383 de expressão em tecidos de tumor em relação ao normal, combinou-383 miR expressão adjacente tissues.Relative em amostras tumoraissão shown.RNU48 foi utilizado como um controlo. Como mostrado na Figura 2, não foram observadas diferenças quando miARN expressão foi analisada nestes tecidos. LCM tem uma vantagem sobre microdissecação sob o microscópio, uma vez que permite o isolamento de uma população relativamente pura de tecidos da próstata e é mais fiável.

ISH análises de expressão de miR-203 em tecidos clínicos de cancro da próstata (Figura 3)

Em análises de hibridação in situ da expressão de miR-203 em tecidos normais e de cancro da próstata metastático do osso foi realizada como descrito no Saini et ai. 15 de tecido de cancro da próstata de microarray foi utilizado para análises ISH utilizando 5'-DIG marcado com sondas específicas para o LNA 203 e miR- U6. Exemplo representativo de análises ISH é mostrado na Figura 3, uma figura parcialmente reproduzida de Saini et ai. (2011) 15 A Figura 3A e 3B showsmiR-203 expresSion (esquerda) e expressão de controle U6 (à direita) nos tecidos indicados. ISH sinais eram semi-quantitativamente classificados com base na intensidade de coloração e a percentagem de células coradas e atribuída uma pontuação de 1 a 4. As pontuações de intensidade de miR-203 de expressão foram divididos por aqueles de expressão U6 para obter normalizados de miR-203 que os níveis de expressão foram representadas graficamente na Figura 3C.

Figura 1
Figura 1: Perfil de expressão de miR-203 em amostras clínicas LCM cancro da próstata primário por RT-PCR análises. A análise por RT-PCR da expressão relativa de miR-203 em tecidos de cancro da próstata e LCM-as regiões adjacentes normais correspondentes. RNU48 foi utilizado como um controlo. A tabela abaixo resume a expressão de miR-203 relativa em tecidos tumorais de câncer de próstata em relação aos tecidos normais adjacentes. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Comparação de miR-383 expressão por RT-PCR em análises microdissecados vs captura a laser microdissecados CaP tecidos tecidos de cancro da próstata ou foram microdissecadas ao microscópio, ou foram submetidas a LCM seguido por análises de RT-PCR de miR-383 em expressão. tecidos tumorais em relação a tecidos normais adjacentes emparelhados. Relativos miR-383 expressões em amostras de tumor são shown.RNU48 foi usado como um controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. ISH análises de expressão de miR-203 em tecidos de cancro da próstata clínicos Esta figura foi modificado a partir do 15. Os tecidos foram hibridados com DIG-labeencheram ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas baseadas para miR-203 e U6 (controlo) tal como descrito em 15. Exemplo representativo de análise ISH de expressão de miR-203 (painéis esquerdos) e expressão de controle U6 (painéis da direita) no câncer de próstata humano tecidos normais e metastáticas óssea mostrando atenuada miR-203 expressão em tecidos com metástases ósseas. ISH exemplos representativos mostrados em A com uma ampliação superior (40X). Relative miR-203 em níveis de expressão de tecidos prostáticos normais e tecidos ósseos cancro da próstata metastático como avaliado por análise de ISH. expressão de miR-203 foi marcado, normalizada para pontuações U6 e plotados. A linha horizontal representa o valor médio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste artigo, descrevemos um fluxo de trabalho simplificado para criação de perfil de expressão de miRNA em FFPE arquivados ou tecidos clínicos de câncer de próstata fresco congelado. No cancro da próstata, diversos estudos sugerem um papel importante na iniciação da microARNs cancro da próstata, progressão e metástase. No entanto, resultados conflitantes são frequentemente obtidos em um determinado miRNA 22 desde a extração de miRNA e analisa métodos diferem amplamente. Em vista da evidência emergente apoiar a aplicação potencial destes pequenos RNAs alternativos como biomarcadores de cancro da próstata para o prognóstico do cancro da próstata, diagnóstico e terapia, existe a necessidade de quantificar com precisão perfis de expressão em tecidos de miARN clínicos.

Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e hibridação in situ para análises de amostras clínicas miARN de cancro da próstata. Dentro desse fluxo de trabalho, nós otimizamos as metodologias existentes para a extração de miRNA, analisa expressão por Taqhomem primário à base de RT-PCR e análise por ISH sondas LNA. Durante todo o fluxo de trabalho, é de extrema importância para manter um ambiente livre de RNase. Todos os reagentes / soluções utilizados devem ser RNase livre e cuidado extra deve ser utilizado na manipulação de RNA e de outros reagentes. Todas as reações em tempo real deve ser criado em gelo para minimizar a degradação do RNA.

