Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriell kunstige kromosomer: En funksjonell genom Tool for studier av Positive-strand RNA virus

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

For RNA virologists, ankomsten av rekombinant DNA-teknologi på slutten av 1970-tallet har gjort det mulig å omdanne virale RNA-genomer inn i cDNA-kloner, som deretter føres videre som plasmider i bakterier for genetisk manipulering av RNA-virus. 1. Den første RNA-virus å være molekylært klonet ble bakteriofag Qp, en positiv tråd-RNA-virus som infiserer Escherichia coli. Et plasmid inneholdende en komplett cDNA-kopi av det genomiske RNA Qg ga opphav til infeksjons Qp-fag når det innføres i E. coli. 2 Kort tid deretter ble denne teknikken brukt til poliovirus, en positiv tråd-RNA-virus hos mennesker og dyr. Et plasmid som bærer en full-lengde cDNA av poliovirus genomisk RNA er infeksiøs når transfektert inn i pattedyrceller og er i stand til å produsere infeksiøse virioner 3 I denne "DNA-lanserte" tilnærming, bør de klonede cDNA'ene bli transkribert intracellulært å initiere viral RNA-replikasjon.;Imidlertid er det uklart hvordan den transkripsjon initieres og hvor transkriptene blir behandlet på riktig viral sekvens. Denne bekymringen har ført til utvikling av en alternativ "RNA-innføring av" metode, hvorved en fullstendig cDNA-kopi av det virale RNA-genom er klonet under en promoter gjenkjennes av en E. coli eller fag RNA polymerase for produksjon av syntetiske RNA in vitro med definert 5 'og 3' termini, som er gjenstand for den fullstendige virale replikasjonssyklus når introdusert inn i vertsceller. 4,5 Den første Suksessen med denne fremgangsmåten ble rapportert for brome mosaikkvirus , 6,7 en positiv tråd-RNA-virus av planter. Siden den gang har RNA-lansert tilnærming er utviklet for et bredt spekter av positive leder RNA-virus, inkludert caliciviruses, alfavirus, flavivirus, arteriviruses og coronavirus. 1,4,5,8

I både DNA- og RNA-lansert revers genetikk systemer, bygging av en full-lengde cDNA-klon er nøkkelen til å danne infeksjons DNA eller RNA av positiv-kjedede RNA-virus, men det blir et betydelig teknisk utfordring som størrelsen av virusgenomet øker. 9-17 særlig et stort RNA-genom på ~ 10 -32 kb presenterer tre største hindringer for kloning av en full-lengde cDNA-funksjonell. 18 Den første vanskelighet er syntesen av en trofast cDNA kopier, fordi nøyaktigheten av RT-PCR er omvendt proporsjonal med lengden av det virale RNA. Den andre hinderet er nærværet av potensielt toksiske sekvenser, ettersom lange RNA-molekyler er mer sannsynlig å inneholde uventede sekvenser i stand til å lage cDNA-fragmentet i plasmidene ustabile i E. coli. Den tredje og mest viktige er tilgjengeligheten av en egnet vektor, siden det er vanskelig å finne en kloningsvektor som kan huse et viralt cDNA-innskudd på> 10 kb. I løpet av de siste tre tiårene, har disse barrierene blitt overvunnet av flere fremskritt i enzymologi, metodikk, end vectorology. 1,4,5,8 Av disse er de mest lovende og innovativ utvikling kloning av store positive leder RNA-virus som smittsomme bakterie kunstige kromosomer (Bacs). BAC-vektor er en lav-kopi kloning plasmid (1-2 kopier / celle) basert på E. coli fruktbarhet faktor, med en gjennomsnittlig størrelse på DNA-innskuddet ~ 120-350 19-21 kb DNA-fragment settes inn i BAC-vektor i en lignende måte til kloning inn generelle kloningsvektorer.; de resulterende klonene BAC er stabile over flere generasjoner i E. coli. 22,23 Hittil har BAC teknologien blitt brukt til å lage smittsomme cDNA kloner for> 10 medlemmer av tre positive leder RNA virus familier, dvs. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 og Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32

Ved hjelp av japansk encefalitt virus (JEV) som et eksempel, rapporterer dette arbeidet de detaljerte prosedyrer som kan værebrukes til å konstruere et genetisk stabil full-lengde smittende BAC for en rekke positive kjedede RNA-virus. JEV er en zoonotisk flavivirus 33 som overføres i naturen mellom fugler, griser og andre virveldyr verter ved mygg vektorer. 34,35 Hos mennesker kan JEV infeksjon føre til alvorlig ofte dødelig nevrologisk sykdom japansk encefalitt (JE), 36 som forekommer i Asia og deler av det vestlige Stillehavet, 37,38 med en estimert årlig forekomst av ~ 50,000-175,000 kliniske tilfeller. 39,40 Genomet av JEV er en ~ 11 kb, enkeltrådet, positive-sense RNA-molekylet, og består av en enkelt åpen leseramme (ORF) flankert av to ikke-kodende regioner (NCR) ved 5 'og 3' ender. 41,42 ORF koder for et polyprotein som blir spaltet av verts og virale proteaser for å generere 10 individuelle proteiner, betegnet C, PRM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, og NS5 i N- til C-terminal retning. 34,43,44 Også en eXtended form av NS1 (NS1 ') uttrykkes med -1 ribosomal frameshifting i kodon 8-9 av NS2A. 45,46 Av disse 11 proteiner, de tre strukturelle proteiner (C, PRM, og E) er viktig for dannelsen av smittsomme virioner, 47,48 og de ​​resterende åtte ikke-strukturelle proteiner (NS1 til NS5, og NS1 ') er avgjørende for viral RNA-replikasjon, 49-51 partikkel montering, 52-56 og medfødt immunitet flukt. 57-59 både 5' og 3 'NCR inneholder konservert primære sekvenser og skjema RNA sekundære / tertiære strukturer, 60-62 som er viktige for å modulere viral RNA replikasjon. 63,64

Denne protokollen beskriver verktøy, metoder og strategier for å generere en full-lengde smittende BAC av JEV SA 14 -14-2. 28 Dette funksjonelle BAC klone inneholder en komplett cDNA kopi av JEV genomisk RNA, 65 som er omfattet av en promoter for SP6 RNA polymerase oppstrømsav viral 5'-enden og et unikt Xbal restriksjonssete nedstrøms for viral 3'-enden for in vitro transkripsjon avrenning. Dette BAC teknologien kan anvendes til å konstruere en fullstendig funksjonell cDNA molekylær klon for en rekke positive kjedede RNA-virus.

Protocol

Merk: Figur 1 viser en strategi for bygging av en full-lengde smittende JEV cDNA som en BAC 28 Tabell 1 gir en oversikt over de oligonukleotider som brukes i denne protokollen 28..

