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Medicine

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

Una sfida importante nel cancro della prostata (PCa) gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza di biomarcatori attualmente utilizzati per lo screening delle malattie, la diagnosi, la prognosi e il trattamento. Negli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi. Tuttavia, lo sviluppo di miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata si basa molto sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. miRNA analisi nel cancro alla prostata campioni clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un flusso di lavoro semplificato per miRNA analizza FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi utilizzando una combinazione di quantitativa real-time PCR (RT-PCR) e ibridazione in situ (ISH). All'interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA da FFPE e congelato tissu prostataes e espressione analisi da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR. Inoltre, si descrive un metodo ottimizzato per ISH analizza il rilevamento formiRNA in tessuti prostatici con acido nucleico bloccato (LNA) - sonde based. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA).

Introduction

Il cancro della prostata è un tumore maligno maschio comunemente diagnosticato che è una delle principali cause di mortalità per cancro correlati tra gli uomini. Negli Stati Uniti, si stima che 220,800 nuovi casi e 27.540 decessi saranno presentate nel 2015 1.

Il cancro della prostata è una malattia eterogenea con malattia molto variabile corso- tumori possono essere indolenti o molto aggressivo. Una sfida importante nel cancro della prostata gestione clinica è rappresentata dal inadeguatezza dei metodi attualmente in uso / biomarcatori per lo screening della malattia, la diagnosi, la prognosi e il trattamento 2. Metodi di screening attuali includono l'antigene prostatico specifico (PSA) e un esame rettale digitale (DRE) seguito da biopsie prostatiche 3. Antigene prostatico specifico (PSA) è il biomarcatore cancro alla prostata più diffuso che ha rivoluzionato in modo significativo la gestione clinica e miglioramento dei tassi di sopravvivenza 4. Tuttavia, a causa dei limiti intrinseci di PSA compreso lack di specificità, screening di PSA-ha causato oltre diagnosi e sopra il trattamento della malattia. In considerazione di ciò, intensi sforzi sono orientati verso la ricerca di alternative biomarcatori del cancro alla prostata, in particolare quelli che possono prevedere l'aggressività della malattia e guidare le decisioni terapeutiche migliori 4,5. Nel corso degli ultimi anni, microRNA (miRNA) sono emersi come promettenti alternative biomarcatori del cancro alla prostata.

I microRNA (miRNA) costituiscono una classe evolutivamente conservata di piccoli RNA non codificanti che sopprimono l'espressione genica livello post-trascrizionale tramite interazioni sequenza-specifiche con le regioni 3'non tradotte (UTR) del target mRNA affini. Si stima che il> 60% di mRNA sono conservate bersagli di miRNA 6. geni miRNA sono localizzati nelle regioni intergeniche o all'interno introni o esoni di proteine ​​/ non-codificanti proteine ​​geni 7. Questi geni sono preferenzialmente trascritti dalla RNA polimerasi II in primamiRNA ry (pri-miRNA, lunga diversi kilobasi) che ad anello a forma di gambo strutture secondarie forma a gomito. Questi pri-miRNA vengono trasformati in miRNA precursori (pre-miRNA, lungo 60-75 nucleotidi) che vengono esportati al citoplasma e successivamente trattati in miRNA maturi (lunghi 18-25 nucleotidi) 8-10. miRNA regolano processi cellulari chiave, tra cui la proliferazione, lo sviluppo, la differenziazione e l'apoptosi 11. Gli studi suggeriscono una disregolazione diffuso di profili di espressione dei miRNA in diversi tumori umani tra cui il cancro alla prostata 12-15. Sono stati riportati i profili di espressione di miRNA ad essere ampiamente disregolazione nel cancro della prostata primari e metastatici. MiRNA Altered sono stati collegati con la progressione del cancro alla prostata, l'aggressività e la ricorrenza mettendo in evidenza il potenziale prognostico di miRNA 12,14,16-19. Un crescente corpo di evidenze indicano che i miRNA svolgono ruoli importanti meccanicistici nell'iniziazione cancro alla prostata, lo sviluppo, il progressoioni e metastasi. Nel complesso, miRNA stanno emergendo come biomarcatori alternativi promettenti per la diagnosi del cancro alla prostata e la prognosi in grado di distinguere tra tessuti e gli aiuti normali e tumorali nella stratificazione di tumori della prostata 12. Inoltre, miRNA sono obiettivi importanti per lo sviluppo di terapie efficaci contro il cancro alla prostata 20.

A causa delle loro piccole dimensioni e la resistenza all'attività RNasi endogena, miRNA sono biomarcatori stabili che possono essere facilmente rilevati nei tessuti fissati in formalina 21 e 22 biopsie prostatiche. Inoltre, i profili di espressione di miRNA sono stati confrontati in tessuti congelati e fissati in formalina e sono stati trovati per essere fortemente correlato 21. Tuttavia, miRNA profiling in cancro alla prostata tessuti clinici è spesso difficile a causa della eterogeneità del tumore, gli errori di campionamento, contaminazione stromale ecc Lo sviluppo dei miRNA come biomarcatori efficaci per il cancro alla prostata pesantemente relies sul loro rilevamento accurato nei tessuti clinici. Qui si descrive un flusso di lavoro semplificato utilizzato nel nostro laboratorio per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato campioni clinici freschi. Ci avvaliamo di una combinazione di quantitativa real-time PCR e ibridizzazione in situ per miRNA le analisi di campioni clinici, con l'ex producendo maggiori informazioni quantitative e la seconda per visualizzare l'espressione differenziale delle potenziali biomarcatori miRNA in una vasta gamma di tessuti. All'interno di questo flusso di lavoro, ottimizziamo le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA da FFPE e tessuti della prostata congelati, espressione analizza da Taqman-sonda basato miRNA RT-PCR e miRNA in situ tecnica di ibridazione con acido nucleico bloccato (LNA) -based sonde 23. Sonde basato LNA-offrono una maggiore sensibilità e specificità rispetto al DNA o RNA sonde based e consente il rilevamento affidabile di tutte le sequenze di miRNA, indipendentemente dal loro contenuto GC e permettono anche discriminazione delle famiglie miRNA. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive di cancro alla prostata di tessuto o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA), con quest'ultimo che offre il potenziale di accelerare miRNA biomarcatore scoperta.

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Protocol

Campioni freschi cancro alla prostata congelato fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o sono stati ottenuti dalla SFVAMC. Campioni di pazienti con cancro alla prostata sottoposti a prostatectomia radicale a SFVAMC. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti e lo studio è stato approvato dal Comitato UCSF per la ricerca umana. In alternativa, tessuti di cancro alla prostata microarray sono stati acquistati da fonti commerciali e utilizzati per le analisi da miRNA ISH. Informazioni clinicopatologica e follow-up per i pazienti affetti da cancro alla prostata analizzati sono stati raccolti.

1. I campioni di tessuto

  1. Tagliare campioni di tessuto del cancro della prostata in 10 sezioni micron utilizzando un microtomo e macchia con H & E seguendo il protocollo del produttore.
  2. Commenta vetrini colorati per l'identificazione del cancro alla prostata foci così come adiacente normale epitelio ghiandolare.
    Nota: Una scheda certificata patologo dovrebbe rivedere le diapositive H & E macchiato e mark per tumore e aree normali. Utilizzare le diapositive contrassegnate come guide in successive sezioni per miRNA analisi da tumore vs aree normali.

2. Le analisi di espressione di miRNA Quantitative Real-time PCR

Nota: Questo flusso di lavoro prevede le seguenti fasi: cattura microdissezione laser, isolamento di RNA totale (compresi i miRNA e mRNA), il saggio dei miRNA maturi utilizzando i saggi di espressione TaqMan MicroRNA come dettagliato nelle sezioni seguenti.

  1. RNA Estrazione
    1. Isolamento di miRNA da cancro della prostata FFPE tessuti
      1. Microdissezione laser (LCM)
        Nota: Eseguire i passi 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in una cappa.
        1. Preparare vetrini di tessuto (10 sezioni micron) per LCM. Deparrafinize sezioni di tessuto di immersione in xilene (2x), per 10 minuti ciascuno, quindi reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguita da distillata acqua(5 minuti).
        2. A seguito di reidratazione, sezioni macchia con ematossilina per 30 secondi seguiti da acqua.
        3. Inserire tessuti in etanolo graduata (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min ciascuna) e xilene (5 min).
        4. Scivoli asciutti in una cappa aspirante e quindi inserire nello strumento LCM per microdissezione.
        5. Eseguire microdissections con il sistema LCM conformemente alle istruzioni del produttore 24. Usa patologo marcato diapositive come guide per l'identificazione di cancro alla prostata foci così come il tessuto normale adiacente. Utilizzare il raggio laser ad una 10-20 impulsi diametro micron con una potenza di 70-90 mW.
        6. Cattura aree di interesse con impulsi laser infrarossi sui tappi LCM. Combina le celle da 2-5 tappi per l'estrazione di miRNA per campione. Per garantire l'integrità di RNA estratto, immediatamente elaborare cellule catturate per l'estrazione miRNA.
        7. In alternativa, le cellule Lisare nel buffer di estrazione miRNA (secondo il protocollo del produttore) e store lisati a -80 ° C.
      2. miRNA Estrazione e analisi da LCM microdissezione tessuti
        1. Estratto RNA totale da tessuti FFPE microdissezione utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore.
          Nota: La resa di RNA da cattura laser miscrodissection è tipicamente basso. Pertanto, l'RNA viene eluito in volumi bassi (20-30 mL) e utilizzato per la profilazione espressione utilizzando Taqman microRNA saggi di espressione seguito le istruzioni del produttore (anche descritto nella sezione 2.2). Ottimizzazione di ingresso dell'RNA per PCR real time il rilevamento dei miRNA maturi suggerisce che 5 ml di RNA eluizione è ottimale per ogni reazione di trascrizione inversa specifici miRNA-. Come un controllo endogeno, è usato RNU48 / RNU24. Per le reazioni di controllo, 2 microlitri del RNA eluito viene utilizzato per la reazione di trascrizione inversa.
    2. Isolamento di miRNA da cancro della prostata congelati tessuti
      1. Omogenize congelati tessuti della prostata resezione dalla macinazione dei tessuti in azoto liquido con un mortaio e pestello. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta con una spatola raffreddato. Mantenere la malta / pestello e spatola alla stessa temperatura per immersione in azoto liquido tessuto omogeneizzato così può essere facilmente trasferiti.
      2. Aggiungere guanidina isotiocianato-fenolo commerciale reagente (1 ml / 0,1 g di tessuto) al tessuto omogeneizzato ed incubare a temperatura ambiente per 5 min.
        Nota: i tessuti omogeneizzate della guanidina commerciale isotiocianato-fenolo reagente possono essere conservati a -80 ° C per diversi mesi.
      3. Aggiungere cloroformio per l'omogeneizzato (0,2 ml di cloroformio / ml) e si agita energicamente per 30 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 3-5 min seguita da centrifugazione a 10.000 xg per 20 min a 4 ° C.
      4. Trasferire la fase acquosa superiore ad una provetta sterile da 1,5 ml fresco RNasi-free.
      5. Aggiungere un volume uguale di alcool isopropilico. Mescolare e incubare per 10 min a RT seguita da centrifugazione a 12.000 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il RNA.
      6. Aspirare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 70%. Centrifugare a 12,000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
      7. Con attenzione aspirare il surnatante. Pellet di RNA a secco a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Sciogliere RNA in 50-100 acqua priva di nucleasi microlitri.
      8. Eseguire la quantificazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e determinare l'integrità dell'RNA con un bioanalizzatore. Regolare le concentrazioni di RNA a 10 ng / ml. Utilizzare 10-50 ng RNA per miRNA- reazione cDNA specifico seguito da PCR in tempo reale le analisi (paragrafo 2.2).
  2. PCR quantitativa in tempo reale per miRNA analisi di espressione
    Nota: miRNA maturi Assay utilizzando un protocollo RT-PCR in due fasi come descritto sotto.
    1. Reverse trascrizione (RT)
      1. Reverse trascrivere cDNA da RNA utilizzando un kit di trascrizione inversa miRNA in conformità con le istruzioni del produttore.Utilizzare 10-50 ng di RNA totale con miRNA primer specifico dal kit MicroRNA Assays e RT. Utilizzare RNU48 / RNU24 / RNU6B come controlli. Diluire cDNA 1: 5 a 1:10 (seconda dall'abbondanza del miRNA analizzati) e utilizzare in tempo reale di rilevamento PCR come descritto nel passaggio seguente.
    2. Real-time PCR per il rilevamento di miRNA maturo
      1. Amplifica prodotti di PCR di campioni di cDNA utilizzando i saggi MicroRNA con una master mix universale veloce secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare campioni a RNU48 / RNU24 / controllo RNU6B. Utilizzare il metodo comparativo Ct (ciclo soglia) per calcolare le relative variazioni nell'espressione genica su Fast Real Time PCR sistema. Analizzare ogni campione in triplicato.

Analisi 3. miRNA Espressione di ibridazione in situ (ISH)

  1. Pre-trattamento dei tessuti
    1. Tagliare 5 sezioni micron da blocchi di tessuto di cancro alla prostata FFPE utilizzando un microtomo.
      2. Nota: Le diapositive possono essere conservati a temperatura ambiente per diverse settimane per miRNA analisi.
    2. Deparrafinize tessuti immergendo i vetrini con xilene (2x), per 15 minuti ciascuno.
    3. Reidratare i tessuti incubando i vetrini per 5 minuti ciascuna in etanolo graduata (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguito da acqua distillata (5 min).
    4. Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS a temperatura ambiente per 20 min.
    5. Lavare i vetrini con PBS (2x) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna.
    6. Trattare i vetrini con 10 ug / ml proteinasi K a 37 ° C per 10 min in proteinasi pre-riscaldato tampone K (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl).
    7. Dopo il trattamento proteinasi-K, sciacquare i vetrini con lo 0,2% glicina in PBS per 30 sec.
    8. Lavare i vetrini in PBS (1x) a temperatura ambiente per 5 min.
    9. Fissare i vetrini con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min.
    10. Sciacquare i vetrini conPBS per 5 min.
  2. Ibridazione
    1. Pre-ibridare i vetrini con soluzione pre-ibridazione per 3-4 ore a 55 ° C in una camera umidificata. Utilizzare tessuto salviettine imbevute di laboratorio nel 50% formammide / 50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata.
    2. Utilizzare 5 'sonde marcate con digossigenina ad una concentrazione di 20-50 nM in tampone di ibridazione. Diluire sonda specifica per miRNA (20-50 nM) e una piccola sonda di controllo U6 RNA nucleare (20 nM), calore a 90 ° C per 4 minuti, posizionarlo su ghiaccio, e aggiungere al ghiaccio tampone di ibridazione freddo (2-4 ng / ml ).
    3. Rimuovere la soluzione pre-ibridazione, aggiungere soluzione di ibridazione (sonda + tampone di ibridazione, 100 ml per vetrino), incubare per 12-16 ore a temperatura di ibridazione specifica sonda (temperatura di ibridazione = sonda-Tm 21 ° C). Eseguire ibridazioni in una camera umidificata (50% formammide / 50% 5x SSC).
  3. Lavaggio Steps
    1. Lavare i vetrini con 2x SSC per 10 minuti a 45 ° C.
    2. Lavare tscivola con 1,5x SSC per 10 minuti a 45 ° C.
    3. Lavare i vetrini con 0.2x SSC (2x) a 37 ° C per 20 minuti ciascuno.
    4. Incubare i vetrini con la soluzione 1x di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente
  4. Rilevamento
    1. Incubare i vetrini con 1: 100 PBS diluito anticorpo anti-digossigenina AP-coniugato per 1-4 ore o una notte a 4 ° C.
    2. Lavare i vetrini con PBS (3x) a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno.
    3. Lavare le diapositive (2x) con fosfatasi alcalina tampone (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna.
    4. Incubare i vetrini in substrato BM Viola AP al buio a temperatura ambiente per 1-20 ore.
    5. Risciacquare i vetrini con PBS contenente 0,1% di Tween-20 e lavaggio (2x) in acqua.
    6. Montare le diapositive utilizzando un mezzo di montaggio acquoso ed esaminare al microscopio.

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Representative Results

Profilo di espressione di miR-203 nel cancro della prostata primario LCM campioni clinici mediante RT-PCR analisi (Figura 1)

RT-PCR analisi di espressione relativa miR-203 in LCM prostata primaria tessuti tumorali e le regioni adiacenti normali appaiati è stata effettuata come descritto in Saini et al. 15 RNU48 è stato utilizzato come controllo. La tabella seguente riassume l'espressione relativa miR-203 nei tessuti tumorali del cancro alla prostata rispetto ai tessuti adiacenti normali.

Confronto di espressione miR-383 mediante RT-PCR analisi in microdissezione vs cattura laser in paraffina tessuti PCA (Figura 2)

Tessuti del cancro della prostata sono stati né microdissezionate sotto il microscopio o sono stati sottoposti a LCM seguita da RT-PCR analisi di miR-383 espressione nei tessuti tumorali rispetto al corrispondente normale adiacente-383 miR espressione tissues.Relative in campioni di tumoresono shown.RNU48 è stato utilizzato come controllo. Come mostrato in figura 2, sono state osservate differenze quando miRNA è stata analizzata in questi tessuti. LCM ha un vantaggio rispetto microdissezione sotto il microscopio in quanto permette l'isolamento di una popolazione relativamente puro dei tessuti della prostata ed è più affidabile.

ISH analisi di espressione di miR-203 nel carcinoma della prostata tessuti cliniche (Figura 3)

Ibridazione in situ analisi di espressione di miR-203 nei tessuti normali e ossa della prostata metastatico cancro è stata effettuata come descritto nella Saini et al. 15 della prostata tessuto microarray cancro è stato utilizzato per ISH analisi utilizzando 5'-DIG etichettato sonde LNA specifici per miR-203 e U6. Esempio rappresentativo di ISH analisi è mostrato in figura 3, una figura parzialmente riprodotto da Saini et al. (2011) 15 Figura 3A e 3B showsmiR-203 expressione (a sinistra) e l'espressione di controllo U6 (a destra) nei tessuti indicati. Segnali ISH erano semi-quantitativamente classificato in base all'intensità della colorazione e percentuale di cellule colorate e assegnato un punteggio di 1 a 4. punteggi di intensità di miR-203 espressione sono stati divisi da quelli di espressione U6 per ottenere normalizzati miR-203 livelli di espressione che sono stati tracciati in Figura 3C.

Figura 1
Figura 1: profilo di espressione di miR-203 nel cancro della prostata primario LCM campioni clinici mediante RT-PCR analisi. RT-PCR di espressione relativa miR-203 nei tessuti tumorali LCM-prostata e delle regioni limitrofe normali appaiati. RNU48 è stato utilizzato come controllo. La tabella seguente riassume l'espressione relativa miR-203 nei tessuti tumorali del cancro alla prostata rispetto ai tessuti adiacenti normali. Cliccate quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Confronto di miR-383 espressione mediante RT-PCR analisi in microdissezione vs cattura laser in paraffina tessuti PCa tessuti cancerosi della prostata erano o microdissezionate sotto il microscopio o sono stati sottoposti a LCM seguita da RT-PCR analisi di miR-383 espressione. tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali adiacenti abbinati. Relativi miR-383 espressioni campioni tumorali sono shown.RNU48 è stato utilizzato come controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. ISH analisi di espressione di miR-203 nel cancro della prostata tessuti clinici Questa cifra è stata modificata da 15. I tessuti sono stati ibridati con DIG-Labeacido nucleico riempito bloccato (LNA) per sonde basate mir-203 e U6 (controllo), come descritto in 15. Esempio rappresentativo di analisi ISH di espressione di miR-203 (pannelli a sinistra) e l'espressione di controllo U6 (pannelli di destra) nel cancro alla prostata umano normale e ossei metastatici tessuti mostrando attenuato miR-203 espressione nei tessuti ossei metastatici. Esempi ISH Rappresentante mostrati in A con un ingrandimento maggiore (40X). Relativi livelli di espressione di miR-203 nei tessuti della prostata normale e prostata metastatico tessuti tumorali ossee come valutati mediante analisi di ISH. espressione di miR-203 è stato segnato, normalizzato ai punteggi U6 e tracciati. Linea orizzontale rappresenta il valore medio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo articolo, si descrive un flusso di lavoro semplificato per miRNA profilatura in FFPE archiviati o cancro alla prostata congelato tessuti clinici freschi. Nel cancro della prostata, diversi studi suggeriscono un ruolo importante dei microRNA nel cancro alla prostata iniziazione, la progressione e la metastasi. Tuttavia, risultati contrastanti sono spesso ottenuti su uno specifico miRNA 22 in quanto l'estrazione miRNA e analisi metodi differiscono ampiamente. In considerazione degli elementi di prova emergente a sostegno della potenziale applicazione dei miRNA come biomarcatori del cancro alla prostata alternative per la prognosi del cancro alla prostata, diagnosi e terapia, vi è la necessità di quantificare con precisione i profili di espressione dei miRNA nei tessuti clinici.

Ci avvaliamo di una combinazione di quantitativa real-time PCR e ibridizzazione in situ per miRNA analisi del cancro alla prostata campioni clinici. All'interno di questo flusso di lavoro, abbiamo ottimizzato le metodologie esistenti per l'estrazione miRNA, espressione analisi per Taquomo primer a base RT-PCR e ISH analisi con sonde LNA. Durante l'intero flusso di lavoro, è della massima importanza per mantenere un ambiente privo di RNasi. Tutti i reagenti / soluzioni utilizzate devono essere RNAse gratuito e cautela devono essere utilizzati nella gestione di RNA e altri reagenti. Tutte le reazioni in tempo reale dovrebbero essere istituiti in ghiaccio per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.

Accurate profili di espressione nei tessuti tumorali della prostata è spesso ostacolata dalla eterogeneità e della natura multifocale delle lesioni tumorali della prostata 25. Questo può essere superato utilizzando una tecnica microdisssection laser cattura che permette la separazione delle cellule epiteliali benigne e maligne e riduce anche la contaminazione stromale, consentendo accurate analisi molecolari a valle di tessuti della prostata 22,25. Ci avvaliamo di LCM di tessuti archiviati FFPE seguiti da miRNA profiling utilizzando Taqman MicroRNA saggi di espressione che è stato segnalato per essere affidabile. miRNA profilazione dei tessuti LCM ha signifpotenziale cative per migliorare miRNA biomarcatore scoperta. In realtà, vi è un notevole interesse per l'analisi dei tessuti FFPE considerando che questi tessuti sono ampiamente utilizzati dai patologi per analisi cliniche, conservazione e archiviazione e sono immediatamente disponibili 3. Inoltre, per la loro piccola dimensione e la resistenza all'attività RNasi endogena, miRNA sono relativamente meno colpiti dalla FFPE degradazione dipendente e sono interessanti potenziali biomarcatori 3. Sono stati riportati i profili di espressione dei miRNA di fissati in formalina tessuti da fortemente correlato a quelli di tessuti congelati 21.

Abbiamo impiegato e confrontato due diversi kit commerciali per l'estrazione miRNA dai tessuti FFPE. Mentre entrambi i kit hanno prodotto RNA di alta qualità per RT-PCR analisi, abbiamo usato quello che utilizza un semplice, protocollo semplificato per la purificazione costante dei miRNA e RNA totale da tessuti FFPE.

Integrità, la purezza e la concentrazione di RNA Should essere testato prima di RT-PCR analisi. I campioni con basso rapporto A260 / A230 (<1,8) deve essere nuovamente precipitate e ri-analizzati per la purezza prima di utilizzarlo in una reazione di RT. Inoltre, real-time PCR analisi dei tessuti clinici potrebbero dover essere ulteriormente ottimizzato. Ciclo soglia (valori Ct)> 33 indicano bassa amplificazione riflettendo basso cDNA di partenza. In questo caso, gli ingressi cDNA possono essere aumentati. Inoltre, è della massima importanza che un adeguato controllo è usato per normalizzare e determinare quantificazioni miRNA relativi tra tessuti normali e tumorali. Controllo endogeno (RNU48 / RNU24 / RNU6B) viene scelta in base alla uniformità dei segnali di amplificazione in normale vs campioni tumorali.

Inoltre, si descrive un protocollo ottimizzato per miRNA ISH analisi di tessuti tumorali della prostata basate su sonde basate LNA-. Il nostro protocollo miRNA ISH ottimizzato può essere applicato alle diapositive dei tessuti cancro alla prostata o microarray di tessuti di cancro alla prostata (TMA), con quest'ultimo che offre il potenteial per accelerare miRNA biomarcatore scoperta. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto. Tuttavia, la durata di proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment può avere bisogno di essere ottimizzato. Proteinase K digestione permette alla sonda di miRNA per arrivare all'interno delle cellule, mentre è necessaria la fissazione paraformaldeide per prevenire la perdita miRNA dopo permeabilizzazione. Questo protocollo, originariamente sviluppato per l'uso con le sonde LNA 26 è ottimizzato per ottenere un segnale specifico con sfondo minimale nei tessuti della prostata. Le concentrazioni sonda e condizioni di incubazione sono ottimizzati per i tessuti di cancro alla prostata. Ci avvaliamo di 5'digoxigeninlabeledprobes ad una concentrazione di 20-50 nM a seconda della ricchezza di miRNA. Tuttavia, 3'digoxigeninlabeledprobes e doppio etichettati (5 'e 3') etichettati sonde possono essere sostituiti. In realtà, dual sonde marcate offrono il potenziale per un migliore sviluppo colorimetrico per la rilevazione di microRNA e sono raccomandati per bassa abbondanza rilevamento miRNA. Inoltre, la durata del blocco e anticorpi incubazione può essere ottimizzato. Più il blocco è consigliato per sfondo più bassa, in particolare con basse miRNA abbondanza. Thedurationofcolor reazione con il substrato BM viola deve essere attentamente monitorato. Incubazioni più lunghe possono generare la colorazione di fondo. Di solito, miRNA abbondanti richiedono incubazione più brevi (1-2 h), mentre meno abbondanti miRNA vengono rilevati con incubazione più lunghi. Durante ISH, è importante garantire che le sezioni di tessuto non asciugare durante una qualsiasi delle fasi in quanto ciò può portare ad artefatti di colorazione.

In conclusione, anche se alcuni studi suggeriscono miRNA come importanti biomarcatori del cancro alla prostata, il significato di alcuni di questi studi è spesso discusso a causa di risultati contrastanti. Qui abbiamo definito un flusso di lavoro ottimizzato per miRNA accurata analisi nel cancro alla prostata campioni clinici che hanno un potenziale per accelerare la scoperta di miRNA come biomarcatori per il cancro alla prostata. Mentrequesto flusso di lavoro ha un potenziale significativo di espressione con precisione il profilo di miRNA nel cancro alla prostata tessuti clinici, ci sono limitazioni intrinseche delle tecniche impiegate. Basso miRNA abbondanti possono essere difficili al profilo con l'ottimizzato miRNA RT-PCR e ISH analisi descritto qui. Sebbene RT-PCR profilazione basato ha una gamma dinamica più ampia di ISH 27,28, quantità di RNA bassi ottenuti da LCM possono limitare il rilevamento di bassi miRNA abbondanti. Rilevamento basato ISH di miRNA produce informazioni spaziali potente, tuttavia i suoi limiti sono che è una tecnica semiquantitativa con una gamma dinamica minore 28. Questa tecnica si basa sulla sensibilità e specificità delle sonde impiegate e anche l'ottimizzazione delle condizioni di ibridazione e rivelazione di miRNA.

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Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Roger Erickson per il suo sostegno e assistenza alla preparazione del manoscritto.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute presso il National Institutes of Health

(Grant Numero RO1CA177984, RO1CA138642), progetto del programma VA sul cancro alla prostata (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

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References

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Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche
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Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

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