Accurate perfis de expressão em tecidos de câncer de próstata é muitas vezes dificultada pela heterogeneidade e à natureza multifocal de lesões de câncer de próstata 25. Isto pode ser ultrapassado através da utilização de uma técnica de captura de microdisssection laser que permite a separação das células epiteliais benignas e malignas e também reduz a contaminação do estroma, o que permite análises moleculares a jusante precisos de tecidos da próstata 22,25. Nós empregamos LCM de tecidos FFPE arquivados seguido de expressão miRNA perfilar usando Taqman MicroRNA ensaios de expressão que foi avaliado para ser confiável. miARN perfis de tecidos LCM tem significant potencial para melhorar a descoberta de biomarcadores miRNA. Na verdade, existe um interesse considerável na análise de tecidos FFPE considerando que estes tecidos são amplamente utilizados por patologistas para análises clínicas, preservação e arquivamento e estão prontamente disponíveis 3. Além disso, devido ao seu pequeno tamanho e resistência a actividade RNase endógena, os miRNAs são relativamente menos afetados pela FFPE degradação dependente e são atrativos potenciais biomarcadores 3. Os perfis de tecidos fixados em formalina expressão miARN têm sido relatados para ser fortemente correlacionada com as de tecidos congelados 21.

Nós empregamos e comparados dois kits comerciais para extração de miRNA a partir de tecidos FFPE. Embora ambos os kits produziu RNA de alta qualidade para as análises de RT-PCR, foi utilizado o que utiliza um protocolo simples, simplificado para a purificação de miARNs consistente e o ARN total a partir de tecidos FFPE.

Integridade, pureza e concentração de RNA should ser testado antes de análises de RT-PCR. Amostras que apresentem relação A260 / A230 baixo (<1,8) deve ser re-precipitada e re-analisados ​​para a pureza antes de usar em uma reação RT. Além disso, analisa-PCR em tempo real de tecidos clínicos podem precisar de ser ainda mais optimizado. Ciclo limiar (valores Ct)> 33 indicam baixa amplificação refletindo baixo modelo de cDNA de partida. Neste caso, entradas de modelo de cDNA pode ser aumentada. Além disso, é de extrema importância que o controle adequado é usado para normalizar e determinar quantificações miRNA relativos entre tecidos normais e tumorais. Controle endógeno (RNU48 / RNU24 / RNU6B) é escolhido com base na uniformidade da amplificação de sinais em amostras normais versus de tumor.

Além disso, nós descrevemos um protocolo otimizado para análises miRNA ISH de tecidos de câncer de próstata com base em testes com base LNA-. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último a oferta potenteial para acelerar a descoberta de biomarcadores miRNA. Este protocolo pode também ser aplicado a outros tipos de tecidos. No entanto, a duração de proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment pode precisar de ser optimizada. Proteinase K digestão permite que a sonda miRNA para entrar nas células, enquanto a fixação paraformaldeído é necessário para evitar a perda de miRNA seguinte permeabilização. Este protocolo, originalmente desenvolvido para uso com sondas LNA 26 é otimizado para obter um sinal específico com fundo mínima em tecidos da próstata. Sonda concentrações e condições de incubação são otimizados para tecidos de câncer de próstata. Empregamos 5'digoxigeninlabeledprobes a uma concentração de 20-50 nM, dependendo da abundância de miARN. No entanto, 3'digoxigeninlabeledprobes dupla marcado e (5 'e 3') sondas marcadas podem ser substituídos. Na verdade, as sondas duplas marcadas oferecem o potencial para um melhor desenvolvimento colorimétrico para a detecção de microRNA e são recomendados para baixa abundância de detecção de miRNA. Além disso, a duração do bloqueio e incubações de anticorpos pode ser optimizada. Mais de bloqueio é recomendado para o fundo mais baixo, em particular com miARNs de baixa abundância. Thedurationofcolor reação com a BM substrato roxo devem ser cuidadosamente monitorizados. Incubações mais longas podem gerar a coloração de fundo. Normalmente, miARNs abundantes exigir incubações mais curtos (1-2 horas), enquanto são detectados menos abundante miARN com incubações mais longas. Durante ISH, é importante para assegurar que as secções de tecido não sequem durante qualquer um dos passos, como esta pode levar a artefactos de coloração.

Em conclusão, apesar de vários estudos sugerem miRNAs como importantes biomarcadores de câncer de próstata, o significado de vários desses estudos é muitas vezes debatida devido a resultados conflitantes. Aqui nós definimos um fluxo de trabalho otimizado para expressão miRNA precisas análises em amostras clínicas de câncer de próstata que têm um potencial de acelerar a descoberta de miRNA como biomarcadores para o câncer de próstata. Enquantoesse fluxo de trabalho tem um potencial significativo para a expressão miRNA com precisão o perfil em tecidos clínicos de câncer de próstata, existem limitações inerentes às técnicas empregadas. MiARNs abundantes de baixo pode ser difícil de um perfil com a optimizado miARN RT-PCR e análises ISH descrito aqui. Embora perfis com base de RT-PCR tem uma gama dinâmica mais larga do que a ISH 27,28, baixas quantidades de ARN obtidos a partir de GCV podem limitar a detecção de baixos miARNs abundantes. Detecção baseada em ISH de miRNAs produz poderosa informação espacial, no entanto as suas limitações são de que ele é uma técnica semi-quantitativa com uma gama dinâmica menor 28. Esta técnica baseia-se na especificidade e sensibilidade das sondas utilizadas e também na optimização das condições de hibridação e detecção de miARN.

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Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Roger Erickson por seu apoio e assistência na preparação do manuscrito.

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer, no Instituto Nacional de Saúde

(Grant Número RO1CA177984; RO1CA138642), projeto de programa VA sobre o câncer de próstata (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

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As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos
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Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

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