1. Pakk Viral RNA fra JEV Partikler i cellekultursupernatanter

  1. Start med cellekulturmedium som inneholder JEV SA 14 -14-2, en levende JE vaksinevirus som krever biosikkerhetsnivå 2 containment.
    Merk: viral titer er ca 1-3 × 10 6 plakk dannende enheter / ml.
  2. Ta biosikkerhet opplæring som er nødvendig for alle standard mikrobiologiske praksis, sikkerhetsutstyr og laboratoriefasiliteter før arbeider med JEV SA 14 -14-2.
  3. Rens viralt RNA fra en prøve av den virusholdige celledyrkingsmedium ved anvendelse av en monofasisk løsning av fenol og guanidinisotiocyanat 66 (figur 1A).
    1. Add 600 pl av reagens monofasiske til 200 pl av kultursupernatanten i et 1,7 ml mikrorør. Homogenisere blandingen ved håndhils røret kraftig i 30 sek, og inkubering i 5 minutter ved RT.
    2. Legg 160 mL av kloroform til homogenisert prøve. Bland grundig for hånd-riste røret kraftig i 15 sekunder og forlate den i 2-3 min ved RT.
    3. Sentrifuger den totale løsningen ved 13.400 x g i 15 minutter ved 4 ° C, noe som resulterer i en separasjon av to flytende faser, dvs. en nedre organisk fase, og et øvre vandig fase. Overfør den øvre vandige fase (mindre enn 200 ul) inneholdende RNA i en ny microtube.
    4. Utfelling av RNA ved tilsetning av 1 ul av 5 ug / ul glykogen og 400 ul av 100% isopropanol og inkubering i 10 minutter ved RT.
    5. Sentrifuger blandingen ved 13400 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og vask det RNA-pellet med 1 ml 75% etanol ved puls-virvling 3-5tider og sentrifugering ved 13 400 x g i 5 min ved 4 ° C.
    6. Lufttørk RNA pelleten i 10 minutter og oppløse den i 40 ul dH 2 O. Oppbevar det ekstraherte RNA ved -80 ° C inntil bruk.

2. syntetisere et sett med fire Overlapp cDNA Fragments (F1 til F4) som dekker hele Viral Genomisk RNA ved revers transkripsjon (RT) -PCR

  1. Utføre en 20 pl RT reaksjon med en 10 ul aliquot av den rensede virus-RNA som en mal og en modifisert form av Moloney murin leukemivirus revers transkriptase. 67
    1. Sett opp en 13 mL blanding som inneholder 10 mL av den rensede RNA, en ul 10 mM dNTP mix, 1 ul 4 pmol / ul primer, og en ul dH 2 O. Bruk fragment spesifikk primer for hver RT reaksjon: 1RT for F1, 2RT for F2, 3RT for F3, og 4RT for F4.
    2. Inkuber blandingen ved 65 ° C i 5 min, sted på is i 1 minutt, og deretter hurtig sentrifuge å samle Contents på bunnen av røret.
    3. Tilsett 4 mL 5 × RT buffer, en ul 0,1 M DTT, 1 ul 40 U / mL RNase inhibitor, og en ul 200 U / mL revers transkriptase. Bland ved å pipettere opp og ned tre til fem ganger.
    4. La reaksjonen foregå ved 50 ° C i 1 time, og deretter varme-inaktivering av prøven ved 70 ° C i 15 min. Oppbevar det syntetiserte første-tråd cDNA ved -20 ° C inntil bruk.
  2. Utføre en 100 pl PCR-reaksjon med en 5 ul delmengde av den varmeinaktiverte RT-reaksjonen som en mal og en hi-fi termostabil DNA-polymerase 68 (figur 1B).
    1. Sett opp en 100 pl PCR-reaksjon på is, inneholdende 5 ul av RT-reaksjonen, 20 ul 5 x PCR-buffer, 4 pl 10 mM dNTP blanding, 5 pl 10 pM forover primer, 5 ul 10 uM reverse primer, 1 ul 2 U / pl DNA-polymerase, og 60 ul dH 2 O. Bruk fragment spesifikk primer par til hver PCR reaction: 1F + 1R for F1 (2 573 bp), 2F + 2R for F2 (4171 bp), 3F + 3R for F3 (3922 bp), og 4F + 4R for F4 (1798 bp).
    2. Bland forsiktig ved å snu finger røret tre til fem ganger og sentrifuger lett for å samle innholdet i bunnen.
    3. Termosyklisk begynne med en innledende denatureringstrinn på 30 sek ved 98 ° C, etterfulgt av 25-30 sykluser med følgende PCR-profil: 10 sek ved 98 ° C, 30 sek ved 60 ° C og 1-2 min (30 s / kb) ved 72 ° C. Oppbevar PCR-produktene ved 4 ° C inntil analyse.
  3. Kjør en 2-5 ul alikvot av hver PCR-reaksjon på en 0,8% agarosegel inneholdende 0,5 ug / ml etidiumbromid (EtBr) (figur 2).
    FORSIKTIG: EtBr er en potent mutagen og krever lab strøk, vernebriller og hansker for å bli slitt og ekstrem forsiktighet for å bli observert under bruk, lagring og avhending.

3. subklon Hver av de fire cDNA Fragments (F1 til F4) i en BAC Vector å lage pBAC / F1 til pBAC / F4 by molekylær kloning Teknikker

  1. Fordøye vektor og sette inn DNA med to passende restriksjonsendonukleaser, som følger:
    1. Utføre en sekvensiell spalting av pBAC / PRRSV / FL (vektor), 30 et derivat av pBeloBAC11 plasmid (7507 bp, GenBank tilgangsnummer U51113), med PME I og Not I i et totalvolum på 60 ul (inneholdende ~ 500 ng DNA , 10 U enzym, 1x fordøyelse buffer, og 1 x BSA) ved 37 ° C i 12-15 timer, som gir det 15 426-bp vektorfragment.
    2. Utføre en sekvensiell fordøyelse av hver av de fire cDNA-amplikoner (sett) med Sma I og Not I i et totalvolum på 60 ul (inneholdende ~ 1 pg DNA, 20 U enzym, 1 x fordøyelse buffer, og 1 x BSA) ved 25 ° C (Smal) eller 37 ° C (Not I) for 12 til 15 timer, noe som gir de følgende innsats fragmenter av den ønskede størrelse: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), og F4 (1784 bp).
  2. Renseønsket vektor og sett DNA-fragmenter av gel utvinning.
    1. Separer dobbelt fordøyd produktene på en 1% lavt smeltepunkt agarosegel inneholdende 0,5 ug / ml EtBr. Skjær ut et bånd av det ønskede DNA-fragment med en minimal mengde av agarose (vanligvis ~ 200 mL) under langbølget ultrafiolett lys.
    2. Legge til et likt volum av TEM-buffer (10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA, og 10 mM MgCl2) til det utskårede agarose i en 1,7 ml mikrorør. Inkuber prøven ved 72 ° C i 10-15 min, med virvling hvert 2-3 min inntil agarose er fullstendig smeltet.
    3. Legge til et likt volum av forvarmet buffer-mettet fenol, vortex kraftig i 1 min, og sentrifuger ved 13 400 x g i 10 minutter ved RT.
      Merk: Blandingen skiller seg i en nedre organisk fase, og et øvre vandig fase. Overfør den øvre vandige fasen inneholdende DNA i et nytt microtube.
    4. Legge til et like stort volum av kloroform: isoamylalkohol (24: 1), vortex i 1 minutt, og sentrifuger ved 13,400 x g i 10 minutter ved RT. Overfør den øvre vandige fasen til en ny microtube.
    5. Tilsett 0,5 ul 10 ug / ul gjær tRNA, 1/10 volum av 3 M natriumacetat, og 2,5 volumer 100% etanol. Holde blandingen på is i 20 min.
    6. Sentrifuger blandingen ved 13400 x g i 10 minutter ved RT. Fjern supernatanten og vask det DNA-pellet med 1 ml 70% etanol ved puls-virvling tre til fem ganger, og sentrifugering ved 13 400 x g i 10 min.
    7. Luft-tørke DNA-pelleten i 10 minutter og oppløse den i 20 ul TE-buffer (10 mM Tris-Cl og 1 mM EDTA [pH 7,6]).
  3. Ligere ønsket vektor og sette inn DNA-fragmentene ved anvendelse av T4 DNA-ligase.
    1. Sett opp en 20 pl ligeringsreaksjon inneholdende 50 til 100 ng av vektor-DNA, en ~ 3-gangers molart overskudd av innskudd-DNA, 400 U T4 DNA-ligase, og 1 x ligeringsbuffer. Inkuber ligeringsreaksjonen ved 16 ° C i 12-15 timer.
      Merk: Ta med en negativ kontrol reaksjon, dvs. vektoren bare uten innsatsen, parallelt.
    2. Utfør fire separate ligations, hvert begynte i 15 426-bp PME I- Ikke jeg fragment av pBAC / PRRSV / FL med 2559-bp (for F1), 4157-bp (for F2), 3908-bp (for F3), eller 1784-bp (for F4) Sma I- Not I fragment av en av de fire cDNA-amplikoner, for å generere subkloner pBAC / F1 til pBAC / F4.
  4. Forvandle ligert DNA inn i E. coli DH10B av CaCl 2-varme sjokk metode.
    1. Ta 100 ul prøver av CaCl2 -behandlet kompetente DH10B-celler 69 lagret ved -80 ° C og tine dem på is.
      Merk: Bruk 100 mL av celler per transformasjon.
    2. Legg til en 10 ul alikvot av DNA-ligeringsreaksjon til 100 pl av de tinte celler i en 1,7 ml mikrorør, bland forsiktig ved å banke på røret, og holder på is i 30 min.
    3. Varmesjokk-DNA-celleblandingen i 45 sekunder i et 42 ° C water bad, legg på is i 2 minutter, og deretter legge til 900 mL av LB buljong forvarmet til RT.
    4. Inkuber de varmesjokkerte celler ved 35 ° C i 1 time, med risting ved 225 til 250 rpm.
    5. Spre 50 til 200 pl aliquoter av de dyrkede celler i LB-agarplater inneholdende 10 ug / ml kloramfenicol (CML). Hold platene på RT, høyre side opp, til de er tørre.
    6. Snu platene opp ned og inkuber ved 35 ° C i 15 timer.
  5. Gjenvinne den klonede BAC DNA fra vertscellene ved en kolonne-baserte rensemetode (figur 1C).
    1. Pick seks til åtte bakteriekolonier fra LB-agarskåler og CML inokulere dem i 3 ml 2 x YT-buljong inneholdende 10 ug / ml CML. Inkuber kulturene ved 35 ° C i 10 timer med kraftig risting (225-250 rpm).
    2. Isolere rekombinant BAC DNA 1 til 1,5 ml av bakteriekulturer ved hjelp av sentrifugekolonner, som anvist av produsenten. 70 Elute den utpakkede DNA (typitisk 100-200 ng) i 20 pl TE-buffer.
    3. Utføre to analytiske restriksjonsenzym-digereringer av de isolerte BACS for ~ 6 timer i et totalvolum på 10 ul, en for å identifisere tilstedeværelsen av vektoren med en korrekt innsats ved hjelp av de samme enzymene som brukes for kloning (se Protocol 3,1), og den annen for å teste integriteten til de klonede BACS med et egnet enzym (f.eks, Bgl II, Ncol, og Pst I), å generere et unikt restriksjonsfragment mønster.
    4. Forplante riktig klonede BACS ved inokulering av 500 mL av de positive bakteriekulturer (fra Protocol 3.5.1) i 500 ml 2 x YT-medium KML og dyrking av inokulum i 6 timer ved 35 ° C under risting ved 225 til 250 rpm. Rens BAC-DNA (vanligvis 10 til 20 mikrogram) fra 500 ml kultur ved hjelp av filterkolonner, som anbefalt av produsenten. 71
      Merk: De første fire BAC subkloner, som hver inneholder en cDNA fragment av JEV genomisk RNA, kan vise seg å ha påe eller mer uønsket mutasjon (er) i forhold til konsensussekvensen av virusgenomet 42 (som tjener som en referansesekvens). Enhver slik mutasjon må rettes opp ved PCR-basert nettsted rettet mutagenese før montering av en full-lengde JEV cDNA. 27

4. Lag en full-lengde JEV cDNA med 5 'SP6 arrangøren og 3' Run-off nettstedet

  1. Lag tre genetiske modifikasjoner (se nedenfor Protocols 4.1.1-4.1.3) i de klonede cDNA-er for å tillate in vitro avrenning transkripsjon av genom-lengde RNA med autentisk 5 'og 3'-endene av det virale genom.
    1. Innføre en SP6 promoter direkte oppstrøms for 5'-ende av det virale genomet ved PCR-overlappsforlengelses (figur 1D, pBAC / F1 SP6).
      1. Forsterke to overlappende DNA-fragmenter via den første standard PCR av pBAC / F1 med de to primerparene SP6F + SP6R (produkt størrelse, 173 bp) og F1F + F1R (produkt size, 676 bp), hvert i en 50 pl reaksjon inneholdende 1 pl templat DNA (~ 200 pg / pl), 10 pl 5 x PCR-buffer, 2 pl 10 mM dNTPs, 2,5 ul av hver av 10 uM forover og revers primere, 0,5 ul 2 U / mL DNA polymerase, 68 og 31,5 mL dH 2 O. Utføre PCR ved anvendelse av følgende sykkelprofil: 98 ° C i 30 sek, og 25 sykluser av 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 20 sek.
      2. Gel-rense de to PCR-amplifiserte DNA-fragmenter etter å ha kjørt hvert av de to PCR-produkter på en 1,5% lavt smeltepunkts agarosegel, som beskrevet i protokoll 3,2.
      3. Smelte de to gel-renset DNA-fragmenter via den andre fusjons PCR ved hjelp av den ytterste primere SP6F + F1R (produkt størrelse, 821 bp) i en 100 ul reaksjon med 1 pl av hver av de to rensede DNA-fragmenter (~ 100 pg / mL), 20 ul 5 × PCR buffer, 4 pl 10 mM dNTPs, 5 pl hver på 10 mikrometer forover og bakover primere, 1 mL2 U / mL DNA polymerase, 68 og 63 mL dH 2 O. Bruk følgende termiske sykluser profil: 98 ° C i 30 sek, og 25 sykluser av 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek.
      4. Gel-rense smeltet PCR-fragment fra en 1% lavt smeltepunkts agarosegel, som beskrevet i protokoll 3,2.
      5. Utfør fem-trinns kloningsfremgangsmåten beskrevet i protokoll 3,1 til 3,5 for å ligere det 760-bp pac I- Bsi WI fragment av gelrenset PCR-fragment sammensmeltet med det 9532 bp-Pac I- Bsi WI-fragmentet av pBAC / F1 å generere pBAC / F1 SP6.
    2. Ta av pre-eksisterende, intern Xba stedet ved nukleotid 9131 ved å innføre en stille punktmutasjon (A 9134 → T) via overlapping utvidelse PCR (figur 1D, pBAC / F3 KO).
      1. Forsterke to overlappende DNA-fragmenter av den første standard PCR av pBAC / F3 med to primerparene X1F + X1R(produkt størrelse, 746 bp) og X2F + X2R (produkt størrelse, 316 bp) i en 50 mL reaksjon under eksperimentelle forhold som er beskrevet i protokoll 4.1.1.1.
      2. Gel-rense de to PCR-amplifiserte DNA-fragmenter etter elektroforetisk separasjon i 1,5% lavt smeltepunkt agarosegeler, som beskrevet i protokoll 3,2.
      3. Smelte de to gel-renset DNA-fragmenter via den andre fusjons PCR ved bruk av primerne ytterste X1F + X2R (produktstørrelse, 1033 bp) i en 100 ul reaksjon under de eksperimentelle betingelser som er beskrevet i protokoll 4.1.1.3.
      4. Gel-rense smeltet PCR-fragment fra en 1% lavt smeltepunkts agarosegel, som beskrevet i protokoll 3,2.
      5. Utfør fem-trinns kloningsfremgangsmåten beskrevet i protokoll 3,1-3,5 for å ligere det 949-bp Avr II-Notl-fragment av den gelrensede PCR-fragment sammensmeltet med 16 245-bp NotI-Bsi WI, og 2141 bp-Bsi W I - Avr II fragmenter av pBAC / F3 å produsere pBAC / F3 KO.
      </ li>
    3. Konstruere en ny kunstig Xbal avrenning sete umiddelbart nedstrøms for 3'-enden av det virale genomet ved PCR-basert seterettet mutagenese (figur 1D, pBAC / F4 RO).
      1. Generere et DNA fragment av PCR av pBAC / F4 med grunning ROF + ROR (produkt størrelse, 324 bp) i en 100 mL reaksjon inneholder en fil mal DNA (~ 200 pg / mL), 20 ul 5 × PCR buffer, 4 pl 10 mM dNTPs, 5 ul hver på 10 mikrometer forover og bakover grunning, en ul 2 U / mL DNA polymerase, 68 og 64 mL dH 2 O. Utføre PCR ved anvendelse av følgende sykkelprofil: 98 ° C i 30 sek, og 25 sykluser av 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 15 sek.
      2. Gel-rensing av PCR-amplifisert DNA-fragment fra en 1% lavt smeltepunkts agarosegel, som beskrevet i protokoll 3,2.
      3. Utfør fem-trinns kloning prosedyre beskrevet i protokoll 03.01 til 03.05 for å ligere 283-bp Sfi I- Not-fragment av det gelrensede PCR-fragment med en 16 933-bp Sfi I-NotI-fragmentet fra pBAC / F4 for å skape pBAC / F4 RO.
  2. Sett sammen et sett av de fire modifiserte, overlapp cDNAs inn i en enkelt full-lengde SA 14 -14 til 2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) ved å bli med på tre naturlige restriksjonssetene (BSR GI, Bam HI, og Ava jeg ) på en trinnvis måte under anvendelse av den fem-trinns kloning beskrevet i Protocols 3.1 til 3.5 (figur 1E): F1 SP6 → SP6 F1 F2 (ved å erstatte Bsr G I- Not I fragment fra pBAC / F1 SP6 med den av pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (ved å erstatte Bam H I- Ikke jeg fragment av pBAC / F1 SP6 F2 med at av pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (ved å erstatte Ava I- Ikke jeg fragment av pBAC / F1 SP6 F2F3 KO med at av pBAC / F4 RO).

5. Forbered en høy renhet Maxi-prep av Full-lengde SA 14 -14 til 2 BAC

  1. Dyrk en enkelt koloni av E. coli DH10B bærer pBAC / SA 14 -14-2 i 3 ml av 2 x YT-medium inneholdende 10 ug / ml CML i 10 timer ved 35 ° C med risting ved 225 til 250 rpm, og deretter skaleres opp ved å inokulere 500 pl av 10 hr bakteriekultur i 500 ml 2 x YT-medium KML og dyrking av inokulum i 6 timer ved 35 ° C med kraftig risting.
  2. Sentrifuger bakteriekultur i to 250 ml flasker ved 3107 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Resuspender hver pellet i 30 ml GTE-løsning (50 mM glukose, 25 mM Tris-Cl, og 10 mM EDTA [pH 8,0]), og deretter legge til 500 ul av 60 mg / ml lysozym. Inkuber de to cellesuspensjoner på is i 10 min.
  3. Legg 60 ml nylaget Lysis løsning (0,2 N NaOH og 1% SDS) til hver celle suspensjon, bland godt til klar, og holde lysateneved RT i 10 min.
  4. Legg 45 ml Nøytralisering oppløsning (100 ml, bestående av 60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml iseddik og 28,5 ml dH 2 O) til hver flaske, blandes grundig ved å snu flaskene, og inkuber nøytraliserte lysatene på is i 10 min.
  5. Sentrifuger nøytraliserte lysatene ved 18 566 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten av både flasker i to nye 250 ml flasker; legge til 0,6 volum av 100% isopropanol til hver, og holde dem på is i 20 min.
  6. Spinne ned utfellinger ved 18566 x g i 20 min ved 4 ° C. Løs opp hver pellet i 5 ml TE-buffer, kombinere dem i et 50 ml rør (10 ml totalt), og utfelle RNA ved å tilsette et likt volum av 5 M litiumklorid. Inkuber blandingen på is i 10 min.
  7. Sentrifuger RNA-bunnfallet ved 14 636 x g i 20 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nytt rør 250 ml og utfelles DNA ved tilsetning av 2 volumdeler av 100% isopropanol.Inkuber blandingen på is i 20 min.
  8. Spinne ned DNA-utfellingen ved 18566 x g i 20 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten, resuspender den DNA-pelleten i 9,5 ml TE-buffer (pH 7,6), og tilsett 10 g cesiumklorid (CsCl) og 390 pl av 10 mg / ml EtBr.
  9. Laste DNA-CsCl-EtBr løsning i en 16 × 76 mm lukkbar polypropylen rør ved hjelp av en sprøyte utstyrt med en 18 G nål. Spinn forseglet CsCl-gradient i en ultrasentrifuge ved 401 700 x g i 16 timer ved 20 ° C (figur 3).
  10. Samle en DNA bånd av BAC plasmid fra CsCl-gradient ved å bruke en 18 G nål for å skape en luftventil på toppen av gradienten og en 20 G nål utstyrt sprøyte for å hente BAC DNA fra siden av gradienten.
  11. Legg 2,5 volumer dH 2 O-butanol mettet med EtBr-farget BAC DNA-prøven, og bland ved virvling. Sentrifuger blandingen ved 13 400 x g i 1 minutt og overføre den nedre vandige fase i et nytt 1,7 ml microtube. Gjenta denne prosedyren seks ganger.
  12. Utfelling av EtBr-frie BAC-DNA ved å tilsette 1/10 volum av 3 M natriumacetat, og 2,5 volumer 100% etanol til butanol-ekstrahert BAC DNA og inkubering i 10 min på is. Fellingen sentrifugeres ved 13 400 x g i 10 minutter, vaske DNA pellet med 1 ml 70% etanol, og re-pelletere det ved sentrifugering.
  13. Luft-tørke DNA-pelleten i 10 minutter og oppløse den i 200 ul TE-buffer (pH 7,6).
    Merk: Figur 4 viser en oversikt over revers genetikk system for JEV SA 14 -14-2.

6. Transkriber Syntetiske RNA in vitro fra en Linearisert Hellang JEV BAC DNA

  1. Utføre en stor-skala restriksjonsenzymspaltning av pBAC / SA 14 -14-2 med Xbal i et totalt volum på 100 ul (inneholdende 3 pg DNA, 60 U enzym, 1 x fordøyelse buffer, og 1 x BSA) ved 37 ° C i 12-15 timer. Undersøke en 3 ul alikvot av digestion reaksjon på en 0,8% agarosegel inneholdende 0,5 ug / ml EtBr.
  2. Inkuber nedbrytningsreaksjonen ytterligere med 25 U av mung bønne nuklease (MBN) ved 30 ° C i 2 timer (figur 4A).
  3. Bring volumet til Xba I-spaltet, MBN-behandlede prøve opp til 300 mL med dH 2 O. Legge til et likt volum av fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til den fortynnede prøven, vortex kraftig i 1 min, sentrifugering ved 13 400 x g i 10 minutter, og deretter overføre den øvre vandige fasen til et nytt 1,7 ml microtube. Legge til et like stort volum av kloroform, og gjenta fremgangsmåten ekstraksjon.
  4. Gjenopprette den fenol / kloroform-ekstrahert, linearisert BAC ved etanolfelling: Legg 1/10 volum av 3 M natriumacetat, og 2,5 volumer 100% etanol, og inkuber på is i 20 min. Fellingen sentrifugeres ved 13 400 x g i 10 minutter, vaske DNA-pellet med 1 ml 70% etanol, og deretter spinner den ned ved å re-sentrifugering.
  5. Luft-tørke DNA pellet i 10 minutter og oppløse den i 30 pl av dH 2 O. Undersøke en 1 pl aliquot av den gjenvundne BAC på en 0,8% agarose-gel med 0,5 ug / ml EtBr (figur 5A).
  6. Utfør en run-off transkripsjon av lineariserte BAC-DNA i et totalt volum på 25 ul (inneholdende ~ 200 ng templat-DNA, 0,8 mM cap analog [m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTP, 40 U RNase-inhibitor, 20 U SP6-RNA-polymerase, 72 og 1 x transkripsjonsbuffer) ved 37 ° C i 1 time (figur 4B). Omfatte 0,5 uM [3H] UTP for RNA kvantifisering på basis av [3H] UTP innlemmelse, som overvåkes ved adsorpsjon til DE-81 filterpapir. 69
  7. Kjør en 1-2 ul alikvot av run-off transkripsjonsreaksjon på en 0,6% agarosegel inneholdende 0,5 ug / ml EtBr (figur 5B).

7. Bestem RNA Infeksjons og Virus Yield

  1. Dyrke BHK-21 celler i 150 mm Culture retter ved en tetthet på 3 x 10 til 6 celler / skål i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
    Merk: Vedlikehold BHK-21-celler i alfa-minimalt essensielt medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, vitaminer, og penicillin / streptomycin.
  2. Skyll cellemonolaget med 10 ml kald Løsning A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na HPO 2 til 4, og 1,5 mM KH 2PO 4). Løsne cellene fra de retter ved behandling med 4 ml av trypsin-EDTA (0,25%), og samle dem ved sentrifugering ved 270 x g i en stasjonær sentrifuge i 2 min.
  3. Resuspender cellepelleten med 50 ml kald løsning A i et 50 ml konisk rør og sentrifuger cellesuspensjonen ved 270 x g i 2 min. Gjenta dette vaskeprosedyren tre ganger; etter siste vask, cellepelleten suspenderes i en tetthet på 2 x 10 7 celler / ml i Sol A.
  4. Bland en 400 mL delmengde av cellesuspensjon med to μg av syntetisk RNA i en 2-mm gap kuvette, og straks electroporate av blandingen med en electroporator under optimale betingelser electroporation: 980 V, 99 usek pulslengde, og 5 pulser (Figur 4C).
    Merk: Bruk 3 H-merket RNA syntetiseres i protokoll 6.5 direkte for elektroporering uten ytterligere rensing.
  5. La de elektroporerte celler ved RT i 10 min og overfør til en 1,7 ml mikrorør inneholdende 600 ul av fullstendig kulturmedium.
  6. Fremstille en 10-gangers seriefortynning av de elektroporerte cellene i 1 ml fullstendig dyrkingsmedium, og en plate 100 ul alikvot av hver fortynning på monolag av unelectroporated BHK-21-celler (5 x 10 5) i en 6-brønns plate.
  7. Etter 4-6 timers inkubasjon overlapper cellene med 0,5% agarose i minimalt essensielt medium inneholdende 10% føtalt bovint serum. Platene inkuberes i 4 dager ved 37 ° C med 5% CO2.
  8. Visual den smittsomme sentrums (plaques) ved fiksering med 7% formaldehyd og farging med 1% krystallfiolett i 5% etanol 27 (figur 6A).
    1. Valgfritt: Undersøk RNA-elektroporert celler på 18-20 timer etter transfeksjon for JEV protein uttrykk ved immunfluorescens analyser 27,73 (Figur 6b), og høste Supernatantene fra RNA-elektroporert celler ved 22 og 40 timer etter transfeksjon for virus titrering av plakk analyser 27,63 (figur 6C).

Representative Results

For alle positive-tråd RNA-virus, påliteligheten og effektiviteten til en revers genetikk-system avhenger av den genetiske stabiliteten til et klonet full-lengde cDNA, hvis sekvens er ekvivalent med konsensussekvensen av viralt genomisk RNA. 27 Figur 1 viser en fem- trinns strategi for bygging av en full-lengde smittende cDNA som en BAC for JEV SA 14 -14-2 28: Trinn 1, rensing av viral RNA fra cellekultursupernatanten av JEV-infiserte BHK-21 celler (Figur 1a); Trinn 2, syntese av fire overlapp cDNA amplikonene (F1 til F4) spenner over hele viral genom (figur 1B); Trinn 3, subkloning av hver av de fire sammenhengende cDNA-fragmenter inn i en BAC-vektor, som skaper pBAC / F1 til pBAC / F4 (figur 1C); Trinn 4, endring av klonede cDNAs for in vitro avrenning transkripsjon med SP6 RNA polymerase, dvs. plassere en SP6promotorsekvens umiddelbart oppstrøms for viral 5'-enden (pBAC / F1 SP6), å eliminere en pre-eksisterende interne Xba I setet ved nukleotid 9131 ved å innføre en punktmutasjon stille, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), og innsetting en ny kunstig Xbal run-off-sete umiddelbart nedstrøms for viral 3'-enden (pBAC / F4 RO) (figur 1D); og trinn 5, montering av en full-lengde SA 14 -14 til 2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figur 1E). Tabell 1 viser oligonukleotider som brukes i denne kloning prosedyren. 28

For bygging av en funksjonell JEV cDNA, er det første viktige trinnet ved syntesen av de fire overlappende cDNA-fragmenter ved hjelp av den rensede virus-RNA som et templat for RT-PCR. Figur 2 gir et representativt resultat for de fire RT-PCR-produkter som var underkastet elektroforese på en 0,8%agarose gel. Denne gel viser tydelig at en full-lengde JEV cDNA forsterkes i fire overlapp cDNA fragmenter. Av og til kan RT-PCR-reaksjoner gi en eller flere ytterligere virus-spesifikke eller ikke-spesifikke produkter som er hovedsakelig mindre enn det forventede produkt, på grunn av den ikke-spesifikke annealing av primerne i løpet av cDNA-syntese / forsterkning. På den annen side er liten eller ingen forventede RT-PCR-produkt ville bli forsterket på grunn av utilsiktet RNase forurensning under det virale RNA isolering eller feilfunksjon i RT-PCR.

Den neste viktige trinn er kloning og modifikasjon av en partial- eller full-lengde cDNA JEV i BAC, som er en relativt enkel fremgangsmåte som bruker standard rekombinante DNA-teknikker. 69 Figur 3 viser et representativt resultat for rensing av BAC-klon innehold en full-lengde cDNA av JEV SA 14 -14 til 2 av banding i en CsCl-EtBr gradient.I dette eksperimentet ble, etter sentrifugering i 16 timer ved 401 700 x g, to distinkte bånd, dvs. E. coli-kromosomalt DNA ovenfor, og supercoil BAC plasmid DNA nedenfor, er synlig i midten av røret ved langbølget ultrafiolett lys. Et minimalt volum (~ 400 ul) av den nedre BAC DNA bånd ble omhyggelig samlet opp ved å stikke et hull med en sprøyte på siden av røret. Deretter ble EtBr ekstrahert fra BAC-DNA ved hjelp av butanol ekstraksjon, og EtBr-frie BAC DNA ble konsentrert ved etanolutfelling.

Det siste trinnet er å bestemme den spesifikke smittsomhet av de syntetiske RNA transkribert in vitro fra full-lengde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) etter at RNA-transfeksjon inn i permissive celler (figur 4). Dette trinnet omfatter tre sekvensielle trinn: Trinn 1, linearisering av fullengde SA 14 -14-2 cDNA ved 3'--enden av det virale genom (figur 4A); Trinn 2, produksjon av syntetiske RNA fra linearized cDNA ved avrenning transkripsjon (4B); og trinn 3, redning av de rekombinante virus i BHK-21-celler transfektert med de syntetiske RNA (Figur 4C). Eksperimentelt, ble to uavhengige kloner av pBAC / SA 14 -14-2 linearisert med Xbal fordøyelse og behandlet med MBN å fjerne fire-base-5 'overhenget som genereres av Xbal fordøyelsen. De lineariserte BACS ble ryddet av fenol-kloroform ekstraksjon, etterfulgt av etanol nedbør. Linearisering av de to rensede BACS ble demonstrert på en 0,8% agarose-gel (figur 5A). Fenol-kloroform-ekstraksjon må gjøres forsiktig for å sikre at de lineariserte BACS er RNase-fri. Hver av de to lineariserte BACS tjente som et templat for cDNA avviklings transkripsjon ved hjelp av SP6 RNA-polymerase i nærvær av 7 G m (5 ') ppp (5') En hette analog. Integriteten av de syntetiske RNA ble vist ved å kjøre prøver av de to transkripsjonsreaksjonsblandinger på en 0,6% agarose-gel, sammen med et referanse 1 kb DNA-stige (figur 5B). I dette enkle analysen, som utgjør hoved fremtredende RNA bånd alltid overført bare under 3 kb referere DNA band og så ut til å være skarp. Imidlertid nedbrytes RNA ville ha en utflytende utseende på den samme gel.

En smittsom sentrum analysen er gullstandarden for å fastsette den konkrete smittsomhet av de syntetiske RNA. Denne analysen ble gjort ved electroporating BHK-21-celler med RNA prøver, såing like store porsjoner av 10-ganger seriefortynnet elektroporerte celler i 6-brønners plater inneholdende naive BHK-21-celler (3 x 10 5 celler / brønn), og overliggende agarose på cellemonolagene. Etter inkubering i 4 dager ble overlevende celler fiksert med formaldehyd og farget med et krystallfiolett solution å kvantifisere antallet av infeksjonssentre (plaques), som svarer til antallet smittsomme RNA-molekyler som leveres inn i celler (figur 6A). Siden cDNA-mal som brukes for in vitro transkripsjon har vist seg å være ikke-infeksiøst, ble 27 en prøve av transkripsjonsreaksjonsblanding anvendes direkte for elektroporering. Elektroporering er den foretrukne metode for RNA-transfeksjon; Alternativt kan RNA bli transfektert ved andre fremgangsmåter ved bruk av DEAE-dekstran og kationiske liposomer. RNA elektroporasjon er meget effektiv, men "overslag" av den elektriske puls opptrer sjelden, hvis salter er til stede i electroporation reaksjonen eller hvis elektroporeringskyvette anvendes på nytt. Ekspresjon av virusproteiner i RNA-transfekterte celler ble undersøkt ved immunfluorescens analyser ved anvendelse av et anti-NS1 kanin-antiserum (figur 6B). Produksjon av viruspartikler akkumulert i supernatantene av RNA-transfekterte celler var enalyzed av plakk analyser (figur 6C). Resultatene fra disse forsøk viser klart at cDNA-avledede syntetiske RNA er infeksiøs i permissive BHK-21-celler, å generere en høy titer av rekombinante virus.

Oligonukleotid En sekvens (5 'til 3') Posisjon b Polaritet
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense-
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 Sans
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense-
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 Maurisense
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Sans
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense-
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense-
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Sans
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense-
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10952-10977 Antisense-
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Sans
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10.956 til 10977 Antisense-
SP6F cataccccgcgtattcccac
TA 		Sans
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisense-
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 Sans
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense-
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Sans
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense-
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Sans
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense-
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10670-10694 Sans
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10954-10977 Antisense-
en JEV sekvensene vises i store bokstaver, og BAC sekvenser er angitt i små bokstaver.
b nukleotidposisjon refererer til hele genomsekvens av JEV SA 14 -14-2 (Genbank tiltredelse antall JN604986).

Tabell 1: Oligonukleotider anvendt for cDNA-syntese, PCR-amplifikasjon, og BAC mutagenese.

Figur 1
Figur 1.0; Strategi for bygging av en full-lengde cDNA av JEV SA 14 -14-2 som en BAC (A) Isolering av viral RNA fra JEV partikler.. Det er vist et skjematisk diagram av det genomiske RNA til JEV SA 14 -14-2. (B) Syntese av fire overlappende cDNA-fragmenter (F1 til F4) som dekker hele virale genom. (C) Subkloning av fire overlapp cDNA fragmenter inn i en BAC vektor, skape pBAC / F1 til pBAC / F4. (D) Modifisering av de klonede cDNAs for avrenning transkripsjon in vitro. pBAC / F1 SP6 er et derivat av pBAC / F1 som inneholder SP6 promoter-sekvensen oppstrøms for viral 5'-enden. pBAC / F3 KO er et derivat av pBAC / F3 som inneholder en stille punktmutasjon (A 9134 → T, stjerne). pBAC / F4 RO er et derivat av pBAC / F4 som inneholder en kunstig Xbal run-off-setet nedstrøms for den virale 3'-enden. (E strong>) Montering av en full-lengde SA 14 -14 til 2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Syntese av fire overlapp cDNA fragmenter (F1 til F4) spenner over full-lengde genomisk RNA av JEV SA 14 -14-2. De fire RT-PCR-produktene evalueres ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. De forventede størrelser av de fire cDNA fragmenter er indikert på bunnen av gelen bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
Figur 3. Rensing av BAC inneholder en full-lengde cDNA av JEV SA 14 -14-2. Er BAC plasmid isolert fra E. coli DH10B ved SDS-alkaliske lyseringsmetode og ytterligere renset ved hjelp av striper på en CsCl-EtBr gradient. Presenteres er et eksempel på CsCl-EtBr gradient ved hjelp av en 16 × 76 mm forseglbart polypropylen rør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Oversikt over utvinning av infeksiøse virus fra en full-lengde JEV SA 14 -14-2 cDNA satt sammen i en BAC. (A) Linearisering av cDNA templat. The full-lengde JEV BAC er kuttet medXbal og behandlet med MBN. (B) Syntese av RNA-transkripter. Det lineariserte cDNA transkribert ved SP6-RNA-polymerase i nærvær av 7 G m (5 ') ppp (5') A cap-analog. (C) Gjenoppretting av syntetisk JEVs. In vitro transkriberte RNA transfektert inn BHK-21 celler ved elektroporering, som genererer en høy titer av syntetisk virus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Syntese av RNA ved in vitro transkripsjon ved hjelp av en full-lengde JEV BAC som et cDNA mal. (A) Generering av det lineariserte helaftens JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. To uavhengige kloner av pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 og Cl.2) blir linearisert ved spaltning med Xbal og påfølgende behandling med MBN. De lineariserte BACS blir undersøkt ved hjelp av elektroforese på en 0,8% agarosegel. (B) Produksjon av syntetiske RNA ved avrenning transkripsjon. Hver av de to lineariserte BACS brukes som en mal for SP6 RNA polymerase avrenning transkripsjon. Alikvoter av de to transkripsjonsreaksjoner blir kjørt på en 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Spesifikk smittsomhet av de syntetiske RNA transkribert fra en full-lengde JEV BAC og utvinning av syntetisk virus. BHK-21 celler er mock-elektroporert (Mock) eller elektroporert med RNA transkripsjoner avledet from hver av de to uavhengige kloner av full lengde JEV BAC (Cl.1 og Cl.2). (A) RNA smittsomhet. Cellene ble belagt med agarose og farget med krystallfiolett i 4 dager etter transfeksjon. RNA infektivitet er bestemt av smittsomme midt assays for å estimere mengden av infeksiøs RNA elektroporert inn i de celler (venstre panel). Dessuten er representative bilder av smittsomme sentre vist (høyre panel). (B) Protein ekspresjon. Cellene blir dyrket i 4-brønners kammerobjektglass. Viralt protein ekspresjon i RNA-elektroporert celler ved 20 timer etter transfeksjon (HPT) analyseres ved hjelp av immunofluorescens-analyser ved anvendelse av et primært anti-kanin-antiserum NS1 og en sekundær Cy3-konjugert geit-anti-kanin-IgG (rød). Kjernene er kontrafarget med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (blå). De immunfluorescens bildene kledde på sine tilsvarende differensial bilder kontrast forstyrrelser. (C) Virus yield. Cellene blir dyrket i ett50 mm kultur retter. Produksjonen av smittsomme viruspartikler akkumulert i kultursupernatantene av RNA-elektroporert celler på 22 og 40 HPT er undersøkt av plakk analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den nåværende protokoll har blitt brukt til å generere full-lengde cDNA-kloner for infeksiøse to forskjellige stammer (CNU / LP2 27 og SA 14 28 -14-2) av JEV, en flavivirus som funksjonell cDNA har vist seg å være iboende vanskelig å konstruere og forplante grunn av vertscellen toksisitet og genetisk ustabilitet i klonet cDNA 8,74-76 Denne protokollen omfatter tre hovedkomponenter:. første, maksimere syntese / forsterkning av en trofast cDNA kopi av viral RNA ved hjelp av high-fidelity reverstranskriptase / DNA polymerase; andre, kloning av virale PRM-E-kodende region inneholder giftige sekvenser (upubliserte data) 74,77,78 i et meget lavt kopitall vektor BAC fra den første cDNA subkloning til de endelige full-lengde cDNA monteringstrinn; og tredje, utnytte en kloningsvektor BAC som kan huse en fremmed DNA med en gjennomsnittlig størrelse på 120-350 kb, 19-21 som tilsynelatende tåler større DNA inserts enn andre Kloningsvektorene. Denne kloning tilnærming vil være generelt anvendelig for mange andre positive-strand RNA-virus, spesielt de med et stort RNA genomet til ~ 10 til 32 kb. Generering av en smittsom cDNA-klonen er et viktig skritt i utviklingen av en omvendt genetikk system for RNA-virus, spesielt for positive-strand RNA-virus, fordi dens genom fungerer som viral mRNA som er oversatt til proteiner av vertscelle ribosomer. Således kan viral replikasjon initieres ved innføring av en cDNA-avledet genom-lengde RNA-molekyl inn i en vertscelle utsatt. Tilgjengeligheten av en smittsom JEV cDNA klone, når det kombineres med rekombinant DNA-teknologi, har økt vår forståelse av ulike aspekter av viral livssyklus på molekylært nivå, for eksempel genuttrykk 73,79 og genom replikering. 63,64 Også en full-lengde cDNA-klon JEV har vist seg å være et verdifullt verktøy for utviklingen av antivirale vaksiner 28 og genavleveringspartikler vektorer. <sup> 80,81

Som med alle positive-tråd RNA-virus, det er flere kritiske trinn i å konstruere et funksjonelt pålitelig cDNA for JEV hvorfra sterkt smittsomme RNA kan syntetiseres in vitro. Ideelt sett bør rekkefølgen av de syntetiske RNA transkribert fra en klon av full-lengde cDNA er identisk med den i det virale genomiske RNA, særlig de 5'- og 3'-terminale sekvenser som er nødvendige for initiering av RNA-replikasjon viral . 60-62 i den aktuelle protokoll, det autentiske 5'- og 3'-endene ble sikret ved å plassere SP6 promoter-sekvensen oppstrøms for det første adenin nukleotid av virusgenomet, og posisjonering av en unik kunstig Xba I restriksjonssete nedstrøms for den siste tymin nukleotid av virusgenomet, respektivt. Avkortet syntetiske RNA med autentisk 5 'og 3' ender ble produsert av run-off transkribering av et Xba I-linearisert og MBN-behandlede cDNA template ved hjelp av SP6 RNA-polymerase grunnes med 7 G m (5 ') ppp (5') A cap-analog. Denne protokollen kan modifiseres på flere måter. For in vitro transkripsjon, kan en annen bakteriofag RNA-polymerase (f.eks, T3 og T7) brukes i forbindelse med den veldefinerte promotorsekvens. 27 Som et run-off område, kan et annet restriksjonssete benyttes hvis det ikke er til stede i det virale genom, og hvis syntetisk RNA fra den lineariserte cDNA ender med autentisk 3 'ende. Betydningen av 3'-enden nukleotidsekvens er blitt demonstrert ved en ~ 10-gangers reduksjon i RNA-smittsomhet ved en syntetisk RNA inneholder tre eller fire virus urelatert nukleotider ved sin 3 'ende. 27 I en in vitro-transkripsjonsreaksjon, både m 7 G (5 ') ppp (5') A og m 7 G (5 ') ppp (5') G cap analog kan anvendes like godt, selv om de sistnevnte steder et ubeslektet ekstra G nukleotid oppstrøms for viral 5 '-end, mentillegg endrer ikke smittsomhet eller replikasjonen av syntetisk RNA. 27 Dessuten er det ikke nødvendig for RNA smittsomhet tester fjerning av cDNA templat fra RNA-transkripter av DNase I-fordøyelse, fordi cDNA templat i seg selv ikke er smittsomme. 27

BAC teknologi har nå blitt brukt til å bygge smittsomme cDNA kloner for en håndfull av positiv leder RNA-virus, nemlig to JEVs, CNU / LP2 27 og SA 14 -14-2 28 (genomstørrelse, ~ 11 kb); to dengue virus, BR / 90 26 og NGC 29 (~ 11 kb); storfe viral diaré virus, SD1 (~ 12 kb), 25 to-klassisk svinepest virus, C og Paderborn (~ 12 kb), 24 grensen disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 på svin og respiratorisk syndrom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 den overfør gastroenteritt virus, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 feline smittsom bukhinnebetennelse virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 den Sars coronavirus, Urbani (~ 30 kb), 9 Midtøsten respiratorisk syndrom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 og den menneskelige coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31. Den største fordelen med å bruke BACS for cDNA konstruksjon er høy genetisk stabilitet av de store, 1- eller 2-kopi BAC plasmider.; imidlertid den iboende natur av dens ekstremt lave kopitall også en stor ulempe, på grunn av meget lave utbytter av BAC-DNA og den derav følgende reduksjon i renheten av BAC-DNA i forhold til vertens kromosomale DNA. I dagens protokollen, er utbyttet av BAC DNA maksimert ved å dyrke E. coli DH10B transformert med den smittsomme BAC pBAC / SA 14 -14-2 i et næringsrikt medium, 2xYT. Til tross for dette arbeidet, er bare ~ 15 mikrogram av BAC DNA fra 500 ml 2xYT buljong gjennomsnittlig yield. Dessuten er renheten av BAC DNA best oppnås ved hjelp av CsCl-EtBr tetthetsgradient-sentrifugering for rensing, Snarere enn den som vanligvis brukes kolonne-basert plasmid isolert. Det er imidlertid viktig å huske på at BAC-transformert E. coli bør ikke overgrow fordi det kan true den genetiske stabiliteten i klonet cDNA, og høyere vekst ikke nødvendigvis føre til større avlinger eller høyere renhet BAC DNA.

Protokollen er beskrevet her er en optimalisert, effektiv og strømlinjeformet fremgangsmåte for bygging og forplantning av en genetisk stabil full-lengde cDNA-klon som smittende en BAC til JEV, en fremgangsmåte gang trodde praktisk talt umulig. Denne samme kloningsstrategien kan også anvendes til mange andre positive kjedede RNA-virus. Generelt smittsomme cDNA kloner gjør oss i stand til å innføre en rekke mutasjoner (f.eks slettinger, innsett og punktmutasjoner) inn i en viral RNA genom for å studere deres biologiske funksjoner i virusreplikasjon og patogenese. Dette cDNA-basert revers genetikk system gjør det mulig å utvikle og test vaksine og terapeutiske kandidater rettet mot en virulens faktor (er) av en bestemt positiv tråd-RNA-virus er av interesse. I tillegg kan denne infiserende cDNA teknologien også benyttes som en viral vektor som er i stand til å uttrykke et fremmed gen (er) av interesse i mange anvendelser innen biomedisinsk forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

Immunologi revers genetikk smittsomme cDNA bakteriell kunstig kromosom RNA-virus enkeltrådet positiv følelse infeksjon replikering patogenese flavivirus japansk encefalitt virus
Bakteriell kunstige kromosomer: En funksjonell genom Tool for studier av Positive-strand RNA virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter