Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

לירולוגים RNA, כניסתו של טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי בשנתי ה -1970 המאוחרות שאפשר להמיר את הגנום רנ"א נגיפי לשיבוטי cDNA, אשר לאחר מכן יכול להיות מופץ כפלסמידים בחיידקים למניפולציה הגנטית של נגיפי RNA. 1 להיות וירוס RNA הראשון מולקולרי המשובטים היה Qβ bacteriophage, וירוס RNA חיובי גדיל שמדביק coli Escherichia. פלסמיד המכיל עותק cDNA מלא של RNA הגנומי Qβ הוליד פאגים Qβ זיהומיות כאשר הציג לE. coli. 2 זמן קצר לאחר מכן, בטכניקה זו יושמה לנגיף פוליו, נגיף RNA חיובי גדיל של בני אדם ובעלי חיים. פלסמיד הנושא cDNA באורך מלא של RNA הגנומי נגיף הפוליו היה מידבק כאשר transfected לתאי יונקים ומסוגלים לייצר virions זיהומיות 3 בזה גישה "שהושק ה- DNA", צריך להיות עיבד cDNAs המשובט intracellularly ליזום שכפול רנ"א נגיפי.;עם זאת, לא ברור כיצד השעתוק הוא יזם ואיך התמלילים מעובדים לרצף הנגיפי הנכון. חשש זה הוביל לפיתוח של חלופה "שהושק RNA" גישה, לפיה עותק cDNA מלא של הגנום רנ"א הנגיפי הוא משובט תחת אמרגן מוכר על ידי א ' coli או RNA פולימראז הפאג לייצור RNAs הסינתטי במבחנה עם 'ו 3' טרמיני המוגדרים 5, שעובר את מחזור השכפול הנגיפי השלם כאשר הוכנסו לתאי מארח. 4,5 ההצלחה הראשונה עם גישה זו דווחה לוירוס פסיפס ברום , 6,7 וירוס RNA חיובי גדיל של צמחים. מאז, הגישה השיק RNA פותחה עבור מגוון רחב של וירוסי RNA חיובי גדיל, כולל caliciviruses, alphaviruses, flaviviruses, arteriviruses, וקורונה. 1,4,5,8

בשני דנ"א ורנ"א השיק מערכות גנטיקה הפוכה, הבנייה של פולשיבוט cDNA L-אורך הוא המפתח ליצירת DNA או RNA של וירוסי RNA חיובי גדיל מדבק, אבל זה הופך להיות אתגר משמעותי טכני כמו הגודל של עליות הגנום נגיפיות. 9-17 בפרט, הגנום RNA גדול של ~ 10 -32 Kb מציג שלושה מכשולים עיקריים לשיבוט של cDNA הפונקציונלי באורך מלא. 18 הקושי הראשון הוא הסינתזה של cDNA נאמן להעתיק, מאז הנאמנות של RT-PCR היא ביחס הפוך לאורכו של רנ"א הנגיפי. המשוכה השנייה היא נוכחותם של רצפים רעילים, מאז מולקולות RNA ארוכות יותר עלולות להכיל רצפים בלתי צפויים מסוגלים לבצע את בר cDNA בפלסמידים לא יציבים בE. coli. הנושא השלישי והקריטי ביותר הוא הזמינות של וקטור מתאים, שכן קשה למצוא וקטור שיבוט שיכול לשכן להוסיף cDNA ויראלי של> 10 KB. במהלך שלושת העשורים האחרונים, חסמים אלה היו להתגבר על ידי כמה התקדמויות בenzymology, מתודולוגיה,vectorology ד. 1,4,5,8 מבין אלה, הפיתוח המבטיח וחדשני ביותר הוא השיבוט של וירוסים גדולים חיובי גדיל RNA כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי זיהומיות כ( BACS). וקטור BAC הוא פלסמיד נמוך עותק שיבוט (1-2 עותקים / תא) המבוסס על ה גורם פוריות coli, עם גודל ממוצע של ה- DNA להוסיף ~ 120-350 kb 19-21 קטע DNA מוכנס לתוך וקטור BAC באופן דומה לשיבוט לתוך וקטורי שיבוט כלליים.; השיבוטים BAC וכתוצאה מכך הם יציבים לאורך דורות רבים בE. coli. 22,23 עד כה, טכנולוגית BAC נעשה שימוש כדי ליצור שיבוטים cDNA מדבקים ל> 10 חברי שלוש משפחות חיוביות גדיל RNA וירוס, כלומר, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 וCoronaviridae. 9,16,17 , 31,32

שימוש בוירוס דלקת מוח יפני (JEV) כדוגמא, את העבודה הנוכחית מדווחת נהלים מפורטים שיכול להיותמשמש לבניית BAC זיהומיות באורך מלא יציב מבחינה גנטית עבור מגוון רחב של וירוסי RNA חיובי גדיל. JEV הוא flavivirus zoonotic 33 שמועבר בטבע בין ציפורים, חזירים, ומארחי חוליות אחרים על ידי וקטורי יתושים. 34,35 בבני אדם, זיהום JEV יכול לגרום לדלקת קרום המוח הקטלנית לעתים קרובות החמורה המחלה נוירולוגית היפנית (י"א), 36 אשר מתרחש ב אסיה וחלקים של האוקיינוס ​​השקט במערב, 37,38 עם שכיחות שנתית משוערת של ~ 50,000-175,000 מקרים קליניים. 39,40 הגנום של JEV היא 11 KB, מולקולה ~ חד-גדילים, חיובי תחושת RNA ומורכבת מסגרת קריאה פתוחה יחידה (ORF) מוקפת שני אזורי קידוד-עישון (NCRs) ב5 'ו 3' מסתיימת. 41,42 ORF מקודד polyprotein שהוא ביקע על ידי מארח ופרוטאזות הנגיפית כדי לייצר 10 חלבונים בודדים, מיועד C, PRM, E, ns1, NS2A, NS2B, ns3 NS4A, NS4B, וNS5 בN- לכיוון C-מסוף. 34,43,44 כמו כן, דוארטופס xtended של ns1 (ns1 ') בא לידי הביטוי על ידי -1 frameshifting ריבוזומלי בקודונים 8-9 של NS2A. 45,46 של 11 חלבונים אלה, שלושה החלבונים המבניים (C, PRM, ו- E) הם חיוניים ליצירה של זיהומיות virions, 47,48 ושמונת חלבוני nonstructural הנותרים (ns1 לNS5, וns1 ') הם קריטיים עבור שכפול נגיפי RNA, הרכבה 49-51 חלקיקים, 52-56 והתחמקות חסינות מולדת. 57-59 שניהם 5' ו 3 "NCRs מכיל רצפי שימור ראשוניים ומבני RNA צורה משניים / יישונים, 60-62 שהם חשובים לויסות שכפול רנ"א נגיפי. 63,64

פרוטוקול זה מתאר את הכלים, שיטות והאסטרטגיות ליצירת באורך מלא BAC זיהומיות של JEV 14 SA -14-2. 28 שיבוט BAC פונקציונלי זה מכיל עותק מלא cDNA של RNA הגנומי JEV, 65 אשר הקיף על ידי אמרגן לRNA פולימראז SP6 במעלה הזרםשל 5'-הסוף הנגיפי ואתר הגבלה ייחודי Xba אני במורד הזרם של 3'-הסוף הנגיפי במבחנה תעתיק ניגר. טכנולוגית BAC זה חל על בניית שיבוט מולקולרי cDNA פונקציונלי מלא עבור מערך של וירוסי RNA חיובי גדיל.

Protocol

הערה: איור 1 מציג אסטרטגיה לבניית באורך מלא זיהומיות JEV cDNA כBAC 28 טבלה 1 מספקת רשימה של oligonucleotides שימוש בפרוטוקול זה 28..

1. חלץ רנ"א הנגיפי מחלקיקי JEV בתא Supernatants התרבות

  1. התחל עם מדיום תרבית תאים המכיל JEV SA 14 -14-2, וירוס חיסון י"א חי שדורש רמת בטיחות ביולוגית בלימת 2.
    הערה: כייל הנגיף הוא כ 1-3 × 10 6 יחידות / מיליליטר יוצרי פלאק.
  2. קח את הכשרת הבטיחות הביולוגית הכרחית לכל שיטות סטנדרטי המיקרוביולוגית, ציוד בטיחות, ומתקני מעבדה לפני העבודה עם JEV SA 14 -14-2.
  3. לטהר רנ"א הנגיפי מaliquot של מדיום תרבית תאים המכיל וירוס באמצעות פתרון monophasic של פנול וguanidine isothiocyanate 66 (איור 1 א).
    1. מוֹדָעָהד 600 μl של מגיב monophasic 200 μl של supernatant התרבות בmicrotube 1.7 מיליליטר. Homogenize התערובת ביד רועד הצינור במרץ במשך 30 שניות ודוגרת במשך 5 דקות ב RT.
    2. להוסיף 160 μl של כלורופורם המדגם הומוגני. מערבבים היטב ביד רועדת הצינור במרץ במשך 15 שניות ומשאירה אותו במשך 2-3 דקות ב RT.
    3. צנטריפוגה lysate סך 13,400 ב× גרם במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך הפרדה של שני שלבי נוזל, כלומר, שלב אורגני נמוך ושלב מימי עליון. מעבירים את השלב העליון המימי (פחות מ -200 μl) המכיל את הרנ"א לmicrotube חדש.
    4. לזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת 1 μl של 5 מיקרוגרם / גליקוגן μl 400 μl של isopropanol 100% ודוגרים במשך 10 דקות ב RT.
    5. צנטריפוגה את התערובת בז × 13,400 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם 1 מ"ל של אתנול 75% על ידי דופק vortexing 04:57פעמים וצנטריפוגה ב13,400 × גרם במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
    6. האוויר יבש גלולה RNA במשך 10 דקות ולפזר אותו ב -40 μl של DH 2 O. אחסן את RNA חילוץ ב -80 ° C עד שימוש.

2. לסנתז סט של ארבע חופפים cDNA שברים (F1 כדי F4) פורש ויראלי הגנום RNA השלם על ידי שעתוק לאחור (RT) -PCR

  1. בצע תגובת RT 20 μl עם aliquot 10 μl של רנ"א הנגיפי המטוהר כתבנית וצורה שונה של וירוס לוקמיה עכברי מולוני ההפוך transcriptase. 67
    1. הגדר את תערובת 13 μl מכילה 10 μl של RNA המטוהר, תערובת dNTP 1 μl 10 מ"מ, 1 μl 4 pmol / פריימר μl, וμl dH 1 2 O. השתמש בפריימר הבר-ספציפי לכל תגובת RT: 1RT לF1, F2 2RT ל, 3RT לF3, ו4RT לF4.
    2. דגירה את התערובת על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מקום על קרח דק 1, ולאחר מכן מהיר ספין כדי לאסוף את קונטהNTS בחלק התחתון של הצינור.
    3. הוסף 4 μl 5 × חיץ RT, 1 μl 0.1 M DTT, 1 מעכב RNase μl 40 U / μl, וμl 1 200 U / μl הפוך transcriptase. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה שלושה עד חמש פעמים.
    4. בואו להמשיך התגובה על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן חום להשבית המדגם על 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אחסן את cDNA ראשון גדיל מסונתז ב -20 ° C עד לשימוש.
  2. בצע תגובת PCR 100 μl עם aliquot 5 μl של תגובת RT חום מומת כתבנית ופולימראז באיכות גבוהה DNA thermostable 68 (איור 1).
    1. הגדר את תגובת PCR 100 μl על קרח, המכיל 5 μl של תגובת RT, 20 μl 5 × חיץ PCR, 4 μl תמהיל dNTP 10 מ"מ, פריימר קדימה 5 μl 10 מיקרומטר, 5 μl 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, 1 μl 2 U / Μl DNA פולימרז, ו DH μl 60 2 O. השתמש בזוג פריימר הבר-ספציפי לכל reactio PCRn: 1F + 1R לF1 (2,573 נקודות בסיס), 2F + 2R לF2 (4171 BP), 3F + 3R לF3 (3922 BP), ו4F + 4R לF4 (1798 BP).
    2. מערבבים בעדינות על ידי שלושה עד חמש פעמים את הצינור מרפרף-אצבע ובקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את התוכן שלה בתחתית.
    3. בגין thermocycling עם שלב ראשוני denaturation של 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 25-30 מחזורים עם פרופיל PCR הבא: 10 שניות על 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו1-2 דקות (30 שניות / KB) על 72 מעלות צלזיוס. אחסן את מוצרי ה- PCR על 4 מעלות צלזיוס עד ניתח.
  3. הפעל aliquot 2-5 μl של כל תגובת PCR על 0.8% agarose ג'ל המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (EtBr) (איור 2).
    זהירות: EtBr הוא mutagen חזק ודורש חלוקי מעבדה, משקפיים בטיחות, וכפפות כדי להשתפשף וזהירות רבה כדי להיות שנצפה בשימוש, האחסון, וסילוקה.

3. subclone כל אחד מארבעת שברי cDNA (F1 כדי F4) לוקטור BAC ליצירת pBAC / F1 כדי pBAC / F4 בטכניקות מולקולריות y שיבוט

  1. לעכל את הווקטור והכנס DNAs עם שני endonucleases ההגבלה המתאים, כדלקמן:
    1. בצע עיכול רציף של pBAC / PRRSV / פלורידה (וקטור), 30 נגזר של פלסמיד pBeloBAC11 (7507 BP, U51113 מספר הצטרפות GenBank), עם PME אני ולא אני בהיקף כולל של 60 μl (המכיל ~ 500 ng DNA , 10 אנזים U, חיץ עיכול 1x, ו1 × BSA) על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-15 שעות, אשר מניבה בר וקטור 15,426-נ"ב.
    2. בצע עיכול רציף של כל אחד מארבע amplicons cDNA (להוסיף) עם Sma אני ולא אני בהיקף כולל של 60 μl (המכיל DNA ~ 1 מיקרוגרם, 20 אנזים U, 1 × חיץ עיכול, ו1 × BSA) ב 25 מעלות צלזיוס (SMA אני) או 37 ° C (לא אני) 12-15 שעות, אשר מניבה הברים הכנס הבאים בגודל הרצוי: F1 (2,559 נקודות בסיס), F2 (4,157 נקודות בסיס), F3 (3908 BP), ו F4 (1784 BP).
  2. לטהררצוי וקטור ולהכניס קטעי DNA על ידי מיצוי ג'ל.
    1. הפרד את המוצרים מתעכלים כפליים על 1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr. לגזור להקה של קטע DNA הרצוי עם כמות מינימאלית של agarose (בדרך כלל ~ 200 μl) תחת אור אולטרה סגול גל ארוך.
    2. הוסף נפח שווה של חיץ TEM (10 מ"מ טריס-Cl, 1 mM EDTA, ו -10 מ"מ MgCl 2) לנכרת agarose בmicrotube 1.7 מיליליטר. דגירה המדגם ב 72 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות, עם vortexing כל דקות 2-3 עד agarose נמס לחלוטין.
    3. הוסף נפח שווה של פנול-רווי חיץ מראש חימם, מערבולת במרץ דקות 1, וצנטריפוגות ב 13,400 × גרם במשך 10 דקות ב RT.
      הערה: התערובת מפרידה לשלב אורגני נמוך ושלב מימי עליון. מעבירים את השלב המימי העליון המכיל את ה- DNA לmicrotube חדש.
    4. הוסף נפח שווה של כלורופורם: אלכוהול isoamyl (24: 1), מערבולת דקות 1, וצנטריפוגות ב 13,ז 400 × 10 דקות ב RT. מעבירים את השלב העליון המימי לmicrotube חדש.
    5. הוסף 0.5 μl של 10 מיקרוגרם tRNA שמרים / μl, 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט, ו -2.5 כרכים של 100% אתנול. שמור את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
    6. צנטריפוגה את התערובת על 13,400 × גרם במשך 10 דקות ב RT. הסר את supernatant ולשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70% על ידי דופק vortexing שלושה עד חמש פעמים וצנטריפוגה ב13,400 × גרם במשך 10 דקות.
    7. האוויר יבש גלולה דנ"א למשך 10 דקות ולפזר אותו ב -20 μl של TE חיץ (10 מ"מ טריס-Cl ו 1 mM EDTA [pH 7.6]).
  3. לקשור את הווקטור הרצוי ולהכניס קטעי דנ"א באמצעות האנזים T4 DNA.
    1. הגדר את תגובת קשירת 20 μl מכילה 50-100 ng של DNA הווקטור, עודף טוחנת ~ פי 3 של ה- DNA להוסיף, 400 האנזים U T4 DNA, וחיץ × קשירה 1. דגירה תגובת קשירה על 16 מעלות צלזיוס למשך 12-15 שעות.
      הערה: כלול contr שליליתגובת ol, כלומר, וקטור בלבד ללא ההוספה, במקביל.
    2. לבצע ארבע קשירה נפרדת, כל אחד שהצטרף PME אני- לא אני שבר 15,426-נ"ב של pBAC / PRRSV / פלורידה עם 2,559-נ"ב (לF1), 4,157-נ"ב (לF2), 3908-נ"ב (לF3), או 1,784-נ"ב (לF4) Sma אני- לא אני שבר של אחד מארבע amplicons cDNA, כדי ליצור subclones pBAC / F1 כדי pBAC / F4.
  4. להפוך את ה- DNA ligated לתוך E. coli DH10B בשיטת הלם -heat CaCl 2.
    1. קח 100 aliquots μl של CaCl 2 -treated תאי DH10B מוסמך 69 מאוחסנים ב -80 ° C ולהפשיר אותם על קרח.
      הערה: שימוש בתאים לכל שינוי 100 μl.
    2. הוסף aliquot 10 μl של תגובת קשירת DNA לתאים המופשרים 100 μl בmicrotube 1.7 מיליליטר, לערבב בעדינות על ידי הקשה על הצינור, ולשמור על קרח למשך 30 דקות.
    3. חום הלם תערובת ה- DNA בתאי במשך 45 שניות בwa 42 מעלות צלזיוסהאמבטיה ter, מניח על קרח למשך 2 דקות, ולאחר מכן להוסיף 900 ​​μl של מרק LB מחומם מראש לRT.
    4. דגירה תאי החום המום על 35 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, עם רעד ב225-250 סל"ד.
    5. מורחים 50 עד 200 aliquots μl של התאים בתרבית על צלחות אגר LB המכילות chloramphenicol 10 מיקרוגרם / מיליליטר (CML). שמור את הצלחות על RT, בצד ימין למעלה, עד שהם יבשים.
    6. הפעל את הצלחות הפוכות ולדגור על 35 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
  5. לשחזר את ה- DNA BAC המשובט מתאי המארח בשיטת טיהור מבוסס עמודה (איור 1 ג).
    1. פיק שישה עד שמונה מושבות חיידקים מהצלחות אגר LB-CML ולחסן אותם ל 3 מיליליטר של מרק 2xYT המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר CML. דגירה התרבויות על 35 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות עם רעד נמרץ (225-250 סל"ד).
    2. לבודד רקומביננטי BAC DNAs 1-1.5 מיליליטר של תרבויות חיידקים באמצעות עמודות ספין, כמו בבימויו של היצרן. 70 Elute DNA שחולץ (typing קאלי 100-200) ב -20 μl של TE חיץ.
    3. לבצע שני digestions אנזים הגבלה אנליטי של BACS המבודד ל~ 6 שעות בהיקף כולל של 10 μl, אחד לזהות את נוכחותו של הווקטור עם הוספה נכונה באמצעות אותו האנזימים המשמשים לשיבוט (ראה פרוטוקול 3.1), והשני כדי לבדוק את תקינות BACS המשובט עם אנזים מתאים (למשל, BGL השני, מש"ק אני, או Pst אני), יצירת תבנית בר הגבלה ייחודית.
    4. הפץ BACS המשובט בצורה הנכונה על ידי ייחס 500 μl של תרבויות חיידקים החיוביות (מפרוטוקול 3.5.1) ב500 מיליליטר של מדיום 2xYT-CML וטיפוח הבידוד במשך 6 שעות ב 35 ° C תוך רועד ב225-250 סל"ד. לטהר את ה- DNA BAC (בדרך כלל 10-20 מיקרוגרם) מתרבות 500 מיליליטר באמצעות עמודות מסנן, כפי שהומלץ על ידי היצרן. 71
      הערה: ארבע subclones BAC הראשוני, המכיל בר cDNA של RNA הגנומי JEV, עשוי להוכיח שיש בדואר או מוטציה לא רצויה יותר (ים) בהשוואה לרצף הקונצנזוס של הגנום הנגיפי 42 (המשמש כרצף התייחסות). כל מוטציה כזו צריכה להיות מתוקנת על ידי מכוון mutagenesis אתר מבוסס PCR לפני ההרכבה של באורך מלא JEV cDNA. 27

4. יצירה באורך מלא JEV cDNA עם 5 'SP6 יזם ו'3 אתר RUN-OFF

  1. הפוך שלושה שינויים גנטיים (ראו להלן פרוטוקולים 4.1.1-4.1.3) בcDNAs המשובט כדי לאפשר שעתוק ניגר במבחנה של RNAs הגנום באורך עם 5 האותנטיים 'ו 3' מסתיים של הגנום הנגיפי.
    1. להציג את אמרגן SP6 ישירות במעלה הזרם של סוף '5 של הגנום הנגיפי על ידי הארכת החפיפה PCR (איור 1D, pBAC / F1 SP6).
      1. להגביר שני שברי DNA חופפים באמצעות PCR הסטנדרטי הראשון של pBAC / F1 עם שני זוגות פריימר SP6F + SP6R (גודל מוצר, 173 נ"ב) וF1F + F1R (מוצר שלize, 676 נ"ב), כל אחד בתגובת 50 μl מכילה תבנית ה- DNA μl 1 (~ 200 pg / μl), 10 μl 5 × חיץ PCR, 2 μl 10 מ"מ dNTPs, 2.5 μl כל 10 מיקרומטר קדימה הפוך פריימרים, 0.5 μl 2 U / μl DNA פולימרז, 68 ו -31.5 dH μl 2 O. לבצע PCR באמצעות פרופיל הרכיבה על אופניים הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות.
      2. ג'ל לטהר שני שברי DNA מוגברים-PCR אחרי ריצת כל אחד משני מוצרי ה- PCR על 1.5% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כפי שתואר בפרוטוקול 3.2.
      3. הפתיל שני שברי DNA מטוהר ג'ל באמצעות ההיתוך השני PCR באמצעות SP6F + F1R פריימרים החיצוניים (גודל מוצר, 821 נ"ב) בתגובת 100 μl כולל 1 μl כל אחד משני שברי DNA המטוהרים (~ 100 pg / μl), 20 μl 5 × חיץ PCR, 4 μl 10 מ"מ dNTPs, 5 μl כל 10 מיקרומטר קדימה הפוך פריימרים, 1 μl2 פולימראז U / μL DNA, 68 ו DH μl 63 2 O. השתמש בפרופיל הבא תרמית רכיבה על אופניים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      4. ג'ל לטהר את amplicon PCR התמזגו מ1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כפי שתואר בפרוטוקול 3.2.
      5. בצע את הליך שיבוט חמשת שלבים שתואר בפרוטוקולים 3.1-3.5 וללקשור בר פאק אני- BSI WI 760-נ"ב של amplicon PCR-מטוהר ג'ל התמזגו עם בר פאק אני- BSI WI 9,532-BP של pBAC / F1 כדי ליצור pBAC / F1 SP6.
    2. הסר את קיים מראש, אתר Xba אני פנימי בנוקלאוטיד 9,131 ידי החדרת מוטציה שקטה נקודה (9,134 → T) באמצעות הרחבת החפיפה PCR (איור 1D, pBAC / F3 KO).
      1. להגביר שני שברי DNA חופפים על ידי PCR הסטנדרטי הראשון של pBAC / F3 עם שני זוגות פריימר X1F + X1R(גודל מוצר, 746 נ"ב) וX2F + X2R (גודל מוצר, 316 נ"ב) בתגובת 50 μl תחת תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול 4.1.1.1.
      2. ג'ל לטהר שני שברי DNA מוגברים-PCR לאחר הפרדת electrophoretic על ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה של 1.5%, כמפורט בפרוטוקול 3.2.
      3. הפתיל שני שברי DNA מטוהר ג'ל באמצעות ההיתוך השני PCR באמצעות X1F פריימרים החיצוניים + X2R (גודל מוצר, 1033 BP) בתגובת μl 100 תחת תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול 4.1.1.3.
      4. ג'ל לטהר את amplicon PCR התמזגו מ1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כמפורט בפרוטוקול 3.2.
      5. בצע את הליך שיבוט חמשת שלבים שתואר בפרוטוקולים 3.1-3.5 וללקשור AVR II- לא אני שבר 949 נ"ב-של amplicon PCR-מטוהר ג'ל התמזגו עם 16,245-נ"ב לא אני- BSI WI ו2,141-נ"ב BSI W אני - ברי AVR השני של pBAC / F3 לייצר pBAC / F3 KO.
      </ Li>
    3. מהנדס Xba המלאכותי חדש שאתר ניגר רק במורד הזרם של סוף '3 ​​של הגנום הנגיפי על ידי מכוון mutagenesis אתר מבוסס PCR (איור 1D, pBAC / F4 RO).
      1. צור קטע DNA אחד על ידי PCR של pBAC / F4 עם ROF פריימרים + ROR (גודל מוצר, 324 נ"ב) בתגובת 100 μl מכיל תבנית ה- DNA μl 1 (~ 200 pg / μl), 20 μl 5 × חיץ PCR, 4 μl 10 מ"מ dNTPs, 5 μl כל 10 מיקרומטר קדימה ופריימרים הפוכים, 1 μl 2 U / μl DNA פולימרז, 68 ו -64 dH μl 2 O. לבצע PCR באמצעות פרופיל הרכיבה על אופניים הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות.
      2. ג'ל לטהר את קטע DNA המוגבר-PCR 1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כמפורט בפרוטוקול 3.2.
      3. בצע את הליך שיבוט חמשת שלבים שתואר בפרוטוקולים 3.1-3.5 וללקשור 283-נ"ב SFI אני- Not אני בר של amplicon PCR-מטוהר ג'ל עם SFI אני- לא אני שבר 16,933-נ"ב של pBAC / F4 כדי ליצור pBAC / F4 RO.
  2. להרכיב סט של ארבעה שונה, החופפים cDNAs לאורך מלא יחיד SA 14 -14-2 BAC (pBAC / 14 SA -14-2) על ידי הצטרפות בשלושה אתרי הגבלה טבעית (GI בסר, Bam HI, ואווה אני ) באופן רציף באמצעות חמשת שלבי שיבוט נהלים המפורטים בפרוטוקולים 3.1-3.5 (איור 1E): F1 SP6 → F1 SP6 F2 (על ידי החלפת שבר בסר G אני- לא אני של pBAC / F1 SP6 עם זה של pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (על ידי החלפת שבר Bam H אני- לא אני של pBAC / F1 F2 SP6 עם זה של pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (על ידי החלפת שבר אווה אני- לא אני של pBAC / F1 F2 SP6F3 KO עם זה של pBAC / F4 RO).

5. הכן גבוהה טוהר מקסי-הכנה של האורך המלא 14 SA -14-2 BAC

  1. לגדול מושבה אחת של א ' coli DH10B ביצוע 14 -14-2 ב 3 מיליליטר pBAC / SA של מרק 2xYT מכיל CML 10 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 10 שעות ב 35 מעלות צלזיוס עם רועד ב225-250 סל"ד, ולאחר מכן בהיקף של עד 500 על ידי ייחסת μl של 10 שעות תרבות חיידקים לתוך 500 מיליליטר של מדיום 2xYT-CML וטיפוח הבידוד במשך 6 שעות ב 35 ° C עם רעד נמרץ.
  2. צנטריפוגה תרבות החיידקים בשני בקבוקים 250 מיליליטר בז × 3107 במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Resuspend כל גלולה ב 30 מיליליטר של תמיסת GTE (50 גלוקוז מ"מ, 25 מ"מ טריס-Cl, ו -10 מ"מ EDTA [pH 8.0]), ולאחר מכן להוסיף 500 μl של 60 מ"ג / מיליליטר יזוזים. דגירה שתי השעיות תא על קרח במשך 10 דקות.
  3. להוסיף 60 מיליליטר של תמיסת תמוגה טריה (0.2 N NaOH ו -1% SDS) לכל השעיה תא, ומערבב היטב עד שברור, ולשמור lysatesב RT במשך 10 דקות.
  4. להוסיף 45 מיליליטר של תמיסת ניטרול (100 מיליליטר, בהיקף של 60 מיליליטר 5 M אצטט אשלגן, חומצה אצטית קרחונית 11.5 מיליליטר, ו28.5 מיליליטר DH 2 O) לכל בקבוק, ומערבב היטב על ידי היפוך הבקבוקים, ודגירת lysates נוטרל על קרח במשך 10 דקות.
  5. צנטריפוגה lysates נוטרל בז × 18566 עבור 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant של שני הבקבוקים לשני בקבוקים 250 מיליליטר חדשים; להוסיף 0.6 נפח של 100% isopropanol לכל אחד, ולשמור אותם על קרח למשך 20 דקות.
  6. ספין למטה משקעים ב18566 ז × במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. ממיסים כל גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ TE, לשלב אותם בצינור 50 מיליליטר (10 מיליליטר סה"כ), ולזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת נפח שווה של 5 M כלוריד ליתיום. דגירה את התערובת על קרח למשך 10 דקות.
  7. צנטריפוגה משקע RNA בז × 14636 עבור 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant לצינור 250 מיליליטר חדש ולזרז DNA על ידי הוספת 2 כרכים של isopropanol 100%.דגירה את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
  8. ספין למטה משקע DNA ב18566 ז × במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant, resuspend גלולה DNA ב9.5 מיליליטר של חיץ TE (pH 7.6), ולהוסיף 10 גרם של צזיום כלוריד (CsCl) וμl 390 של 10 מ"ג / מיליליטר EtBr.
  9. טען את פתרון ה- DNA CsCl-EtBr לתוך צינור פוליפרופילן 16 × 76 מ"מ סגר באמצעות מזרק מצויד במחט 18 G. ספין שיפוע CsCl האטום בultracentrifuge ב401700 ז × במשך 16 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס (איור 3).
  10. לאסוף להקת DNA של פלסמיד BAC משיפוע CsCl באמצעות מחט G 18 כדי ליצור פתח אוורור בחלק העליון של השיפוע ומזרק 20-מצויד מחט G כדי לאחזר את ה- DNA BAC מהצד של השיפוע.
  11. להוסיף 2.5 כרכים של DH 2 O-רווי butanol לדגימת DNA BAC הצבעוני EtBr ומערבבים על ידי vortexing. צנטריפוגה את התערובת בז × 13,400 דקות 1 ולהעביר את השלב המימי הנמוך למיקרופון 1.7 מיליליטר חדשrotube. חזור על תהליך זה שש פעמים.
  12. להאיץ את ה- DNA BAC EtBr-בחינם על ידי הוספת 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט ו 2.5 כרכים של אתנול 100% ל- DNA BAC-חילוץ butanol ודוגר במשך 10 דקות על קרח. צנטריפוגה המשקע בז × 13,400 במשך 10 דקות, לשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70%, ומחדש גלולה זה על ידי צנטריפוגה.
  13. האוויר יבש גלולה דנ"א למשך 10 דקות ולפזר אותו ב200 μl של TE חיץ (pH 7.6).
    הערה: איור 4 מציג סקירה של מערכת הגנטיקה ההפוכה לJEV SA 14 -14-2.

6. לתמלל RNAs סינטטי במבחנה מה- DNA JEV BAC באורך מלא לינארית

  1. בצע עיכול אנזים הגבלה בקנה מידה גדולה של pBAC / 14 SA -14-2 עם Xba אני בנפח כולל של 100 μl (המכיל 3 מיקרוגרם DNA, 60 אנזים U, חיץ × עיכול 1, ו 1 × BSA) על 37 מעלות C 12-15 שעות. בדוק aliquot 3 μl של דתגובת igestion על 0.8% agarose ג'ל המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr.
  2. דגירה תגובת העיכול נוסף עם 25 U של nuclease שעועית מונג (MBN) על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (איור 4 א).
  3. תביא את הנפח של המדגם-מתעכל אני Xba, שטופל MBN עד 300 μl עם DH 2 א ' הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) המדגם המדולל, מערבולת במרץ דקות 1, ספין ב13,400 × גרם במשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את השלב מימי העליון ל1.7 מיליליטר חדש microtube. הוסף נפח שווה של כלורופורם ולחזור על תהליך החילוץ.
  4. לשחזר את פנול BAC, לינארית חילוץ, כלורופורם / על ידי משקעים אתנול: הוסף 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט ו 2.5 כרכים של 100% אתנול, ולדגור על קרח במשך 20 דקות. צנטריפוגה המשקע בז × 13,400 במשך 10 דקות, לשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70%, ולאחר מכן לסובב אותו מחדש על ידי צנטריפוגה.
  5. אוויר יבש Pelle DNAלא עבור 10 דקות ולפזר אותו בμl 30 של DH 2 O. בדוק aliquot μl 1 של BAC התאושש על ג'ל agarose 0.8% עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr (איור 5 א).
  6. לבצע שעתוק נגר של ה- DNA BAC לינארית בהיקף כולל של 25 μl (המכיל ~ 200 ng DNA תבנית, 0.8 אנלוגי כובע מ"מ [מ 7 G (5 ') PPP (5')], 1 מ"מ rNTPs, 40 מעכב U RNase, 20 פולימראז U SP6 RNA, 72 ו 1 × חיץ שעתוק) על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (איור 4). כולל 0.5 מיקרומטר [3 H] UTP לכימות RNA על הבסיס [3 H] התאגדות UTP, כפיקוח על ידי ספיחה לנייר DE-81 מסנן. 69
  7. הפעל aliquot 1-2 μl של תגובת השעתוק נגר על 0.6% agarose ג'ל המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr (איור 5).

7. לקבוע RNA infectivity ותשואת וירוס

  1. לטפח BHK-21 תאים בcultu 150 מ"ממחדש מנות בצפיפות של 3 × 10 6 תאים / צלחת למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    הערה: שמור BHK-21 התאים במדיום חיוני מינימאלי אלפא בתוספת 10% בסרום שור עוברי, גלוטמין 2 מ"מ, ויטמינים, ופניצילין / סטרפטומיצין.
  2. יש לשטוף את monolayer התא עם 10 מיליליטר של תמיסה קרה (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8.1 מ"מ Na 2 HPO 4, ו -1.5 מ"מ KH 2 PO 4). לנתק את התאים מהמנות על ידי טיפול עם 4 מיליליטר של טריפסין EDTA (0.25%), ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 270 × גרם בצנטריפוגה שולחן עבודה למשך 2 דקות.
  3. Resuspend התא גלולה עם 50 מיליליטר של תמיסה קרה בצינור חרוטי 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ההשעיה התא ב 270 × גרם במשך 2 דקות. חזור על תהליך זה לשטוף שלוש פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, resuspend התא גלולה בצפיפות של 2 × 10 7 תאים / מיליליטר בא סול
  4. מערבבים aliquot 400 μl של השעיה תא עם 2 μגרם של RNA הסינתטי בקובט פער 2 מ"מ, ומייד electroporate התערובת עם electroporator בתנאים אופטימליים electroporation: אורך 980 V, 99 μsec דופק, ו -5 פעימות (איור 4C).
    הערה: השתמש בRNA שכותרת H 3 מסונתז בפרוטוקול 6.5 ישירות לelectroporation ללא טיהור נוספת.
  5. השאר את תאי electroporated ב RT במשך 10 דקות ולהעביר לmicrotube 1.7 מיליליטר מכיל 600 μl של מדיום תרבות השלם.
  6. הכן דילול סדרתי של פי 10 של תאי electroporated ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות השלם וצלחת aliquot 100 μl של כל דילול על monolayers של BHK-21 תאי unelectroporated (5 × 10 5) בצלחת 6 היטב.
  7. לאחר 4-6 שעות של דגירה, כיסוי התאים עם agarose 0.5% במדיום חיוני מינימאלי המכילים 10% בסרום שור עוברי. דגירה הצלחות במשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  8. דמיין את מרכז זיהומיותs (פלאק) על ידי קיבוע עם פורמלדהיד 7% וצביעה עם 1% סגולים קריסטל ב 5% 27 (איור 6 א) אתנול.
    1. אופציונאלי: בדוק תאים-electroporated RNA בשעות 18-20 לאחר transfection לביטוי חלבון JEV ידי מבחני immunofluorescence 27,73 (איור 6), ולקצור את supernatants מהתאים-electroporated RNA ב 22 ו -40 שעות שלאחר transfection לוירוס טיטרציה על ידי מבחני פלאק 27,63 (איור 6 ג).

Representative Results

לכל וירוסי RNA חיובי גדיל, האמינות והיעילות של מערכת גנטיקה הפוכה תלויה ביציבות הגנטית של cDNA באורך מלא משובט, הרצף שהוא שווה ערך לרצף הקונצנזוס של RNA הגנומי ויראלי. 27 איור 1 מציג חמישה אסטרטגית צעד לבניית cDNA זיהומיות באורך מלא כBAC לJEV SA 14 -14-2 28: שלב 1, טיהור של רנ"א הנגיפי מsupernatant תרבית תאים של BHK-21 תאים נגועים JEV (איור 1 א); שלב 2, סינתזה של ארבע amplicons החופפות cDNA (F1 כדי F4) פורש הגנום הנגיפי השלם (איור 1); שלב 3, subcloning של כל אחד מארבעת שברי cDNA רציפים לתוך וקטור BAC, יצירת pBAC / F1 כדי pBAC / F4 (איור 1 ג); שלב 4, שינוי של cDNAs המשובט לשעתוק ניגר במבחנה עם RNA פולימראז SP6, כלומר, הצבת SP6רצף אמרגן מייד במעלה הזרם של 5'-הסוף הנגיפי (pBAC / F1 SP6), ביטול מראש קיימים-פנימי אתר Xba אני בנוקלאוטיד 9,131 ידי החדרת מוטציה נקודה שקטה, 9,134 → T (pBAC / F3 KO), והכנסת אתר Xba המלאכותי החדש אני רץ-מייד במורד הזרם של 3'-הסוף הנגיפי (pBAC / F4 RO) (איור 1D); ושלב 5, הרכבה של באורך מלא SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (איור 1E). טבלת 1 רשימות oligonucleotides המשמש בתהליך שכפול זה. 28

לבניית JEV cDNA פונקציונלי, הצעד החשוב הראשון הוא הסינתזה של ארבעה שברי cDNA החופפים באמצעות רנ"א הנגיפי המטוהר כתבנית לRT-PCR. איור 2 מספק תוצאת נציג לארבעה מוצרי RT-PCR שהיו electrophoresed על 0.8%agarose ג'ל. ג'ל זו ממחיש באופן ברור כי באורך מלא JEV cDNA מוגבר לארבעה שברי cDNA חופפים. מדי פעם, תגובות RT-PCR עשויות להניב מוצרי וירוס ספציפי או ספציפי נוסף אחת או יותר, כי הם קטנים יותר מאשר ברוב המוצר הצפוי, בגלל חישול ספציפי של פריימרים במהלך סינתזה / ההגברה cDNA. מצד השני, קטן או לא צפוי מוצר RT-PCR היה להיות מוגבר בגלל זיהום RNase המקרי במהלך בידוד RNA הנגיפי או ביצועי RT-PCR לא תקינים.

הצעד הבא הוא מפתח השיבוט והשינוי של אורך מלא partial- או JEV cDNA בBAC, שהנו הליך פשוט יחסית שמשתמש בטכניקות DNA רקומביננטי סטנדרטיים. 69 איור 3 מציג תוצאות נציג לטיהור שיבוט BAC מכילה cDNA באורך מלא של JEV SA 14 -14-2 על ידי רצועות בשיפוע CsCl-EtBr.בניסוי זה, לאחר צנטריפוגה במשך 16 שעות ב401700 × גרם, שתי להקות שונות, כלומר, א ' DNA coli כרומוזומליות לעיל ופלסמיד דנ"א BAC supercoiled להלן, נראה באמצע הצינור תחת אור אולטרה סגול גל ארוך. נפח מינימאלי (~ 400 μl) של להקת ה- DNA BAC הנמוכה נאסף בקפידה על ידי תוקע חור עם מזרק בצד של הצינור. בהמשך לכך, EtBr הופק מה- DNA BAC על ידי מיצוי butanol, וללא EtBr BAC DNA היה מרוכז על ידי משקעים אתנול.

השלב האחרון הוא קביעת infectivity הספציפי של RNAs הסינתטי עיבד במבחנה באורך המלא SA 14 -14-2 BAC (pBAC / 14 SA -14-2) לאחר transfection RNA בתאי יתר (איור 4). צעד זה כרוך בשלושה שלבים עוקבים: שלב 1, linearization של האורך המלא SA 14 -14-2 cDNA ב'3-end של הגנום הנגיפי (איור 4 א); שלב 2, ייצור RNAs הסינתטי מcDNA לינארית על ידי שעתוק נגר (איור 4); ושלב 3, הצלה של וירוסי רקומביננטי בBHK-21 תאים transfected עם RNAs הסינתטי (איור 4C). בניסוי, שני שיבוטים עצמאיים של pBAC / 14 SA -14-2 היו לינארית עם Xba אני עיכול וטופלו בMBN להסיר 5 הסככה ארבעה-הבסיס "שנוצרה על ידי עיכול Xba אני. BACS ינארית נוקה על ידי מיצוי פנול, כלורופורם, ואחריו משקעים אתנול. Linearization של שני BACS המטוהר הודגם על 0.8% agarose ג'ל (איור 5 א '). חילוץ פנול, כלורופורם חייב להיעשות בזהירות כדי להבטיח שBACS לינארית הוא RNase ללא. כל אחד משני BACS ינארית שימש כתבנית cDNA לשעתוק נגר באמצעות פולימראז SP6 RNA בנוכחות G מ '7 (5') PPP (5') אנלוגי כובע. שלמות RNAs הסינתטי הוצגה על ידי הפעלת aliquots של שתי תערובות תגובת שעתוק על 0.6% agarose ג'ל, יחד עם סולם DNA KB התייחסות 1 (איור 5). ב assay זה פשוט, להקת RNA הבולט הגדולה תמיד היגרה רק להלן 3 kb התייחסות להקת DNA ונראיתי חד. עם זאת, מושפל RNA יהיה בעלת מראה מרוח על אותו ג'ל.

Assay מרכז זיהומיות הוא סטנדרט הזהב להחלטת infectivity הספציפי של RNAs הסינתטי. assay זה נעשה על ידי electroporating BHK-21 תאים עם דגימות RNA, זריעת aliquots שווה של פי 10 בדילול סדרתי התאים electroporated 6 צלחות המכילות גם BHK-21 תאים נאיביים (3 × 10 5 תאים היטב /), וכיסית agarose על monolayers התא. לאחר הדגירה במשך 4 ימים, תאים ששרדו היו קבועים עם פורמלדהיד ומוכתם בים סגול גבישolution לכמת את מספר מרכזי זיהומיות (פלאק), אשר תואם את מספר מולקולות RNA זיהומיות מועברות לתוך התאים (איור 6 א). מאז תבנית cDNA משמשת לשעתוק במבחנה הוכחה להיות שאינו מדבק, 27 aliquot של תערובת תגובת השעתוק היה ישירות המשמש לelectroporation. Electroporation הוא השיטה המועדפת לtransfection RNA; לחלופין, ניתן transfected RNAs בשיטות אחרות באמצעות יפוזומים DEAE-dextran וקטיוני. electroporation RNA הוא מאוד יעיל, אבל "קשתי" של הדופק החשמלי מתרחש רק לעתים נדירות, אם מלחים נמצאים בתגובת electroporation או אם קובט electroporation הוא שימוש חוזר. הביטוי של חלבונים נגיפיים בתאים-transfected RNA נבדק על ידי מבחני immunofluorescence באמצעות antiserum ארנב נגד ns1 (איור 6). הייצור של חלקיקים נגיפיים שנצברו בsupernatants של תאי transfected RNA היהalyzed על ידי מבחני פלאק (איור 6 ג). התוצאות של ניסויים אלה מראים בבירור כי RNAs הסינתטי נגזר cDNA הם מדבק בBHK-21 תאים מתירנית, יצירת כייל גבוה של וירוסי רקומביננטי.

Oligonucleotide רצף (5 'ל 3') ב מיקום קוטביות
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 לָחוּשׁ
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 נְמָלָהisense
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 לָחוּשׁ
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 לָחוּשׁ
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10,952-10,977 Antisense
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 לָחוּשׁ
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10,956-10,977 Antisense
SP6F cataccccgcgtattcccac
ת"א 		לָחוּשׁ
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisense
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 לָחוּשׁ
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 לָחוּשׁ
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 לָחוּשׁ
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10,670-10,694 לָחוּשׁ
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10,954-10,977 Antisense
רצפי JEV מוצגים באותיות רישיות, ורצפי BAC מסומנים באותיות קטנות.
עמדת נוקלאוטיד ב מתייחסת לרצף הגנום המלא של JEV SA 14 -14-2 (מספר הצטרפות GenBank JN604986).

טבלה 1: Oligonucleotides משמש לסינתזת cDNA, הגברה PCR, וmutagenesis BAC.

איור 1
איור 1.0; אסטרטגיה לבניית cDNA באורך מלא של JEV SA 14 -14-2 כBAC בידוד () של רנ"א הנגיפי מחלקיקי JEV.. מוצג הוא תרשים סכמטי של RNA הגנומי של JEV SA 14 -14-2. (ב) סינתזה של ארבעה שברי cDNA חופפים (F1 כדי F4) המכסה את כל הגנום הנגיפי. Subcloning (C) של ארבעה שברי cDNA חופפים לוקטור BAC, יצירת pBAC / F1 כדי pBAC / F4. שינוי (D) של cDNAs המשובט לשעתוק נגר במבחנה. pBAC / F1 SP6 הוא נגזר של pBAC / F1 שמכיל את רצף אמרגן SP6 במעלה הזרם של 5'-סוף ויראלי. pBAC / F3 KO הוא נגזר של pBAC / F3 המכיל מוטציה שקטה נקודה (9,134 → T, כוכבית). pBAC / F4 RO הוא נגזר של pBAC / F4 המכיל Xba אני מלאכותי אתר נגר במורד הזרם של 3'-סוף ויראלי. (E strong>) עצרת של באורך מלא SA 14 -14-2 BAC (pBAC / 14 SA -14-2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סינתזה של ארבעה שברי cDNA חופפים (F1 כדי F4) פורש RNA הגנומי באורך המלא של JEV SA 14 -14-2. ארבעה מוצרי RT-PCR מוערכים על ידי אלקטרופורזה בג'ל 0.8% agarose. M, סולם DNA 1 KB. הגדלים הצפויים של ארבעה שברי cDNA מסומנים בתחתית תמונת ג'ל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
טיהור איור 3. של BAC מכיל cDNA באורך מלא של 14 JEV SA -14-2. פלסמיד BAC מבודד מא coli DH10B בשיטת תמוגה SDS-בסיסית ומטוהר יותר על ידי רצועות בשיפוע CsCl-EtBr. הציג הוא דוגמא לשיפוע CsCl-EtBr באמצעות צינור פוליפרופילן סגר 16 × 76 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
סקירת איור 4. ההתאוששות של וירוסים מדבקים באורך מלא JEV SA 14 -14-2 cDNA התאסף בBAC. (א) לינאריזציה של תבנית cDNA. באורך המלא JEV BAC הוא לחתוך עםטופלתי Xba אני ועם MBN. סינתזה (ב) לתעתיקי הרנ"א. CDNA לינארית הוא עיבד על ידי RNA פולימראז SP6 בנוכחות מ '7 G (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע. (ג) שחזור של JEVs הסינתטי. במבחנה RNAs עבד הם transfected לBHK-21 תאים על ידי electroporation, אשר מייצר כייל גבוה של וירוס סינטטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. סינתזה של RNAs ידי שעתוק במבחנה באמצעות BAC JEV באורך מלא כתבנית cDNA. דור (א) לאורך המלא לינארית JEV BAC, pBAC / 14 SA -14-2. שני שיבוטים עצמאיים של pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 וCl.2) הם ינארית על ידי עיכול עם Xba אני וטיפול שלאחר מכן עם MBN. BACS ינארית נבחנים על ידי אלקטרופורזה בג'ל 0.8% agarose. הפקה (ב) לRNAs הסינתטי על ידי שעתוק נגר. כל אחד משני BACS ינארית משמש כתבנית לשעתוק ניגר RNA פולימראז SP6. Aliquots של שתי תגובות השעתוק מנוהלים על 0.6% agarose ג'ל. M, 1 KB סולם DNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. infectivity ספציפי של RNAs הסינתטי עיבד מBAC JEV באורך מלא וההתאוששות של וירוס סינטטי. BHK-21 תאים (מוק)-electroporated מדומים או electroporated עם תעתיקי הרנ"א נגזרים frאום כל אחד משני השיבוטים העצמאיים של BAC JEV באורך מלא (Cl.1 וCl.2). () Infectivity RNA. התאים הם כיסו עם agarose ומוכתם בסגולים קריסטל ב 4 ימים לאחר transfection. infectivity RNA נקבע על ידי מבחני מרכז זיהומיות כדי להעריך את הכמות של RNA זיהומיות electroporated לתוך התאים (פנל משמאל). כמו כן, נציג תמונות של מרכזי זיהומיות מוצגות (פנל מימין). ביטוי חלבון (B). התאים בתרבית שקופיות קאמריות 4 היטב. ביטוי חלבון נגיפי בתאים-electroporated RNA ב 20 שעות שלאחר transfection (HPT) מנותח על ידי מבחני immunofluorescence באמצעות antiserum עיקרי נגד ns1 ארנב וIgG העז Cy3 מצומדות- המשני נגד ארנב (אדום). הגרעינים counterstained עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (כחול). תמונות immunofluorescence הם כיסו על תמונות התערבות ההפרש לעומת זאת מקביל שלהם. תשואת וירוס (C). התאים בתרבית 150 מנות תרבות מ"מ. הייצור של virions זיהומיות שנצבר בsupernatants התרבות של תאי electroporated RNA ב 22 ו -40 HPT נבדק על ידי מבחני פלאק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי שמש בהצלחה לייצר שיבוטים cDNA זיהומיות באורך מלא לשני זנים שונים (CNU / 27 LP2 ו -14 SA -14-2 28) של JEV, flavivirus שפונקציונלי cDNA הוכיח להיות קשה מטבעו לבנות ו להפיץ בגלל רעילות תא מארח וחוסר היציבות הגנטית של cDNA המשובט 8,74-76 פרוטוקול זה כולל שלושה מרכיבים עיקריים:. ראשון, למקסם את הסינתזה / ההגברה של עותק cDNA נאמן של רנ"א הנגיפי באמצעות טרנסקריפטאז באיכות גבוהה / DNA פולימראז; שני, שיבוט האזור הנגיפי PRM-E קידוד המכיל רצפים רעילים (נתונים שלא פורסמו) 74,77,78 בBAC וקטור מספר מאוד נמוך עותק מcDNA הראשוני subcloning לצעדי ההרכבה cDNA באורך מלא הסופיים; ושלישית, ניצול BAC וקטור שיבוט שיכול להכיל דנ"א זר עם גודל של 120-350 kb, 19-21 ממוצע שככל הנראה סובל inse DNA הגדולRTS מאשר לעשות וקטורי שיבוט אחרים. גישת שיבוט זה תהיה בדרך כלל החלים רב וירוסים אחרים חיובי גדיל RNA, במיוחד אלו עם הגנום RNA גדול של ~ 10-32 קילו. דור של שיבוט cDNA זיהומיות הוא צעד מפתח בפיתוח מערכת גנטיקה הפוכה לאיתור וירוסי RNA, במיוחד לוירוסי RNA חיובי גדיל, כי הגנום שלו פועל mRNA ויראלי כמו שמתורגמת לחלבונים על ידי הריבוזומים תא מארח. לפיכך, שכפול נגיפי יכול להיות שיזם את ההקדמה של מולקולת רנ"א הגנום באורך נגזר cDNA לתוך תא מארח רגיש. הזמינות של שיבוט JEV cDNA זיהומיות, בשילוב עם טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי, גדלה ההבנה של היבטים שונים של מחזור החיים של נגיפנו ברמה המולקולרית, כגון ביטוי גנים 73,79 ושכפול הגנום. 63,64 כמו כן, באורך מלא שיבוט JEV cDNA הוכיח להיות כלי רב ערך לפיתוח של חיסונים אנטי 28 ווקטורי מסירת הגן. <sup> 80,81

כמו בכל וירוסי RNA חיובי גדיל, ישנם צעדים קריטיים מרובים בבניית cDNA הפונקציונלי אמין לJEV שממנו יכול להיות מסונתז RNAs המידבק ביותר במבחנה. באופן אידיאלי, הרצף של RNAs הסינתטי עיבד משיבוט של cDNA באורך מלא צריך להיות זהה לזה של RNA הגנומי ויראלי, במיוחד 5'- ו3'-מסוף הרצפים הנדרשים לייזום של שכפול רנ"א הנגיפי . 60-62 בפרוטוקול הנוכחי, האותנטי 5'- ו3'-קצוות היו מובטח על ידי הצבת רצף אמרגן SP6 במעלה הזרם של נוקלאוטיד אדנין הראשון של הגנום הנגיפי ומיצוב אתר הגבלה ייחודי מלאכותי Xba אני במורד זרם של האחרון נוקלאוטיד תימין של הגנום הנגיפי, בהתאמה. כתרים RNAs הסינתטי עם 5 האותנטיים 'ו 3' קצוות הופקו על ידי שעתוק נגר של te cDNA Xba אני-לינארית וטופל MBNmplate באמצעות פולימראז SP6 RNA דרוך עם G מ '7 (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע. פרוטוקול זה יכול להיות שונה בכמה דרכים. לשעתוק במבחנה, אחר RNA פולימראז bacteriophage (למשל, T3 או T7) יכול לשמש בשילוב עם רצף האמרגן המוגדר היטב שלה. 27 כאתר נגר, אתר הגבלה שונה יכול להיות מנוצל אם היא לא נמצאת ב הגנום הנגיפי ואם RNA הסינתטי מcDNA לינארית מסתיים בסופו של הדבר האותנטי 3 '. החשיבות של רצף נוקליאוטידים 3'-הסוף הודגמה על ידי ירידה ~ של פי 10 בinfectivity RNA כאשר RNA סינטטי מכיל שלושה או ארבעה נוקלאוטידים וירוס-שאינו קשור בסופה 3 ". 27 בתגובת שעתוק במבחנה, שני מ '7 G (5') PPP (5 ') ומטר 7 G (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע יכול לשמש G באותה מידה, אם כי המקומות האחרונים נוקלאוטיד G נוסף שאינו קשור במעלה הזרם של נגיפי 5 "-end, אבל שבנוסף אינו משנה את ההדבקה או שכפול של RNA הסינתטי. 27 יתר על כן, הסרת תבנית cDNA מתעתיקי הרנ"א על ידי DNase אני עיכול אין צורך לבדיקות infectivity RNA, כי תבנית cDNA עצמו אינה מדבקת. 27

טכנולוגית BAC עכשיו הוחל בבניית השיבוטים cDNA מדבקים לקומץ של וירוסים חיוביים גדיל RNA, כלומר, שתי JEVs, CNU / 27 LP2 וSA 14 -14-2 28 (גודל הגנום, ~ 11 KB); שני וירוסים דנגה, BR / 90 26 ו- NGC 29 (~ 11 KB); וירוס שלשולים הנגיפי שור, SD1 (~ 12 KB); 25 שני וירוסים קלאסיים קדחת חזירים, C ו- פאדרבורן (~ 12 KB); 24 וירוס המחלה גבול, Gifhorn (~ 12 KB); 24 וירוס תסמונת רבייה ונשימה חזירי , PL97-1 / LP1 (~ 15 KB); 30 וירוס גסטרו-ההעברה, PUR46-MAD (~ 29 KB); 16 וירוס דלקת הצפק המדבק של חתולים,DF-2 (~ 29 KB); 32 קורונה החמור החריף בדרכי הנשימה תסמונת, Urbani (~ 30 KB); 9 קורונה תסמונת הנשימה המזרח התיכון, EMC / 2012 (~ 30 KB); 17 וקורונה האנושי, OC43 (~ 31 KB) 31 היתרון העיקרי של שימוש בBACS לבניית cDNA הוא היציבות הגנטית הגבוהה של פלסמידים BAC הגדולים, 1 או 2-עותק.; עם זאת, הטבע הפנימי של מאוד נמוך העותק מספרו הוא גם חסרון גדול, בגלל תשואות נמוכות מאוד של DNA BAC וההפחתה הסוגר בטוהר של ה- DNA BAC ביחס לארח DNA כרומוזומליות. בפרוטוקול הנוכחי, התשואה של BAC DNA מוגדל על ידי גידול E. coli DH10B הפך עם pBAC BAC המדבק / 14 SA -14-2 במדיום עשיר בחומרים מזינים, 2xYT. למרות מאמץ זה, התשואה הממוצעת היא רק ~ 15 מיקרוגרם של ה- DNA BAC מ 500 מיליליטר של מרק 2xYT. כמו כן, את הטוהר של ה- DNA BAC הוא הטוב ביותר להשיג באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות CsCl-EtBr לטיהור, ולא בידוד פלסמיד המבוסס על טור הנפוץ. עם זאת, חשוב לזכור כי א-שינה BAC coli לא צריך לגדול יותר, כי זה עלול לסכן את היציבות הגנטית של cDNA המשובט, וצמיחה גבוהה יותר לא בהכרח תוביל לתשואות גדולות יותר או DNA BAC גבוה-הטוהר.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא ושיטה מותאמות, יעילים, יעילה לבנייה וההפצה של שיבוט cDNA זיהומיות יציב מבחינה גנטית באורך מלא כBAC לJEV, הליך חשב כמעט בלתי אפשרי פעם אחת. אותה אסטרטגית שיבוט זה יכול גם להיות מיושם לרב וירוסי RNA חיובי גדיל אחרים. באופן כללי, שיבוטים cDNA זיהומיות יאפשר לנו להציג את מגוון רחב של מוטציות (למשל, מחיקות, הוספות, ומוטציות נקודה) לגנום רנ"א נגיפי ללמוד פונקציות הביולוגיות שלהם בשכפול ופתוגנזה ויראלי. מערכת גנטיקה ההפוכה מבוסס cDNA זה מאפשר לפתח וTESחיסון לא ומועמדים טיפוליים מיקוד גורם ארסיות (ים) של נגיף RNA חיובי גדיל מסוים של עניין. בנוסף, טכנולוגית cDNA זיהומיות זה יכול גם לשמש כוקטור נגיפי, מסוגל להביע גן זר (ים) של עניין עבור יישומים רבים במחקר ביו-רפואי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

אימונולוגיה גיליון 106 הפוך גנטיקה cDNA זיהומיות כרומוזום בקטריאלי מלאכותי וירוס RNA תחושה חד-גדילים חיובית זיהום שכפול פתוגנזה flavivirus וירוס דלקת מוח יפני
חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter