Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ميرنا تحليلات التعبير في سرطان البروستاتا الأنسجة السريرية

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

وشكلت تحديا حاسما في سرطان البروستاتا (PCA) التدبير العلاجي السريري بسبب عدم كفاية المؤشرات الحيوية المستخدمة حاليا لفحص الأمراض والتشخيص والتشخيص والعلاج. في السنوات الأخيرة، microRNAs (miRNAs) ظهرت مؤشرات حيوية بديلة واعدة بالنسبة لتشخيص سرطان البروستاتا والتكهن. ومع ذلك، فإن تطوير miRNAs والمؤشرات الحيوية فعالة لعلاج سرطان البروستاتا يعتمد بشكل كبير على كشف دقيق في الأنسجة السريرية. ميرنا يحلل في سرطان البروستاتا العينات السريرية وغالبا ما يشكل تحديا نظرا لعدم تجانس الورم، وأخطاء أخذ العينات، وتلوث انسجة الخ والهدف من هذه المقالة لوصف سير عمل مبسط لميرنا يحلل في FFPE المؤرشفة أو سرطان البروستاتا المجمدة العينات السريرية جديدة باستخدام مزيج من الكمي في الوقت الحقيقي PCR (RT-PCR) والتهجين في الموقع (ISH). في هذا العمل، ونحن تحسين المنهجيات القائمة لميرنا الاستخراج من FFPE وTISSU البروستاتا المجمدةوفاق والتعبير وتحلل من قبل TAQMAN مسبار استنادا ميرنا RT-PCR. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طريقة الأمثل لISH يحلل كشف formiRNA في أنسجة البروستاتا باستخدام حمض النووي مؤمن (LNA) - تحقيقات القائمة. يمكن تطبيقها لدينا الأمثل بروتوكول ميرنا ISH لسرطان البروستاتا شرائح الأنسجة أو ميكروأرس الأنسجة سرطان البروستاتا (TMA).

Introduction

سرطان غدة البروستاتا هي خباثة الذكور تشخيصا التي هي واحدة من الأسباب الرئيسية لوفيات السرطان بين الرجال ذات الصلة. في الولايات المتحدة، وهي 220800 حالة جديدة المقدرة وسيتم إبلاغ 27540 حالة وفاة في عام 2015 1.

سرطان البروستاتا هو مرض غير متجانسة مع المرض متغير بدرجة كبيرة طبعا- الأورام يمكن أن يكون المتراخي أو عدوانية جدا. وشكلت تحديا حاسما في سرطان البروستاتا التدبير العلاجي السريري بسبب عدم كفاية الطرق المستخدمة حاليا / المؤشرات الحيوية للكشف عن المرض، والتشخيص، والتشخيص والعلاج 2. وتشمل طرق الفحص الحالية مستضد البروستات محددة (PSA) اختبار وفحص المستقيم الرقمي (DRE)، يليه خزعات البروستاتا 3. مستضد البروستات محددة (PSA) هو الأكثر استخداما على نطاق واسع العلامات البيولوجية سرطان البروستاتا الذي أحدث ثورة بشكل كبير التدبير العلاجي السريري وتحسين معدلات البقاء على قيد الحياة 4. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى القيود المتأصلة في دعم البرامج والإدارة بما في ذلك أمريكا اللاتينية والكاريبيوقد أدى ك التحديد، وفحص القائم على دعم البرامج والإدارة لأكثر من تشخيص وأكثر من العلاج من هذا المرض. في ضوء ذلك، يتم توجيه الجهود المكثفة نحو البحث عن بديل المؤشرات الحيوية سرطان البروستاتا، ولا سيما تلك التي يمكن التنبؤ عدوانية من المرض ومحرك قرارات أفضل علاج 4،5. على مدى السنوات القليلة الماضية، microRNAs (miRNAs) قد برزت بوصفها بديلة المؤشرات الحيوية سرطان البروستاتا واعدة.

MicroRNAs (miRNAs) تشكل فئة الحفظ تطويريا من الرنا غير المكودة الصغيرة التي تقمع التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally عبر التفاعلات تسلسل معين مع 3'- المناطق غير مترجمة (UTRs) الأهداف مرنا وما شابه ذلك. ويقدر أن> 60٪ من من mRNAs يتم حفظها أهداف miRNAs 6. وتقع الجينات ميرنا في المناطق بين الجينات أو ضمن الإنترونات أو الإكسونات من البروتين / غير بروتين الترميز الجينات 7. وكتب هذه الجينات تفضيلي التي كتبها RNA البلمرة II إلى الوجاهةmiRNAs راي (PRI-miRNAs، عدة kilobases طويلة) أن شكل دبوس على شكل حلقة الجذعية الهياكل الثانوية. تتم معالجة هذه miRNAs الحزب الثوري المؤسسي، إلى miRNAs السلائف (ما قبل miRNAs، 60-75 النوكليوتيدات طويلة) التي يتم تصديرها إلى السيتوبلازم ومعالجتها الى مزيد من miRNAs ناضجة (18-25 النوكليوتيدات طويلة) 10/08. miRNAs تنظم العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك انتشار وتطوير والتمايز وموت الخلايا المبرمج 11. وتشير الدراسات إلى التقلبات على نطاق واسع ميرنا ملامح التعبير في مختلف الأورام الخبيثة الإنسان بما في ذلك سرطان البروستاتا 12-15. تم الإبلاغ عن ميرنا ملامح التعبير أن dysregulated على نطاق واسع في سرطان البروستاتا النقيلي الابتدائي و. وقد تم ربط تغير التعبير ميرنا مع تطور سرطان البروستاتا والعدوانية وتكرار تسليط الضوء على إمكانات النذير من miRNAs 12،14،16-19. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن miRNAs تلعب أدوارا مهمة في الآلية بدء سرطان البروستاتا، والتنمية والتقدمايون والانبثاث. عموما، miRNAs والمؤشرات الحيوية البديلة واعدة بالنسبة لتشخيص سرطان البروستات والتشخيص يمكن أن تميز بين الأنسجة الطبيعية والسرطان والمساعدة في التقسيم الطبقي للأورام البروستاتا 12 الناشئة. أيضا، miRNAs هي أهداف هامة لتطوير علاجات فعالة ضد سرطان البروستاتا 20.

ونظرا لصغر حجمها ومقاومة النشاط ريبونوكلياز الذاتية، miRNAs والمؤشرات الحيوية مستقرة يمكن أن يتم الكشف بسهولة في الأنسجة الثابتة الفورمالين 21 و في خزعات البروستاتا 22. وعلاوة على ذلك، تم مقارنة ملامح التعبير من miRNAs في الأنسجة المجمدة والفورمالين الثابتة وتم العثور على أن تكون بقوة المترابطة 21. ومع ذلك، ميرنا التعبير التنميط في الأنسجة السريرية سرطان البروستاتا غالبا ما تتحدى نظرا لعدم تجانس الورم، وأخطاء أخذ العينات، وتلوث انسجة الخ تطوير miRNAs والمؤشرات الحيوية فعالة لعلاج سرطان البروستاتا ريلى بشدةوفاق على كشف دقيق في الأنسجة السريرية. نحن هنا وصف سير عمل مبسطة المستخدمة في مختبرنا لميرنا التعبير التنميط في FFPE المؤرشفة أو سرطان البروستاتا المجمدة العينات السريرية جديدة. نحن توظيف مجموعة من الكمية في الوقت الحقيقي PCR والتهجين الموضعي لميرنا في تحليل العينات السريرية، مع السابقة العائد على مزيد من المعلومات الكمية وهذه الأخيرة لتصور التعبير التفاضلية من المؤشرات الحيوية ميرنا محتملة في مجموعة من الأنسجة. في هذا العمل، ونحن تحسين المنهجيات القائمة لميرنا الاستخراج من FFPE وأنسجة البروستاتا المجمدة، ويحلل التعبير TAQMAN مسبار استنادا ميرنا RT-PCR وميرنا الموقع تقنية التهجين في استخدام الحمض النووي مؤمن (LNA) المستندة تحقيقات 23. تحقيقات القائم على LNA تقديم المزيد من حساسية وخصوصية مقارنة DNA- أو RNA المرتبط تحقيقات مقرها وتمكن الكشف قوية من جميع متواليات ميرنا، بغض النظر عن محتوى GC وأيضا تسمح discriminaنشوئها الأسر ميرنا. يمكن تطبيقها لدينا الأمثل بروتوكول ميرنا ISH لسرطان البروستاتا شرائح الأنسجة أو ميكروأرس الأنسجة سرطان البروستاتا (TMA)، مع هذا الأخير تقدم القدرة على تسريع ميرنا اكتشاف العلامات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول عليها الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) أو عينات سرطان البروستاتا المثلج من SFVAMC. وكانت عينات من مرضى سرطان البروستاتا الذين خضعوا لاستئصال البروستاتا في SFVAMC. تم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من جميع المرضى وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة UCSF للبحوث الإنسان. بدلا من ذلك، تم شراؤها أنسجة سرطان البروستات ميكروأرس من مصادر تجارية وتستخدم لميرنا التحليلات التي ISH. تم جمع المعلومات إكلينيكية ومتابعة لمرضى سرطان البروستاتا تحليلها.

1. عينات الأنسجة

  1. قطع البروستاتا عينات الأنسجة السرطانية إلى 10 ميكرون المقاطع باستخدام مشراح وصمة عار مع H & E التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. مراجعة الشرائح الملون لتحديد البؤر البروستاتا السرطانية وكذلك المجاورة ظهارة غدي العادية.
    ملاحظة: لوحة شهادة الطبيب الشرعي أن يستعرض الشرائح H & E الملون وأماهRK للورم والمناطق الطبيعية. استخدام الشرائح وضعت الأدلة في الأقسام اللاحقة لميرنا تحليلات من ورم مقابل المناطق الطبيعية.

2. ميرنا التحليلات التعبير التي كتبها الكمي في الوقت الحقيقي PCR

ملاحظة: يتضمن هذا العمل الخطوات التالية: ليزر التقاط تسليخ مجهري، عزل الحمض النووي الريبي مجموع (بما في ذلك ميرنا ومرنا)، يعاير من miRNAs ناضجة باستخدام فحوصات التعبير TAQMAN الرنا الميكروي على النحو المفصل في الأقسام التالية.

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. عزل ميرنا من سرطان البروستاتا FFPE الأنسجة
      1. القبض على الليزر تسليخ مجهري (LCM)
        ملاحظة: تنفيذ الخطوات 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 في غطاء الدخان الكيميائي.
        1. إعداد الشرائح الأنسجة (10 ميكرون المقاطع) لLCM. Deparrafinize أقسام الأنسجة عن طريق نقع في الزيلين (2X)، لمدة 10 دقيقة لكل منهما، ثم ترطيب الأنسجة التي يحتضنها الشرائح لمدة 5 دقائق في كل من الإيثانول متدرج (100٪، 95٪، 90٪، 80٪، 70٪)، يليه المقطر ماء(5 دقائق).
        2. بعد الإماهة والأقسام وصمة عار مع الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية يليه الماء.
        3. الأنسجة مكان في الإيثانول متدرج (70٪، 95٪ 90٪، 80٪، 70٪) (5 دقائق لكل منهما) والزيلين (5 دقائق).
        4. الشرائح الجافة في غطاء الدخان ومن ثم تضع في الصك LCM لتسليخ مجهري.
        5. أداء microdissections مع نظام LCM وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 24. استخدام الطبيب الشرعي والذي تم ترميزه الشرائح كمرشدين لتحديد البؤر البروستاتا السرطانية وكذلك الأنسجة الطبيعية المجاورة. استخدام شعاع الليزر على 10-20 البقول قطرها ميكرون مع قوة من 70-90 ميغاواط.
        6. المناطق القبض على المصالح مع نبضات ليزر الأشعة تحت الحمراء على القبعات LCM. الجمع بين خلايا 2-5 مباراة دولية مع ميرنا استخراج كل عينة. لضمان سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج، وعلى الفور معالجة الخلايا والقبض لاستخراج ميرنا.
        7. بدلا من ذلك، الخلايا ليز في استخراج العازلة ميرنا (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) وستوإعادة لست] في -80 درجة مئوية.
      2. ميرنا استخراج وتحليلات من LCM Microdissected الأنسجة
        1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الأنسجة FFPE microdissected باستخدام طقم التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
          ملاحظة: العائد من الحمض النووي الريبي من القبض على الليزر miscrodissection منخفض عادة. لذلك، مزال RNA إلى كميات منخفضة (20-30 ميكرولتر) وتستخدم لتحديد ملامح التعبير باستخدام فحوصات التعبير TAQMAN الرنا الميكروي التالية تعليمات الشركة الصانعة (كما هو موضح في القسم 2.2). تعظيم الاستفادة من المدخلات RNA في الوقت الحقيقي الكشف PCR من miRNAs ناضجة تشير إلى أن 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مزال هو الأمثل لكل ميرنا محددة عكس رد الفعل النسخ. باعتبارها الرقابة الذاتية، ويستخدم RNU48 / RNU24. ردود فعل السيطرة، ويستخدم 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مزال للتفاعل النسخ العكسي.
    2. عزل ميرنا من سرطان البروستاتا الأنسجة المجمدة
      1. Homogenize أنسجة البروستاتا مقطوعة المجمدة عن طريق طحن الأنسجة في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة. نقل الأنسجة المتجانس لأنبوب microcentrifuge باستخدام ملعقة تبريده. الحفاظ على هاون / مدقة وملعقة في نفس درجة الحرارة عن طريق غمس في النيتروجين السائل الأنسجة متجانسة بحيث يمكن نقلها بسهولة.
      2. إضافة التجاري غوانيدين ثيوسيانات الفينول كاشف (1 مل / 0.1 غرام من الأنسجة) إلى الأنسجة المتجانس ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة المتجانس في غوانيدين التجاري ثيوسيانات الفينول كاشف في -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
      3. إضافة الكلوروفورم لجناسة (0.2 مل كلوروفورم / مل)، ويهز بقوة لمدة 30 ثانية. احتضان العينات في RT لمدة 3-5 دقيقة تليها الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. نقل المرحلة المائية العليا لمعقمة خالية من ريبونوكلياز أنبوب 1.5 مل الطازجة.
      5. إضافة حجم مساو من ايزوبروبيل. خلط واحتضان لمدة 10 ميلن في RT تليها الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية لتكوير RNA.
      6. نضح طاف ويغسل بيليه RNA مع 1 مل من الايثانول 70٪. الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      7. نضح بعناية طاف. الكريات RNA الجافة في RT لمدة 5-10 دقيقة. حل RNA في 50-100 ميكرولتر nuclease خالية من المياه.
      8. أداء الكمي من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل NanoDrop وتحديد سلامة الحمض النووي الريبي مع bioanalyzer. ضبط تركيزات RNA إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر. استخدام 10-50 نانوغرام RNA لmiRNA- رد فعل [كدنا محدد تليها في الوقت الحقيقي تحليلات PCR (القسم 2.2).
  2. PCR الكمي في الوقت الحقيقي لميرنا تحليلات التعبير
    ملاحظة: miRNAs ناضجة الفحص باستخدام خطوتين بروتوكول RT-PCR كما هو موضح أدناه.
    1. عكس النسخ (RT)
      1. عكس نسخ كدنا] من الحمض النووي الريبي باستخدام ميرنا مجموعة النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.استخدام 10-50 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع مع ميرنا التمهيدي محددة من الرنا الميكروي فحوصات وRT عدة. استخدام RNU48 / RNU24 / RNU6B والضوابط. تمييع [كدنا 1: من 5 إلى 1:10 (اعتمادا على وفرة من ميرنا تحليلها) واستخدامها في الوقت الحقيقي الكشف PCR كما هو موضح في الخطوة التالية.
    2. في الوقت الحقيقي PCR للكشف الناضجة ميرنا
      1. تضخيم المنتجات PCR من عينات كدنا] باستخدام فحوصات الرنا الميكروي مع مزيج الرئيسي العالمي السريع وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تطبيع عينات لRNU48 / RNU24 / تحكم RNU6B. استخدام المنهج المقارن ط م (دورة عتبة) لحساب التغيرات النسبية في التعبير الجيني على الصيام في الوقت الحقيقي نظام PCR. تحليل كل عينة في ثلاث نسخ.

تحليلات 3. ميرنا التعبير من قبل في الموقع التهجين (ISH)

  1. قبل معالجة الأنسجة
    1. قطع 5 ميكرون مقاطع من سرطان البروستاتا FFPE كتل الأنسجة باستخدام مشراح.
      2. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في RT لعدة أسابيع لميرنا التحليلات.
    2. Deparrafinize الأنسجة عن طريق نقع الشرائح مع الزيلين (2X)، لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    3. ترطيب الأنسجة التي يحتضنها الشرائح لمدة 5 دقائق في كل من الإيثانول متدرج (100٪ (2X)، 95٪، 90٪، 80٪، 70٪)، يليه الماء المقطر (5 دقائق).
    4. إصلاح الشرائح مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    5. تغسل الشرائح مع PBS (2X) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    6. علاج الشرائح مع 10 ميكروغرام / مل بروتين كاف في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في بروتين قبل تحسنت K العازلة (5 ملي تريس، HCL الرقم الهيدروجيني 7.4، 1 ملم EDTA، 1 ملي كلوريد الصوديوم).
    7. بعد العلاج بروتين-K، شطف الشرائح مع 0.2٪ الجلايسين في برنامج تلفزيوني لمدة 30 ثانية.
    8. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني (1X) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    9. إصلاح الشرائح مع 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
    10. الشرائح يشطفبرنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  2. تهجين
    1. قبل هجن الشرائح مع الحل قبل التهجين لمدة 3-4 ساعة عند 55 درجة مئوية في غرفة ترطيب. استخدام مناديل مختبر الأنسجة غارقة في 50٪ الفورماميد / 50٪ 5X SSC للحفاظ على ترطيب الغرفة.
    2. استخدام 5 "تحقيقات المسمى digoxigenin بتركيز 20-50 نانومتر في المخزن التهجين. تمييع التحقيق ميرنا محددة (20-50 نانومتر) والصغيرة RNA النووي السيطرة U6 التحقيق (20 نانومتر)، والحرارة على 90 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، وضعه على الجليد، وإضافة إلى جليد العازلة التهجين البارد (2-4 نانوغرام / ميكرولتر ).
    3. إزالة الحل قبل التهجين، إضافة حل التهجين (مسبار + العازلة التهجين، 100 ميكرولتر لكل شريحة)، واحتضان ل12-16 ساعة عند التحقيق الخاصة درجات الحرارة التهجين (درجة الحرارة التهجين = تيم التحقيق 21 درجة مئوية). أداء التهجين في غرفة ترطيب (50٪ الفورماميد / 50٪ 5X SSC).
  3. غسل خطوات
    1. تغسل الشرائح مع 2X SSC لمدة 10 دقيقة في 45 درجة مئوية.
    2. غسل رانه ينزلق مع SSC 1.5X لمدة 10 دقيقة في 45 درجة مئوية.
    3. تغسل الشرائح مع SSC 0.2x (2X) في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
    4. احتضان الشرائح مع حل 1X حجب لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة
  4. كشف
    1. احتضان الشرائح مع 1: 100 PBS المخفف AP-مترافق الأجسام المضادة لمكافحة digoxigenin ل4/1 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    2. تغسل الشرائح مع PBS (3X) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    3. تغسل الشرائح (2X) مع الفوسفاتيز القلوية العازلة (100 ملي تريس درجة الحموضة 9.5، 50 ملي MgCl 2، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ توين-20) في RT لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. احتضان الشرائح في BM الأرجواني AP الركيزة في الظلام في RT ل20/01 ساعة.
    5. شطف الشرائح مع PBS تحتوي على 0.1٪ توين-20 وغسل (2X) في الماء.
    6. جبل الشرائح باستخدام مائي سائل الإعلام التركيب و فحص تحت المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التنميط التعبير مير-203 في LCM سرطان البروستاتا الابتدائية العينات السريرية التي RT-PCR تحليل (الشكل 1)

RT-PCR تحليل النسبي التعبير مير-203 في LCM البروستاتا الابتدائية الأنسجة السرطان وأجريت المناطق الطبيعية المجاورة يقابل بها كما هو موضح في سيني وآخرون 15 RNU48 تم استخدامه كجهاز تحكم. ويلخص الجدول أدناه النسبي التعبير مير-203 في سرطان البروستاتا أنسجة الورم النسبية إلى الأنسجة الطبيعية المجاورة.

مقارنة مير 383 التعبير RT-PCR تحليل في microdissected مقابل القبض على الليزر microdissected الأنسجة PCA (الشكل 2)

تم أنسجة سرطان البروستات microdissected إما تحت المجهر أو تعرضوا لLCM تليها RT-PCR تحليلات مير 383 التعبير في أنسجة الورم النسبي ليقابل المجاور الطبيعي tissues.Relative مير 383 التعبير في عينات الأوراموكان يستخدم shown.RNU48 كمجموعة تحكم. كما هو مبين في الشكل 2، لوحظت اختلافات عندما تم تحليل ميرنا التعبير في هذه الأنسجة. LCM ديه ميزة على تسليخ مجهري تحت المجهر لأنها تتيح عزل السكان نقية نسبيا من أنسجة البروستاتا وأكثر موثوقية.

ISH تحليلات مير 203 التعبير في الأنسجة السريرية سرطان البروستاتا (الشكل 3)

في الموقع التهجين تحليلات مير 203 التعبير في أنسجة سرطان البروستات الطبيعية والعظام النقيلي تم تنفيذ كما هو موضح في سيني وآخرون تم استخدام 15 البروستات سرطان الأنسجة ميكروأري لISH التحليلات باستخدام 5'- المسمى DIG تحقيقات LNA محددة لمير 203 و U6. مثال ممثل ISH تحليلات هو مبين في الشكل (3)، وهو شخصية مستنسخة جزئيا من سايني وآخرون (2011) 15 الشكل 3A و 3B showsmiR-203 مورينداتاهيتيانونيسيون (يسار) والسيطرة U6 التعبير (يمين) في الأنسجة المشار إليها. وكانت إشارات ISH شبه كمي متدرج على أساس كثافة تلطيخ و٪ من الخلايا الملون وتعيينه على درجة من 1 إلى 4. عشرات كثافة مير 203 التعبير قسمت من قبل تلك U6 التعبير للحصول تطبيع مير-203 مستويات التعبير التي تم التخطيط في الشكل 3C.

الشكل 1
الشكل 1: التنميط التعبير مير-203 في LCM سرطان البروستاتا الابتدائية العينات السريرية التي RT-PCR تحليل. تحليل RT-PCR للالنسبي التعبير مير-203 في أنسجة سرطان البروستات وLCM المناطق الطبيعية المجاورة يقابل. وقد استخدم RNU48 كمجموعة تحكم. ويلخص الجدول أدناه النسبي التعبير مير-203 في أنسجة الورم سرطان البروستاتا قريبة الأنسجة الطبيعية المجاورة. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: مقارنة مير 383 التعبير RT-PCR تحليل في microdissected مقابل القبض على الليزر microdissected الأنسجة محكمة التحكيم الدائمة وأنسجة سرطان البروستاتا إما microdissected تحت المجهر أو تعرضوا لLCM تليها RT-PCR تحليلات مير 383 التعبير في. أنسجة الورم النسبية إلى الأنسجة الطبيعية المجاورة يقابل. واستخدمت النسبية مير 383 التعبير في عينات الورم shown.RNU48 كمجموعة تحكم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: ISH تحليلات مير 203 التعبير في الأنسجة السريرية سرطان البروستاتا وقد تم تعديل هذا الرقم من 15. تم تهجين الأنسجة مع DIG-ابيlled مقفل الحمض النووي (LNA) تحقيقات استنادا لمير 203 و U6 (مراقبة) كما هو موضح في 15. مثال ممثل تحليل ISH مير 203 التعبير (لوحات اليسار) والتعبير السيطرة U6 (لوحات اليمين) في سرطان البروستاتا النقيلي الإنسان أنسجة طبيعية والعظام عرض الموهن مير 203 التعبير في أنسجة العظام النقيلي. أمثلة ISH التمثيلية هو مبين في A في التكبير العالي (40X). النسبية مستويات التعبير مير-203 في أنسجة البروستاتا العادية والعظام البروستاتا النقيلي أنسجة السرطان وفقا لتقييم تحليل ISH. وسجل مير 203 التعبير، تطبيع عشرات U6 وتآمر. خط أفقي يمثل قيمة متوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نحن تصف سير العمل مبسط لميرنا التعبير التنميط في FFPE أرشفة أو سرطان البروستاتا المجمدة الأنسجة السريرية جديدة. في سرطان البروستاتا، وتشير العديد من الدراسات دورا هاما من microRNAs في سرطان البروستاتا بدء والتقدم وورم خبيث. ومع ذلك، غالبا ما يتم الحصول على نتائج متضاربة بشأن ميرنا محدد 22 منذ استخراج ميرنا ويحلل أساليب تختلف على نطاق واسع. وبالنظر إلى الأدلة الناشئة دعم إمكانية تطبيق miRNAs والمؤشرات الحيوية سرطان البروستاتا بديلة لتشخيص سرطان البروستات والتشخيص والعلاج، وهناك حاجة ل quantitate بدقة ميرنا ملامح التعبير في الأنسجة السريرية.

نحن توظيف مجموعة من الكمية في الوقت الحقيقي PCR والتهجين في الموقع لميرنا تحليلات سرطان البروستاتا العينات السريرية. في هذا العمل، ونحن الأمثل المنهجيات الحالية لاستخراج ميرنا وتحليلات التعبير طقالتمهيدي رجل تستند RT-PCR وISH التحليلات التي كتبها تحقيقات LNA. أثناء العمل كله، فإنه من الأهمية بمكان المحافظة على بيئة خالية ريبونوكلياز. جميع الكواشف / المحاليل المستخدمة يجب أن ريبونوكلياز حرة ويجب أن تستخدم بحذر شديد في التعامل مع RNA والكواشف الأخرى. يجب تعيين كل ردود الفعل في الوقت الحقيقي حتى على الجليد للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.

غالبا ما أعاق التنميط التعبير الدقيق في أنسجة سرطان البروستات عن طريق عدم التجانس وطبيعة متعددة البؤر الآفات سرطان البروستاتا 25. هذا يمكن التغلب عليها باستخدام تقنية الليزر microdisssection التقاط التي تسمح للفصل الخلايا الظهارية الحميدة والخبيثة ويقلل أيضا من التلوث اللحمية، مما يسمح التحليلات الجزيئية المصب دقيقة من أنسجة البروستات 22،25. نحن توظيف LCM الأنسجة FFPE المؤرشفة تليها ميرنا التعبير التنميط باستخدام TAQMAN الرنا الميكروي المقايسات التعبير التي ذكرت أنه يمكن التعويل عليها. وقد signif التنميط ميرنا الأنسجة LCMإمكانية icant لتعزيز ميرنا اكتشاف العلامات البيولوجية. في الواقع، هناك اهتماما كبيرا في تحليل الأنسجة FFPE بالنظر إلى أن هذه الأنسجة وتستخدم على نطاق واسع من قبل الأطباء للتحاليل الطبية، والمحافظة، والأرشفة، ومتاحة بسهولة 3. أيضا، نظرا لصغر حجمها ومقاومة النشاط ريبونوكلياز الذاتية، miRNAs هي أقل تأثرا نسبيا FFPE تدهور تعتمد وهي المؤشرات الحيوية المحتملة جذابة 3. تم الإبلاغ عن ملامح ميرنا التعبير من الأنسجة الفورمالين الثابتة لتكون مرتبطة بقوة لتلك الأنسجة المجمدة 21.

نحن العاملين ومقارنة مجموعتين التجارية المختلفة لميرنا الاستخراج من الأنسجة FFPE. في حين أن كلا مجموعات أسفرت RNA عالية الجودة لRT-PCR التحليلات، كنا واحد يستخدم، بروتوكول بسيط مبسط لتنقية متسقة من miRNAs ومجموع RNA من أنسجة FFPE.

النزاهة والنقاء وتركيز RNA شولد فحصها قبل تحليل RT-PCR. عينات تبين نسبة A260 / A230 منخفضة (<1.8) ينبغي إعادة عجل وإعادة تحليلها لنقاء قبل استخدام في رد فعل RT. أيضا، في الوقت الحقيقي PCR تحليل الأنسجة السريرية قد تحتاج إلى مزيد من الأمثل. دورة عتبة (القيم ط)> 33 تشير إلى التضخيم المنخفض يعكس قالب انطلاق كدنا] منخفضة. في هذه الحالة، كدنا] المدخلات قالب يمكن زيادة. أيضا، فإنه من الأهمية بمكان أن السيطرة الكافية يستخدم لتطبيع وتحديد quantifications ميرنا النسبية بين الأنسجة الطبيعية والسرطانية. يتم اختيار السيطرة الذاتية (RNU48 / RNU24 / RNU6B) على أساس توحيد إشارات التضخيم في وضعها الطبيعي مقابل عينات الورم.

أيضا، وصفنا بروتوكول الأمثل لميرنا ISH تحليل أنسجة سرطان البروستات بناء على تحقيقات استنادا LNA-. يمكن تطبيقها لدينا الأمثل بروتوكول ميرنا ISH إلى شرائح الأنسجة سرطان البروستاتا أو ميكروأرس الأنسجة سرطان البروستاتا (TMA)، مع الطرح الأخير هو قويالاتحاد العالمي للتعليم لتسريع ميرنا اكتشاف العلامات البيولوجية. ويمكن أيضا أن تطبق هذا البروتوكول لأنواع الأنسجة الأخرى. ومع ذلك، قد تحتاج مدة proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment أن يكون الأمثل. بروتين K الهضم يسمح التحقيق ميرنا للوصول الى خلايا حين أن هناك حاجة لامتصاص العرق تثبيت لمنع فقدان ميرنا التالية permeabilization. تم تحسين هذا البروتوكول، وضعت أصلا للاستخدام مع تحقيقات LNA 26 للحصول على إشارة معينة مع الحد الأدنى من الخلفية في أنسجة البروستاتا. يتم تحسين تركيز التحقيق وشروط الحضانة لأنسجة سرطان البروستات. نحن توظيف 5'digoxigeninlabeledprobes بتركيز 20-50 نانومتر وهذا يتوقف على وفرة من ميرنا. ومع ذلك، 3'digoxigeninlabeledprobes والمزدوج المسمى (5 'و 3') المسمى تحقيقات يمكن أن تكون بديلا. في الواقع، تحقيقات المسمى مزدوجة توفر إمكانات التنمية اللونية أفضل للكشف عن الرنا الميكروي وينصح لوفرة منخفضة الكشف ميرنا. أيضا، قد يكون الأمثل مدة الحجب والأجسام المضادة حضانات. ويوصى تعد تسد لانخفاض الخلفية، لا سيما مع miRNAs فرة منخفضة. يجب أن تراقب عن كثب Thedurationofcolor رد فعل مع BM الركيزة الأرجواني. يمكن حضانات أطول توليد تلوين الخلفية. عادة، miRNAs وفيرة تتطلب حضانات أقصر (02/01 ساعة)، في حين تم الكشف عن أقل وفرة ميرنا مع حضانات أطول. خلال ISH، من المهم للتأكد من أن أقسام الأنسجة لا تجف خلال أي من الخطوات لأن هذا قد يؤدي إلى القطع الأثرية تلطيخ.

في الختام، على الرغم من العديد من الدراسات تشير miRNAs والمؤشرات الحيوية الهامة سرطان البروستاتا، وغالبا ما تناقش أهمية العديد من هذه الدراسات نظرا لنتائج متضاربة. نحن هنا قد حددت سير عمل الأمثل لدقة التعبير ميرنا ويحلل في سرطان البروستاتا العينات السريرية التي لديها القدرة على تسريع اكتشاف ميرنا والمؤشرات الحيوية لسرطان البروستاتا. بينماهذا العمل لديها امكانات كبيرة إلى الملف الشخصي بدقة التعبير ميرنا في الأنسجة السريرية سرطان البروستاتا، وهناك قيود المتأصلة في التقنيات المستخدمة. قد يكون miRNAs وفيرة منخفضة من الصعب للصفحة الشخصية مع الأمثل ميرنا RT-PCR وISH التحليلات الموصوفة هنا. على الرغم RT-PCR التنميط استنادا لديه مجموعة ديناميكية أوسع من ISH 27،28، كميات RNA المنخفضة التي تم الحصول عليها من LCM قد تحد من الكشف عن miRNAs وفيرة منخفضة. كشف أساس ISH من miRNAs يعطي معلومات المكانية القوية، ولكن حدوده وأنه هو أسلوب شبه الكمية مع مجموعة ديناميكية أقل 28. وتعتمد هذه التقنية على حساسية وخصوصية تحقيقات المستخدمة وأيضا على تعظيم الاستفادة من الظروف لالتهجين والكشف عن miRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الدكتور روجر إريكسون لدعمه والمساعدة في إعداد المخطوط.

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان في المعاهد الوطنية للصحة

(منحة رقم RO1CA177984؛ RO1CA138642)، ومشروع برنامج VA على سرطان البروستاتا (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Tags

الطب، العدد 103، MicroRNAs وسرطان البروستاتا والأنسجة السريرية والتحاليل التعبير، في الوقت الحقيقي PCR،
ميرنا تحليلات التعبير في سرطان البروستاتا الأنسجة السريرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter