Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

RNA virologists, 1970'lerin rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmeler, daha sonra mümkün RNA virüslerinin genetik manipülasyonu için bakterilerde plazmidler gibi yayınlanabilirdi cDNA klonları, viral RNA genomları dönüştürmek için yapılmıştır. 1, ilk RNA virüsü olduğu Klonlanmış moleküler bakteriyofaj Qβ, Escherichia coli bozar pozitif sarmallı RNA virüsü oldu. E. verildiğinde Qβ genomik RNA'nın bir cDNA kopyasını ihtiva eden bir plasmid, bulaşıcı Qβ fajlar yol açan E. coli. 2 Kısa bir süre sonra, bu teknik, poliovirüs uygulanan, insanlarda ve hayvanlarda bir pozitif tek iplikli RNA virüsüdür edildi. Çocuk felci virüsü genomik RNA'nın bir tam boy bir cDNA taşıyan bir plazmid, bulaşıcı memeli hücrelerine transfekte edilmiş ve enfeksiyöz virionlann üretebilen zaman 3, klonlanmış cDNA'lar, viral RNA replikasyonunu başlatmak için hücre transkribe edilmesi gerekmektedir, bu "DNA başlatıldı" yaklaşımında.;transkripsiyon başlatılır ve nasıl transkript doğru viral diziye nasıl işlendiğini, ancak belirsizdir. Bu kaygı, bir alternatif "RNA fırlatılan" bir gelişmesine yol açmıştır yaklaşımı viral RNA genomunun tam bir cDNA kopyası bir E. tarafından tanınan bir promoter altında klonlanır, böylece Ev sahibi hücre içine sokulduğunda virüsün replikasyon çembere devam tanımlandığı 5 've 3' uçlarının ile in vitro olarak sentetik RNA'ların üretimi için E. coli ya da faj RNA polimeraz. Bu yaklaşım ilk başarılı brom mozaik virüsü için bildirilmiştir 4,5 6,7 bitki pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. O zamandan beri, RNA fırlatılan bir yaklaşım kalisivirüs alfavirüsler, flavivirüsler, arteriviruses ve koronavirüslerin dahil pozitif iplik RNA virüslerinin geniş bir yelpazesi için geliştirilmiştir. 1,4,5,8

Nitelikteki DNA- ve her ikisinde de, ful inşaatı karşıt genetik sistemler RNA başlatılan~ 10 l-uzunluklu cDNA klonu enfeksiyon DNA veya pozitif sarmallı RNA virüslerinin RNA üreten anahtarı, ancak viral genomun boyutu arttıkça önemli bir teknik sorun. Özellikle 9-17, geniş bir RNA genomu olur -32 kb, tam uzunlukta cDNA işlevsel klonlama ile üç büyük sorun sunulur. RT-PCR aslına viral RNA'nın uzunluğu ile ters orantılı olduğundan, 18 ilk zorluk, kopyalama sadık bir cDNA sentezi. Uzun RNA molekülleri E. kararsız plazmidler cDNA fragmanının yapabilen beklenmeyen dizileri içeren daha büyük olasılıkla, çünkü ikinci bir engel, potansiyel olarak toksik sekansların varlığı E. coli. O> 10 kb viral cDNA insert ev bir klonlama vektörü bulmak zor olduğundan üçüncü ve en kritik konu, uygun bir vektör mevcudiyetidir. Son üç yılda, bu engeller enzimolojisi, metodoloji, An çeşitli gelişmeler aşılmıştırd vectorology. Bunlardan 1,4,5,8, en yenilikçi gelişimi büyük pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi bulaşıcı bakteriyel yapay kromozomları (BAC'ler) klonlanması olup. BAC vektörü E. göre bir düşük kopya plazmid klonlama (1-2 kopya / hücre) bir arasında bir ortalama DNA insert boyutu ile coli doğurganlık faktörü, ~ 120-350 kb 19-21 bir DNA parçası, genel klonlama vektörleri içine klonlama için benzer bir şekilde BAC vektörü içine sokulur.; Ortaya çıkan BAC klonları E. birçok nesiller boyunca stabil E. coli. Bugüne kadar 22,23, BAC teknolojisi yani üç pozitif iplikli RNA virüsüdür aileleri, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 ve Coronaviridae> 10 üyeleri için bulaşıcı cDNA klonları oluşturmak için kullanılır olmuştur. 9,16,17 , 31,32

Örnek olarak Japon ensefaliti virüsü (JEV) kullanarak, mevcut iş olabilir detaylı prosedürler raporlarıpozitif sarmallı RNA virüslerinin çeşitliliği için bir genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon BAC oluşturmak için kullanılır. Meydana JEV, JEV enfeksiyonu ağır sıklıkla ölümcül bir nörolojik hastalıktır Japon ensefalit neden olabilir İnsanlarda bir zoonotik sivrisinek vektörleri tarafından kuş, domuz ve diğer omurgalı konaklar arasında doğada iletilir flavivirüs 33. 34,35 olan (JE), 36 ~ 50,000-175,000 klinik vakaların tahmini yıllık insidansı Asya ve Batı Pasifik, 37,38 parçaları. 39,40 Jev genomu bir ~ 11-kb, tek iplikli, pozitif-sens RNA molekülüdür ve oluşan 5 've 3' iki kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCRs) ile çevrili bir tek bir açık okuma çerçevesi (ORF) sona erer. 41,42 ORF olarak 10 bağımsız proteinlerin üretilmesi için host ve viral proteazlar tarafından bölünen bir poliproteini şifreler C prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5 Ayrıca C-terminal yönüne N-. 34,43,44, eNS1 (NS1 ') ne sahip Xtended şekilde kodonları NS2A 8-9 de tarafından -1 ribozomal çerçeve ifade edilir. Bu 11 proteinlerden 45,46, üç yapısal proteinleri (Cı prM ve E) enfeksiyon oluşumu için gerekli olan virionlar, 47,48 ve kalan sekiz yapısal olmayan proteinler (NS5'in için NS1 ve NS1 '), viral RNA replikasyonu, 49-51 parçacık montaj, 52-56 ve doğal bağışıklık kaçırma için çok önemlidir. 57-59 İkisi 5' ve 3 'NCRs birincil dizileri ve viral RNA replikasyonu modüle için önemli olan formu RNA ikincil / üçüncül yapıları, 60-62 korunmuş içerirler. 63,64

Bu protokol, SA 14 -14-2 tam uzunlukta JEV enfeksiyöz BAC üretilmesi için araçlar, yöntem ve stratejiler açıklanmaktadır. 28 Bu fonksiyonel BAC klonu bir promoter tarafından kapsanmaktadır JEV genomik RNA'nın bir cDNA kopyasını, 65 içerir SP6 RNA polimeraz için üst başViral 5'-uç ve in vitro Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca viral 3'-ucunun alt baş benzersiz bir Xba I kısıtlama sahasının. Bu BAC teknolojisi pozitif sarmallı RNA virüslerinin bir dizi için tamamen işlevsel bir cDNA klonu molekül oluşturmak için de geçerlidir.

Protocol

Not: Şekil 1 BAC gibi tam uzunlukta bulaşıcı JEV cDNA yapımı için bir strateji sunar 28 Tablo 1 Bu protokolde kullanılan oligonükleotidlerden bir listesini sağlar 28..

1. hücre kültürü süpernatanlarında JEV Taneciklerinden Viral RNA ekstrakte

  1. JEV SA 14 -14-2, Biyogüvenlik Seviyesi 2 çevreleme gerektiren canlı JE aşısı virüsü içeren hücre kültür ortamı ile başlayın.
    Not: bir viral titresi yaklaşık 1-3 x 10 6 plak oluşturucu birim / ml olmuştur.
  2. Önce JEV SA 14 -14-2 ile çalışmak için tüm standart mikrobiyolojik uygulamaların, güvenlik ekipmanları ve laboratuvar olanakları için gerekli biyogüvenlik eğitimi alın.
  3. Fenol ve guanidin izotiyosiyanat 66 (Şekil 1A) bir tek fazlı çözelti kullanılarak virüs ihtiva eden hücre kültür ortamı bir böleni ile viral RNA'yı saflaştırmak.
    1. Reklamd 1,7 mi mikrotüp kültür yüzey 200 ul tek fazlı reaktifin 600 ul. 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde tüp elle çalkalama ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edilerek homojen bir karışım.
    2. Homojenize örnek kloroform 160 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetlice tüp el sallayarak ve oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca bırakarak iyice karıştırın.
    3. Yani iki sıvı fazdan oluşan bir ayırma, daha düşük bir organik faz ve bir üst sulu faz sonuçlanır 4 ° C'de 15 dakika boyunca 13.400 x g'de toplam lizat santrifüjleyin. Yeni mikrotüpe RNA içeren üst sulu fazı (az 200 ul) aktarın.
    4. 5 ug / ml glikojen 1 ul% 100 izopropanol 400 ul ilave edilmesi ve oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe RNA çöktürün.
    5. Santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.400 x g'de karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Süpernatantı atın ve beş darbe vorteks üç tarafından% 75 etanol 1 ml RNA pelet yıkayınsüresi ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleme.
    6. 10 dakika boyunca RNA pelet Hava kuruması ve dH 2 O. 40 ul feshedip Kullanılana kadar -80 ° C'de ekstre RNA saklayın.

2. Dört Çakışan cDNA Fragments (F4 F1) Ters Transkripsiyon tümünün Viral genomik RNA (RT) Kapsayan -PCR bir Set sentez

  1. Bir şablon olarak saflaştınlmış viral RNA'nın bir 10 ul alikot ve Moloney mürin lösemi virüsü modifiye edilmiş bir formu, ters transkriptaz içeren 20 ul RT reaksiyonu gerçekleştirin. 67
    1. 10 saflaştırılmış RNA ul, 1 ul 10 mM dNTP karışımı, 1 ul 4 pmol / ul primer, ve 1 ul dH 2 O ihtiva eden bir 13 ul karışım ayarlama F4 için F3 F1, F2 2RT için 3RT için 1RT ve 4RT: Her bir RT reaksiyonu için fragmanı spesifik primer kullanarak.
    2. 1 dakika boyunca, 5 dakika boyunca 65 ° C 'de buz üzerinde yer karışımı inkübe ve sonra hızlı bir spin Conte toplamaktüpün dibinde NTS.
    3. Ul ters transkriptaz / 4 ul 5 x RT tamponu, 1 ul 0.1 M DTT, 1 ul 40 U / ul RNaz inhibitörü ve 1 ul 200 U ekleyin. Yukarı pipetleme ve üç beş kez aşağı karıştırın.
    4. Reaksiyon daha sonra 15 dakika boyunca 70 ° C 'de örnek ısı ile inaktive, 1 saat süre ile 50 ° C' de devam edelim. Kullanılana kadar -20 ° C 'de sentezlenen ilk-iplikçik cDNA saklayın.
  2. Şablon ve yüksek güvenilir bir termo stabil DNA polimeraz 68 (Şekil 1B) halinde ısı ile inaktive edilmiş RT reaksiyonunda bir 5 ul alikot ile 100 | il PCR reaksiyonu gerçekleştirmek.
    1. RT reaksiyonu 5 ul, 20 ul 5 x PCR tampon, 4 ul 10 mM dNTP karışımı, 5 ul 10 uM ileri primer, 5 ul 10 uM ters primeri, 1 ul 2 U içeren, buz üzerinde 100 | il PCR reaksiyonu ayarlama / ul DNA polimeraz ve 60 ul dH 2 O Her PCR reaksiyonunun için fragmanı spesifik primer çifti kullanınn: F1 (2573 bp) için 1F + 1R, F2 için 2F + 2R (4171 bp), F3 için 3F + 3R (3922 bp) ve F4 için 4F + 4R (1798 bp).
    2. Altta içeriğini toplamak için parmak çevirme tüp üç beş kez ve santrifüj kısaca tarafından yavaşça karıştırın.
    3. Aşağıdaki PCR profili ile 25-30 döngü izledi 98 ° C 'de 30 saniyelik bir başlangıç ​​denatürasyon basamağından ile termodöngüleme başlayın: 98 ° C'de 10 saniye, 60 ° C'de 30 saniye, ve 1-2 dakika (30 s / 72 ° C'de kb). Analiz edilene kadar 4 ° C 'de, PCR ürünlerini saklayın.
  3. 0.5 ug / ml etidyum bromür (EtBr) (Şekil 2) ihtiva eden bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde PCR reaksiyonunun her bir 2-5 ul tablet çalıştırın.
    DİKKAT: EtBr güçlü bir mutajen ve kullanımı, depolanması ve bertaraf sırasında dikkat edilmesi gereken laboratuvar mont, koruyucu gözlük ve giyilmek üzere eldiven ve son derece dikkatli gerektirir.

3. Altklon BAC Vector içine dört cDNA Fragments (F4 F1) Her pBAC / F4 b pBAC / F1 oluşturmay moleküler klonlama teknikleri

  1. Aşağıdaki gibi vektör Digest ve iki uygun sınırlama endonükleazı ile DNA'lar ekleyin:
    1. 60 ul (ihtiva eden toplam hacim yaklaşık 500 ng DNA, içinde, 30 Pme I ile pBeloBAC11 plazmid (7507 bp, GenBank erişim numarası U51113), bir türevi ve Not I pBAC / PRRSV / FL (vektör) 'in bir ardışık sindirim gerçekleştirme , 15.426-bp vektör fragmanı verir 12-15 saat boyunca 37 ° C'de 10 U enzim, 1 x sindirim tamponu ve 1 x BSA).
    2. 25 ° C'de 60 ul toplam hacim içinde sıralı bir Sma I ile dört cDNA amplikonlarının (insert) her birinin sindirim ve Not I gerçekleştir (~ 1 ug DNA, 20 U enzim, 1 x sindirim tampon ihtiva eden ve 1 x BSA) ° C (Sma I) ya da 12-15 istenen büyüklükte aşağıdaki ekleme parçalarını verir saat için 37 ° C (Not I): F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp) ve F4 (1784 bp).
  2. Arındırmakvektör, istenen ve jel ekstraksiyonu ile DNA kıtalarının yerleştirin.
    1. Ihtiva eden bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jel 0,5 ug / ml EtBr ile iki kat sindirilmiş ürünler ayırın. Uzun dalgalı ultraviyole ışığı altında agaroz minimum miktarda (genellikle yaklaşık 200 ul) ile arzu edilen bir DNA fragmanının bir bant kesin.
    2. 1.7 ml'lik bir mikrotüp agaroz kesilmiş eşit TEM tampon hacmi (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA ve 10 mM MgCI2) ekleyin. Agaroz tamamen eriyene kadar 2-3 dakika süre ile girdap ile 10-15 dakika boyunca 72 ° C 'de örnek inkübe edin.
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13.400 x g'de 1 dakika, ve santrifüj boyunca kuvvetli bir şekilde, girdap önceden ısıtılmış tampon, doymuş fenolün eşit hacim.
      Not: Karışım daha düşük bir organik faz ve bir üst sulu faz ayrılır. Yeni bir mikrotüp Üstteki DNA içeren sulu faz transfer.
    4. Izoamil alkol (24: 1), kloroform eşit hacimde ekleme 13 yaşında, 1 dakika süre ile girdap ve santrifüjOda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g. Yeni bir mikrotüp üst sulu faz transfer.
    5. 10 ug / ml maya tRNA, 0.5 ul 3 M sodyum asetat 10/01 hacim, ve% 100 etanol içinde 2.5 hacim ekleyin. 20 dakika boyunca buz karışımı tutun.
    6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13.400 x g'de santrifüjleyin karışımı. Süpernatantı ve üç ila beş kez darbe vorteks ve 10 dakika boyunca 13.400 x g'de santrifüjleme ile,% 70 etanol içinde 1 ml DNA pelet yıkayın.
    7. 10 dakika için DNA pelletini hava-kurutun ve TE tamponu 20 ul (10 mM Tris-Cl ve 1 mM EDTA [pH 7.6]) içine çözülür.
  3. Istenen vektörü bağlanır ve T4 DNA ligazı kullanılarak DNA fragmanları yerleştirin.
    1. Vektör DNA, 50-100 ng sokma DNA'nın ~ 3-kat molar fazlalığı, 400 U T4 DNA ligazı ve 1 x ligasyon tampon ihtiva eden bir 20 ul ligasyon reaksiyonu ayarlayın. 12-15 saat boyunca 16 ° C'de bağlanma reaksiyonu inkübe edin.
      Not: Negatif Contr dahilol reaksiyonu, yani sadece paralel insert olmadan vektör.
    2. Her (F1) 2559-bp ile pBAC / PRRSV / FL 15426-bp Pme I- Not I fragmanı katılmadan, dört ayrı ligasyon gerçekleştirin 4157-bp, (F2 için) (F3) 3908-bp veya (F4 için) 1784-bp dört cDNA amplikonlarının birinin Sma I Not I fragmanı, altklonların pBAC / F4 pBAC / F1 üretmek için.
  4. E. lige DNA Dönüşümü CaCl2 -Isı şok yöntemiyle coli DH10B.
    1. CaCI2, 100 ul tam bölünen miktarları, yetkili DH10B hücrelerini -80 ° C'de saklandı 69 ile tedavi edilen alın ve buz üzerinde eritin.
      Not: dönüşüm başına hücre 100 ul kullanın.
    2. Bir 1.7 mi mikrotüp Çözülen hücrelerin 100 ul DNA ligasyon reaksiyonu 10 ul kısım ekleyin tüp dokunarak yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutulur.
    3. Isı şoku 42 ° C wa 45 saniye boyunca DNA hücre karışımıdaha sonra ter-banyosu, 2 dakika için buz üzerinde bir yer ve LB suyu 900 ul, oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış ekleyin.
    4. 225-250 rpm'de çalkalanarak 1 saat boyunca 35 ° C'de ısı ile şoklanmış hücre inkübe edin.
    5. 10 ug / ml kloramfenikol içeren LB agar plakaları üzerinde kültürlendi hücreleri (Cml) 50 ila 200 ul alikotları yayıldı. Onlar kuruyana kadar, sağ yan, oda sıcaklığında plakalar tutun.
    6. Ters plakaları getirin ve 15 saat boyunca 35 ° C'de inkübe edin.
  5. Bir sütun bazlı saflaştırma yöntemi (Şekil 1C) ile konakçı hücrelerden klonlanmış BAC DNA kurtarma.
    1. LB-agar plakaları Cml altı ila sekiz bakteriyel koloniler 10 ug / ml CML ihtiva eden 2xYT suyu 3 ml içine inoküle. Sertçe çalkalandı (225-250 rpm) ile 10 saat boyunca 35 ° C'de kültürler inkübe edin.
    2. Üretici tarafından yönlendirildiği gibi, spin kolonları kullanılarak bakteri kültürlerinin 1-1.5 ml rekombinant BAC DNA'lar izole edin. 70 Zehir ekstre DNA (tipik olaTE tamponu 20 ul jik olarak 100-200 ng).
    3. Bir Klonlama için kullanılan aynı enzimler kullanılarak doğru bir ekleme ile vektörün varlığı tespit etmek, 10 ul toplam hacim içinde ~ 6 saat süre ile izole BAC'lerin iki analitik sınırlama enzim sindirimleri gerçekleştirir (Protokol 3,1) ve diğer tek bir kısıtlama fragmanı örneği oluşturur (ör Bgl II, Nco I ya da Pst I), uygun bir enzim ile klonlanmış BAC'lerin bütünlüğünü test etmek.
    4. 2xYT-Cml ortamı, 500 ml (Protokol 3.5.1 gelen) pozitif bakteri kültürlerinin 500 ul inokülasyon ve 225-250 rpm'de çalkalayarak 35 ° C sıcaklıkta 6 saat boyunca inokulum işleyerek doğru klonlanmış BAC'ler yayar. Üretici tarafından önerildiği üzere, filtre kolonları kullanılarak 500 ml'lik bir kültürden alınan BAC DNA (tipik olarak 10-20 ug) saflaştınlır. 71
      Not: İlk dört BAC altklonları, JEV genomik RNA'nın bir cDNA fragmanı içeren her üzerinde olması kanıtlamak olabilire ya da (bir referans dizi olarak hizmet eder), viral genomun 42 konsensüs sekansı ile karşılaştırıldığında daha istenmeyen mutasyon (lar). Böyle bir mutasyon, bir tam uzunlukta cDNA JEV birleştirilmesinden önce PCR-bazlı bölgeye-yönelik mutagenez ile düzeltilmiştir edilmesi gerekmektedir. 27

4. 5 'SP6 Promoter ve 3' Run-off Site ile Full-uzunluk JEV cDNA oluştur

  1. Üç genetik değişiklikler otantik 5 've 3' ile birlikte genom uzunlukta RNA'ların in vitro Çoğaltma transkripsiyonu sağlamak için klonlanmış cDNA bölgesi (4.1.1-4.1.3 Protokoller aşağıya bakınız) Marka Viral genomun sona erer.
    1. Üst üste gelen uzatma PCR (Şekil 1D, pBAC / F1 SP6) viral genomunun 5 'ucunun, doğrudan üst akışında bir SP6 başlatıcısı tanıtılması.
      1. Ürün s (iki primer çiftiyle SP6F + SP6R (ürün boyutu, 173 bp) ve F1F + F1R ile pBAC / F1 ilk standart PCR ile örtüşen iki DNA parçalarını yükseltmekize, 676 bp), 1 ul hedef DNA (~ 200 pg / ml) ihtiva eden bir 50 ul reaksiyon, her biri 10 ul 5 x PCR tampon maddesi, 2 ul 10 mM dNTP, 2.5 | il ileri 10 uM her birini ve ters primerler, 0.5 ul 2 U / ul DNA polimeraz, 68 ve 31.5 ul dH 2 O 30 saniye için 98 ° C ve 10 sn için 98 ° C 25 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 20 sn için 72 ° C: Aşağıdaki PCR döngü profili kullanılarak gerçekleştirin.
      2. Protokol 3,2 de tarif edildiği gibi,% 1.5 düşük erime noktalı agaroz jel ile iki PCR ürününün her biri çalıştırdıktan sonra, iki PCR ile amplifiye DNA fragmanları jel-saflaştırılması.
      3. 1 ul, iki saflaştırılmış DNA parçalarının her biri (~ 100 ug / ml) içeren bir 100 ul reaksiyon (ürün boyutu, 821 bp), dış astarlar SP6F + F1R kullanılarak ikinci füzyon PCR üzerinden iki jelle saflaştınlmış DNA parçalan sigorta, 20 ul 5 x PCR tampon maddesi, 4 ul 10 mM dNTP, 5 ul ileri 10 uM her birini ve ters primerler, 1 ul2 U / ml DNA polimeraz, 68 ve 63 ul dH 2 O 30 saniye için 98 ° C, ve 10 saniye, 30 saniye için 60 ° C, 30 sn için 72 ° C, 98 ° C 25 döngü: Aşağıdaki termal döngü profili kullanın.
      4. Protokol 3,2 de tarif edildiği gibi, bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jelinden kaynaşık PCR amplikon jel-saflaştırılması.
      5. Oluşturmak için pBAC / F1 9532-bp Pac I- BSI WI fragmanı ile jel-saflaştırılmış erimiş PCR amplikonunun 760-bp Pac I- BSI WI fragmanı Arter Protokollerinin 3,1-3,5 açıklanan beş adımlı klonlama işlemini gerçekleştirin pBAC / F1 SP6.
    2. Örtüşme uzatma PCR (Şekil 1D, pBAC / F3 KO) üzerinden sessiz nokta mutasyonu (T → A 9134) tanıtarak nükleotid 9131 de önceden var olan iç XbaI siteyi çıkarın.
      1. İki primer çiftleri X1F + X1R ile pBAC / F3 ilk standart PCR ile örtüşen iki DNA fragmanlarını yükseltmek(ürün boyutu, 746 bp) ve X2F + X2R Protokolü 4.1.1.1 tarif edilen deney koşulları altında, bir 50 ul reaksiyon (ürün boyutu, 316 bp).
      2. Protokol 3,2 ayrıntılı olarak,% 1.5 düşük erime noktalı agaroz jeller üzerinde elektroforezle ayrılması sonra iki PCR amplifiye edilmiş DNA fragmanları jel-saflaştırılması.
      3. Protokol 4.1.1.3 tarif edilen deney koşulları altında, bir 100 ul reaksiyon dış primerler X1F + X2R (ürün boyutu, 1033 bp) kullanılarak ikinci füzyon PCR üzerinden iki jelle saflaştınlmış DNA parçalan sigorta.
      4. Protokol 3,2 detaylı olarak, bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jelinden kaynaşık PCR amplikon jel-saflaştırılması.
      5. 16245-bp Değil I- BSI WI ve 2141-bp BSI W I jel-saflaştırılmış erimiş PCR amplikonunun 949-bp Avr II- Not I fragmanı bağlanması için Protokolleri 3,1-3,5 açıklanan beş adımlı klonlama işlemini gerçekleştirin - pBAC / F3 Avr II fragmanları pBAC / F3 KO üretmek.
      </ li>
    3. PCR bazlı bölgeye yönelik mutajenez (Şekil 1D, pBAC / F4 RO) viral genomunun 3 'ucunun hemen alt baş tarafındaki yeni bir yapay Xba I run-off sitesi Engineer.
      1. 1 ul hedef DNA ihtiva eden bir 100 ul reaksiyon primerleri, rof + ROR (ürün boyutu, 324 bp) (~ 200 ug / ul) ile pBAC bölgesinin PCR ile, bir DNA fragmanını oluşturmak / F4, 20 ul 5 x PCR tampon maddesi, 4 ul 10 mM dNTPs, 5 ul ileri 10 uM her birini ve ters primerler, 1 ul 2 U / ul DNA polimeraz, 68 ve 64 | il DH 2 O 30 saniye için 98 ° C ve 10 sn için 98 ° C 25 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 15 sn için 72 ° C: Aşağıdaki PCR döngü profili kullanılarak gerçekleştirin.
      2. Protokol 3,2 detaylı olarak, bir% 1 düşük erime noktalı agaroz jelden PCR ile amplifiye DNA fragmanı jel-saflaştırılması.
      3. 283-bp Sfi I N Arter Protokollerinin 3,1-3,5 açıklanan beş adımlı klonlama işlemini gerçekleştirinpBAC / F4 RO oluşturmak için pBAC- / F4 16933 bp'lik Sfi I Not I fragmanı ile jelle saflaştırılmış PCR amplikonunun her ot I parçası.
  2. (Üç doğal kısıtlama sitelerde Bsr GI, Bam HI, ve Ava I katılarak (pBAC / SA 14 -14-2) tek tam uzunlukta SA 14 -14-2 BAC içine cDNA'lan örtüşen, modifiye dört bir dizi birleştirin ) Protokolleri ayrıntılı prosedürler klonlama beş adımı kullanarak sıralı bir şekilde 3,1-3,5 (Şekil 1E): pBAC o ile pBAC / F1 SP6 Bsr G I- Not I fragmanı değiştirerek F1 SP6 → F1 SP6 F2 (/ Ava I- Not I fragmanını değiştirerek (F1 SP6 F2F3 KO F4 RO → pBAC / F3 KO) o ile pBAC / F1 SP6 F2 Bam H I Not I fragmanı değiştirerek F1 SP6 F2F3 KO → F2) ( pBAC / F1 SP6 F2PBAC / F4 RO bununla F3 KO).

5. Tam uzunlukta bir yüksek saflıkta maksi-hazırlık SA 14 -14-2 BAC Hazırlama

  1. E. tek bir koloni büyümeye daha sonra 225-250 rpm'de çalkalanarak ve 35 ° C 'de 10 saat boyunca 10 ug / ml CML ihtiva eden 2xYT suyu pBAC / SA 14 -14-2 3 ml taşıyan coli DH10B 10 saat 500 ul inokülasyon ile büyütmek 2xYT-Cml orta ve kuvvetli çalkalama ile 35 ° C'de 6 saat boyunca inokulum yetiştirilmesi 500 ml bakteri kültürü.
  2. Santrifüj 4 ° C 'de 15 dakika süre ile 3107 x g' de, iki 250 ml şişe içinde bakteri kültürü. GTE çözeltisi (50 mM glukoz, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA [pH 8.0]), 30 ml, her pelletini ve / ml lizozim, 60 mg, 500 ul ilave edin. 10 dakika boyunca buz üzerinde, iki hücre süspansiyonları inkübe edin.
  3. Her hücre süspansiyonuna taze Lysis çözeltisi (0,2 N NaOH ve% 1 SDS), 60 ml ilave edilir berraklaşana kadar karıştırın ve lizatları tutmak10 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
  4. Her bir şişeye (60 mi 5 M potasyum asetat, 11.5 ml buzlu asetik asit ve 28.5 ml dH 2 O'dan oluşan, 100 ml) ile nötrleştirme çözeltisi 45 ml ilave edilir, şişe ters çevirerek iyice karıştırın ve buz üzerinde nötralize lizatları inkübe 10 dakika karıştırıldı.
  5. Santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.566 x g'de nötralize lizatları. Iki yeni 250 ml'lik şişeler içine hem şişelerin süpernatant aktarın; her bir 100% 0.6 hacim izopropanol ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
  6. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.566 x g'de çökeltiler dönerler. TE tamponu, 5 ml her bir pelet çözülür (10 ml toplam) 50 ml'lik bir tüp içinde kombine ve 5 M lityum klorür eşit bir hacminin eklenmesiyle RNA'yı çöktürmek. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı.
  7. Santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.636 x g'de RNA çökeltisi. Yeni bir 250 ml'lik bir tüpe transfer süpernatantı ve% 100 izopropanol 2 hacmi eklenerek DNA'nın çökeltilmesi.20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı.
  8. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 18.566 x g'de DNA çökeltisi dönerler. Süpernatantı aspire TE tamponu (pH 7.6), 9.5 ml DNA pelletini, ve sezyum klorür (CsCl), 10 g ve / ml EtBr 10 mg 390 ul ilave edin.
  9. 18 G iğne ile donatılmış bir şırınga kullanarak 16 × 76 mm yapışmalı polipropilen tüp içine DNA CsCl-EtBr çözümünü yükleyin. 20 ° C'de (Şekil 3), 16 saat boyunca 401.700 x g'de, bir ultra santrifüj mühürlü CsCl gradyanı dönerler.
  10. Degrade üstündeki hava deliği ve degrade yanından BAC DNA almak için 20 G iğne donanımlı şırınga oluşturmak için 18 G iğne kullanılarak CsCI degrade BAC plazmid DNA bandı toplayın.
  11. DH 2 2.5 hacimleri ekle EtBr lekeli BAC DNA örneğine butanol O-doymuş ve vorteks karıştırın. Santrifüj 1 dakika boyunca 13.400 x g'de kanşım ve yeni bir 1.7 ml mikrofon alt sulu faz transferirotube. Bu işlemi altı kez tekrarlayın.
  12. 3 M sodyum asetatın 1/10 hacmi ve bir butanol ekstre BAC DNA,% 100 etanol içinde 2.5 hacim ekleme ve buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edilerek EtBr içermeyen BAC DNA Çökelme. Santrifüj 10 dakika boyunca 13.400 x g'de çökelti 1 ml% 70 etanol ile DNA pelet yıkayın ve santrifüj ile yeniden pelet.
  13. 10 dakika için DNA pelletini hava-kurutun ve TE tamponu (pH 7.6) içinde 200 ul içinde çözülür.
    Not: Şekil 4 JEV SA 14 -14-2 için ters genetik sistemin bir özetini göstermektedir.

6. Doğrusallaştırılmış Tam uzunluktaki JEV BAC DNA in vitro olarak sentetik RNA'ların uyarlamak

  1. Büyük çaplı bir sınırlama enzimi sindirimi gerçekleştirme pBAC / SA 14 37 ° C'de (3 ug DNA, 60 U enzim, 1 x sindirim tampon ve 1 x BSA içeren) 100 ul'lik bir toplam hacimde Xba I ile -14-2 12-15 st bekletilmiştir. D bir 3 ul tablet incelemek/ ml EtBr 0,5 ug ihtiva eden bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde igestion reaksiyonu.
  2. 2 saat boyunca 30 ° C'de (Şekil 4A) de, mung fasulye nükleaz 25 U (MBN) ile daha fazla sindirim reaksiyonu inkübe edin.
  3. DH 2 O ile 300 ul Xba I-sindirilmiş, MBG-işlenmiş numune hacmini getirin 10 dakika boyunca 13.400 x g'de, şiddetli bir şekilde 1 dakika için spin seyreltilmiş örnek, girdap ve daha sonra yeni bir 1,7 ml'lik üst sulu faz transferi (1: 24: 25) izoamil alkol: kloroform: fenol eşit hacimde ekleme Mikrotüp. Kloroform eşit miktarda ekleyin ve çıkarma işlemi tekrarlayın.
  4. Etanol çökeltme ile, fenol / kloroform ekstre, doğrusallaştırılmış BAC kurtarma: 3 M sodyum asetat 10/01 hacim% 100 etanol içinde 2,5 sayılarını ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Santrifüj 10 dakika boyunca 13.400 x g'de Çökelti,% 70 etanol içinde 1 ml DNA pelet yıkama ve sonra da yeniden santrifüjleme ile aşağı döndürün.
  5. DNA Pelle Hava kuruması10 dakika boyunca t dH 2 O 30 ul içinde çözülür 0,5 ug / ml EtBr (Şekil 5A) ile bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde kazanılan BAC bir 1 ul tablet inceleyin.
  6. ~ 200 ng DNA örneği, 0.8 mM kap analog [m 7 G (5 ') ppp (5'), A], 1 mM rNTPs ihtiva eden 25 ul (toplam hacim içinde doğrusallaştırılmış BAC DNA bir çalışma transkripsiyonu gerçekleştirmek, 40 U RNaz inhibitörü, 1 saat boyunca 37 ° C'de (Şekil 4B), 20 U SP6 RNA polimeraz, 72 ve 1 x transkripsiyon tamponu). Dahil 0.5 uM [3H] DE-81 filtre kağıdı adsorpsiyon ile denetlendiği haliyle [3H] UTP esas olarak RNA ölçümü için UTP. 69
  7. 0,5 ug / ml EtBr (Şekil 5B) ihtiva eden bir% 0.6 agaroz jeli üzerinde run-off transkripsiyon reaksiyonu bir 1-2 ul tablet çalıştırın.

7. RNA enfektiviteyi ve Virüs Verim belirleyin

  1. Yetiştirmek BHK-21 150 mm kültürlerdeki hücrelerin% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 24 saat boyunca 3 x 10 6 hücre / tabak yoğunluğunda yeniden yemekler.
    Not:% 10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin, vitaminler, ve penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş a minimal esas ortamı içinde BHK-21 hücreleri koruyun.
  2. Soğuk çözelti, A (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8.1 mM Na 2 HPO 4 ve 1,5 mM KH 2 PO 4) 10 ml hücre tekli tabakası durulayın. Tripsin-EDTA (% 0.25), 4 ml ile muamele ile tabaklardan hücreleri ayırın ve 2 dakika için bir masaüstü santrifüj 270 x g'da santrifüjleme ile bunları toplamak.
  3. 2 dakika için 50 ml konik bir tüp ve santrifüj 270 x g'da hücre süspansiyonu soğuk çözelti A 50 ml hücre pelletini. Bu yıkama prosedürü üç kez tekrarlayın; Son yıkamadan sonra, Sol A. 2 x 10 7 hücre / ml bir yoğunlukta hücre pelletini tekrar süspansiyon
  4. 2 μ olan hücre süspansiyonu 400 ul tablet karıştırın980 V, 99 mikro-sn darbe uzunluğu ve 5 darbeler (Şekil 4C): 2 mm aralığı küvet içinde sentetik RNA g ve derhal uygun elektroporasyon koşulları altında bir elektroporatörü Karışımı elektroporasyona.
    Not: daha fazla saflaştırılmadan doğrudan elektroporasyon için Protokol 6,5 sentezlenen 3H-etiketli RNA kullanın.
  5. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında Elektroporasyona tabi tutulan hücreler boş ve tam kültür ortamı içinde 600 ul ihtiva eden bir 1.7 ml'lik bir mikrotüp aktarın.
  6. Tam kültür ortamı içinde 1 ml elektroporate edilmiş hücrelerde bir 10-kat seri seyreltme hazırlayın ve 6 oyuklu plaka içerisinde unelectroporated BHK-21 hücreleri (5 x 10 5) tek tabakaları üzerinde, her seyreltme 100 ul tablet plaka.
  7. Inkübasyondan 4-6 saat sonra,% 10 cenin sığır serumu ihtiva eden minimum gerekli ortamda% 0.5 agaroz ile hücrelerin kaplaması. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 4 gün boyunca inkübe edin.
  8. Bulaşıcı merkezi görselleştirmeks% 5 etanol 27 (Şekil 6A) içinde% 1 kristal viyole ile% 7 formaldehit ve boyama ile tespit ile (plaklar).
    1. İsteğe bağlı: imünoflüoresan deneylerinde 27,73 (Şekil 6B) ile JEV protein ekspresyonu için 18-20 saat sonra transfeksiyon RNA-elektropore hücreleri incelemek ve virüs için 22 ve 40 saat sonra, transfeksiyondan RNA-elektroporate edilmiş hücrelerde süpernatantlar hasat plak deneyleri 27,63 (Şekil 6C) tarafından titrasyonu.

Representative Results

Tüm pozitif sarmallı RNA virüsü için bir karşıt genetik sistem güvenilirliği ve etkinliği olan dizisi viral genomik RNA'nın konsensüs sekansına denk bir klonlanmış tam boy cDNA'dan genetik stabilitesi, bağlıdır. 27 Şekil 1, bir beş göstermektedir JEV SA BAC gibi tam uzunlukta enfeksiyon cDNA yapımı için aşamalı bir strateji 14 -14-2 28: Aşama 1, JEV enfekte BHK-21 hücreleri (Şekil 1A), hücre kültürü üstte yüzen kısmından viral RNA'nın saflaştırılması; Aşama 2, tüm viral genomun (Şekil 1B) kapsayan birbiriyle çakışan dört cDNA amplikonlarının (F1 ila F4) sentezi; PBAC / F4 (Şekil 1C) için pBAC / F1 oluşturma Aşama 3, bir BAC vektörüne bitişik dört cDNA parçalarının her birinin alt-klonlama; Aşama 4, SP6 RNA polimeraz, yani in vitro Çoğaltma transkripsiyonu için klonlanmış cDNA modifikasyonu, bir SP6 yerleştirerekpromoter dizisi, bir sessiz bir nokta mutasyonu sokulmasıyla nükleotid 9131 de önceden var olan bir iç Xba I bölgesi elimine viral 5'-ucunda (pBAC / F1 SP6) hemen üst tarafından, bir 9134 T (pBAC / F3 KO) ve ekleme → Viral 3'-ucunda (pBAC / F4 RO) (Şekil 1D) hemen aşağı tarafında, yeni bir yapay Xba I run-off yer; ve Aşama 5, tam uzunlukta bir montaj SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Şekil 1E). Tablo Klonlama işleminde kullanılan oligonükleotidler 1 listeler. 28

Fonksiyonel JEV cDNA yapımı için, ilk önemli adım RT-PCR için bir şablon olarak saflaştınlmış viral RNA kullanılarak, dört örtüşen cDNA fragmanlarının sentezidir. 2 olan dört RT-PCR ürünleri için temsili bir sonuç sağlar Şekil % 0.8 üzerinde elektroforezagaroz jel. Bu jel, bir tam uzunlukta cDNA JEV dört örtüşen cDNA fragmanları amplifiye olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. Bazen, Rt-PCR reaksiyonu için cDNA sentezi / amplifikasyon prosesi esnasında primerlerin spesifik olmayan tavlamanın, istenen ürün daha çok küçük olan bir ya da daha fazla ilave virüse spesifik veya spesifik olmayan ürünler elde olabilir. Diğer taraftan, çok az veya hiç RT-PCR ürünü, viral RNA izolasyonu veya uygun olmayan RT-PCR performans sırasında kazara RNaz kirlenme amplifiye beklediği.

Bir sonraki anahtar aşaması, bir kısmi ya da tam uzunluktaki standart rekombinant DNA teknikleri kullanır nispeten basit bir işlemdir BAC JEV cDNA klonlanması ve bir modifikasyonudur. 69 Şekil 3 içeren BAC klon saflaştırılması için temsili bir sonuç sunulur CsCI-EtBr gradyanı bantlayarak JEV SA 14 -14-2 tam boyda bir cDNA.Bu deneyde, 401.700 x g'de 16 saat santrifüj işleminden sonra, iki farklı bantları, yani, E. Yukarıda coli kromozom DNA'sı ve aşağıdaki süper-BAC plasmid DNA'sı uzun dalgalı ultraviyole ışığı altında borunun ortasında görebilir. Alt BAC DNA bandının minimum bir hacmi (~ 400 | il) dikkatli bir şekilde borunun yan tarafında bulunan bir şırınga ile bir delik alay ile toplandı. Daha sonra, EtBr bütanol ekstre BAC DNA elde edildi ve EtBr içermeyen BAC DNA, etanol çökeltme ile konsantre edilmiştir.

Son adım, permisif hücreler içine RNA transfeksiyonundan (Şekil 4) sonra, tam uzunluktaki SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) in vitro olarak transkripsiyonu sentetik RNA'ların spesifik enfeksiyon belirlenmesidir. 3 'de Adım 1, tam uzunluktaki doğrusallaştırma SA 14 -14-2 cDNA: Bu adım, üç ardışık adımları içerir-end viral genom (Şekil 4A); Aşama 2, run-off transkripsiyon (Şekil 4B) ile doğrusallaştırılmış cDNA'dan sentetik RNA'ların üretimi; ve Aşama 3, sentetik RNA'ların (Şekil 4C) ile transfekte edilen BHK-21 hücrelerinde rekombinant virüslerin kurtarma. Deneysel olarak, pBAC / SA 14 -14-2 iki adet bağımsız klon Xba I sindirimi ile doğrusallaştırılmış ve Xba I sindirimi ile oluşturulan dört bazlı 5 'çıkıntı kaldırmak için MBN ile muamele edilmiştir. Doğrusallaştırılmış BAC etanolle çökeltme izlenmiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonu ile temizlendi. Saflaştırılmış olan iki BAC'lerin doğrusallaştırma bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 5A) ile gösterilmiştir. Fenol-kloroform ekstraksiyon linearize BAC'ler RNaz ücretsiz olmasını sağlamak için çok dikkatli yapılmalıdır. İki linearize BAC'lerin her bir m, 7 G (5 ') ppp mevcudiyetinde SP6 RNA polimerazı kullanılarak Çoğaltma transkripsiyonu için bir cDNA şablon olarak kullanıldı (5') Bir kapak benzeri. Sentetik RNA'ların bütünlüğü referans 1kb DNA çaprazı (Şekil 5B) ile birlikte,% 0.6 agaroz jeli üzerinde, iki transkripsiyon reaksiyonu karışımları alikotları çalıştırarak gördü. Bu basit bir deneyde, büyük bir belirgin RNA bandı her zaman sadece geçirilmiş 3 kb altında DNA bandı başvuru ve keskin olduğu ortaya çıktı. Ancak, RNA aynı jel üzerinde bir bulaşmış bir görünüm olurdu bozulmuş.

Bulaşıcı bir merkez tahlil sentetik RNA'ların spesifik enfeksiyon belirlenmesi için altın standarttır. Bu deney, (3 x 10 5 hücre / çukur) saf BHK-21 hücreleri ihtiva eden 6 oyuklu plakalar içinde 10-kat seri olarak seyreltilmiş elektroporate edilmiş hücrelerde eşit hacimde tohumlama, RNA örnekleri ile BHK-21 hücrelerini elektroporat ve agaroz çakıştırılarak yapıldı Hücre mono tabakaları üzerine. 4 gün süreyle inkübe edildikten sonra, kalan hücreler formaldehid ile sabitlendi ve kristal mor ile boyandı sların çözüme hücreleri (Şekil 6A) içine verilecek, enfeksiyöz RNA moleküllerinin sayısına karşılık gelir enfeksiyonlu merkezlerden (plaklar) sayısını ölçmek için. In vitro transkripsiyonu için kullanılan cDNA şablonu olmayan bulaşıcı olması için, kanıtlanmıştır yana transkripsiyon reaksiyon karışımı 27, bir kısım, doğrudan elektroporasyon için kullanılmıştır. Elektroporasyon RNA transfeksiyonundan için tercih edilen yöntemdir; Alternatif olarak, RNA DEAE-dekstran ve katyonik lipozomlar kullanılarak diğer yöntemler ile transfekte edilebilir. RNA elektroporasyon çok etkili olmakla birlikte, elektrik akımının "ark" Tuzlar elektroporasyon reaksiyonunda ya da elektroporasyon küveti yeniden, mevcut nadir oluşur. RNA-transfekte edilmiş hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu bir anti-NS1 tavşan antiserumu (Şekil 6B) kullanılarak imüno-deney ile araştırılmıştır. RNA-transfekte edilmiş hücrelerin yüzer maddeleri içinde biriken viral parçacıkların üretimi olan birplak deneyleri (Şekil 6C) tarafından alyzed. Bu deneylerin sonuçları, bir cDNA türevli sentetik RNA'ların rekombinan virüslerin yüksek titresi üreten permisif BHK-21 hücrelerinde enfeksiyon olduğunu açık bir şekilde göstermektedir.

Oligonükleotid Sekans, bir (5 'ila 3'), Pozisyon b Polarite
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisens
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 Duyu
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisens
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 KarıncaISENSE
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Duyu
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisens
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisens
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Duyu
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisens
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10.952-10.977 Antisens
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Duyu
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10.956-10.977 Antisens
SP6F cataccccgcgtattcccac
ta 		Duyu
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisens
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 Duyu
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisens
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Duyu
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisens
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Duyu
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisens
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10.670-10.694 Duyu
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10.954-10.977 Antisens
Bir JEV dizileri büyük harflerle gösterilir ve BAC dizileri küçük harflerle belirtilir.
b nükleotid pozisyonu JEV SA 14 -14-2 (Genbank erişim numarası JN604986) tam genom sekansı anlamına gelir.

Tablo 1: cDNA sentezi, PCR büyütmesi ve BAC mutagenezi için kullanılan oligonükleotidler.

figür 1
Figür 1.0, Strateji BAC olarak JEV SA 14 -14-2 bir tam boy cDNA'dan yapımı için JEV partiküllerden viral RNA'nın (A) izolasyonu.. JEV SA 14 -14-2 genomik RNA bir şematik diyagramı gösterilmiştir. Tüm viral genomu kapsayan (B) dört örtüşen cDNA parçalarının Sentezi (F4 F1). PBAC / F4 pBAC / F1 yaratan bir BAC vektörü içine dört örtüşen cDNA fragmanlarının (C) Altklonlaması. In vitro olarak run-off transkripsiyonu için klonlanmış cDNA'lar (D) modifikasyonu. pBAC / F1 SP6 viral 5'-ucunda akış yukarı SP6 başlatıcısı dizisini ihtiva pBAC / F1 bir türevidir. pBAC / F3 KO sessiz nokta mutasyonu (T → A 9134, yıldız) içeren pBAC / F3 bir türevidir. pBAC / F4 RO viral 3'-ucunun alt baş yapay Xba I run-off siteyi içeren pBAC / F4 bir türevidir. (E strong>) tam uzunlukta SA 14 -14-2 BAC Meclisi (pBAC / SA 14 -14-2). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
JEV SA 14 -14-2 tam uzunlukta genomik RNA kapsayan Şekil dört örtüşen cDNA fragmanlarının 2. N- (F1 ila F4). Dört RT-PCR ürünleri,% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile değerlendirilir. M, 1 kb DNA merdiveni. Dört cDNA fragmanlarının beklenen boyutları jel görüntüsünün altında belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
JEV bir tam boy bir cDNA SA 14 -14-2 ihtiva eden BAC Şekil 3. saflaştırılması. BAC plazmid E. izole edilir SDS-alkalin lisiz yöntemi ile coli DH10B ve ayrıca bir CsCl-EtBr gradyanı şeritleme ile saflaştırılmıştır. 16 × 76 mm yapışmalı polipropilen tüp kullanarak CsCl-EtBr degrade bir örnektir sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
JEV SA 14 -14-2 cDNA BAC monte tam uzunlukta bir bulaşıcı virüslerin geri kazanımı Şekil 4. bakış., CDNA şablonunun (A) doğrusallaştırılması. JEV BAC ile kesilir tam uzunluktaXba I ve MBN ile muamele edilmiştir. RNA transkriptlerinin (B) Sentezi. Doğrusallaştırılmış cDNA m 7 G (5 ') ppp (5'), bir başlık analogunun varlığında, SP6 RNA polimeraz tarafından transkribe edilmektedir. Sentetik JEVs (C) Kurtarma. In vitro transkripsiyonu RNA'lar sentetik bir virüs titresi yüksek üretir elektroporasyon ile BHK-21 hücrelerine transfekte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Bir cDNA, şablon olarak tam boyda JEV BAC kullanılarak in vitro transkripsiyon Şekil RNA'lar 5. sentezi. Linearize tam uzunlukta JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (A) üretimi. PBAC İki bağımsız klon/ SA 14 -14-2 (Cl.1 ve CL.2) MBN ile Xba I ile sindirim ve daha sonra tedavi ile lineerleştirilebilir edilir. Doğrusallaştırılmış BAC% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile incelenmiştir. Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca, sentetik RNA'ların (B) üretimi. İki linearize BAC'lerin her SP6 RNA polimeraz Çoğaltma transkripsiyonu için bir şablon olarak kullanılır. İki transkripsiyon reaksiyonları alikoları% 0.6 agaroz jeli üzerinde çalıştırılır. M, 1 kb DNA merdiveni. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Tam uzunlukta bir JEV BAC ve sentetik virüsün geri transkribe sentetik RNA'ların Şekil 6. Belirli enfeksiyon. BHK-21 hücreleri, fr türetilmiş RNA transkriptleri ile (Mock), elektroporasyona-sahte veya elektroporasyona olantam uzunlukta JEV BAC (Cl.1 ve CL.2) iki bağımsız klon, her om. (A) RNA enfekte. Hücreler agaroz ile örtüldü ve post-transfeksiyon 4 gün sonra kristal mor ile boyandı. RNA enfekte hücrelerin (sol panel), elektroporasyona enfeksiyöz RNA miktarını tahmin etmek için enfeksiyöz merkezi deneyleri ile belirlenir. Ayrıca enfeksiyonlu merkezlerden temsili görüntüleri (sağ panel) gösterilmiştir. (B) Protein ifadesi. Hücreler 4 oyuklu oda slaytlar kültürlenir. 20 saat post-transfeksiyon (hpt) RNA-elektroporate edilmiş hücrelerde viral protein ifadesi, bir birincil anti-NS1 tavşan antiserumu ve ikincil bir Cy3-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG (kırmızı) ile imüno-tahlilleri ile analiz edilir. Çekirdekleri 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile ters. Immunofloresan görüntüleri bunlara karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast görüntülerde üst üste. (C) Virüs verimi. Hücreler 1 kültürlenir50 mm kültür yemekleri. 22 ve 40 hpt RNA-electroporated hücrelerinin kültür yüzer biriken enfeksiyöz virionlann üretim plak tahlilleri tarafından incelenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Mevcut protokolü başarılı bir şekilde, iki farklı suşları (CNU / LP2 27 ve SA 14 -14-2 28) JEV,, fonksiyonel cDNA kanıtlamıştır oluşturmak için doğal zor bir flavivirüs ve tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonlarının üretilmesi için kullanılmıştır Çünkü konakçı hücre toksisitesi ve klonlanmış cDNA'dan genetik instabilitesi yaymak 8,74-76 Bu protokol, üç ana bileşeni içerir:. yüksek kalitede ters transkriptaz kullanılarak viral RNA'nın bir cDNA sadık bir kopyasının sentezi / amplifikasyon maksimize, birinci / bir DNA polimerazı; ikinci olarak, son, tam uzunlukta cDNA takımı adımları alt klonlama başlangıç ​​cDNA'dan çok düşük kopya sayılı vektör BAC (yayınlanmamış veriler), toksik sekanslar ihtiva eden viral prM-E kodlama bölgesini 74,77,78 klonlanması; ve üçüncü, görünüşe göre daha büyük bir DNA INSE tolere 120-350 kb, 19-21 arasında bir ortalama boyutu olan bir yabancı DNA için uygun bir klonlama vektörü kullanılarak BACdaha rts başka klonlama vektörleri yapmak. Bu klonlama yaklaşımı birçok pozitif sarmallı RNA virüsleri, ~ 10 ila 32 kb'lik bir büyük RNA genomu olan, özellikle de genel olarak geçerli olacaktır. Genom konukçu hücre ribozomlar tarafından proteinler çevrilir viral mRNA görür, çünkü enfeksiyon cDNA klonunun Generation, özellikle de pozitif sarmallı RNA virüsleri için, RNA virüs bir karşıt genetik sistem geliştirilmesi önemli bir adımdır. Bu durumda, viral replikasyon duyarlı bir konakçı hücreye bir cDNA kaynaklı genom uzunlukta RNA molekülünün yerleştirilmesi suretiyle başlatılabilir. Bulaşıcı JEV cDNA klonunun durumu, yeniden birleştirici DNA teknolojisi ile birlikte kullanıldığında, bu tip gen ekspresyonu 73,79 ve genom replikasyonu gibi, moleküler seviyede viral yaşam döngüsünün çeşitli yönlerine ilişkin anlaşılmasını artmıştır. 63,64 Ayrıca, tam uzunluktaki cDNA klonu JEV antiviral aşı 28 ve gen iletim vektörleri gelişimi için değerli bir alet olduğu kanıtlanmıştır. <sup> 80,81

Tüm pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi, yüksek derecede bulaşıcı RNA'lar, in vitro olarak sentezlenebilir olan JEV için güvenilir bir fonksiyon cDNA'yı oluşturmak birden çok kritik adım vardır. İdeal olarak, tam uzunluktaki cDNA klonu transkribe sentetik RNA'ların dizisi viral genomik RNA, viral RNA replikasyonunun başlatılması için gerekli olan, özellikle 5'- ve 3'-terminal dizilerinin aynı olmalıdır . 60-62 mevcut protokol otantik 5 've 3-uçları geçen alt baş viral genomunun birinci adenin nükleotid üst akışında SP6 promotör sekansını yerleştirilmesi ve yapay benzersiz Xba I sınırlama sitesi konumlandırılması sağlanmıştır sırasıyla, viral genomun timin nükleotid. Bir Xba I ile doğrusallaştırılmış ve MBN ile tedavi edilen cDNA te run-off transkripsiyonu ile üretildi otantik 5 've 3' uçları olan sentetik RNA'ların Kapaklımplate m 7 G (5 ') ile prime SP6 RNA polimerazı ppp (5'), bir başlık kullanarak analog. Bu protokol, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Bu içinde mevcut değilse, in vitro transkripsiyon için, bir bakteriyofaj RNA polimeraz (örneğin, T3 ya da T7) iyi tanımlanmış promotör sekansı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. 27, bir çalışma-dışı sitesi olarak, farklı bir kısıtlama alanı kullanılabilir doğrusallaştırılmış cDNA'dan viral genom ve eğer sentetik RNA otantik 3 'ucu ile biter. Sentetik RNA, 3 'ucunda üç veya dört virüs ilişkisiz nükleotidini ihtiva ettiği zaman, 3'-ucu nükleotid dizisinin önemi RNA enfekte bir ~ 10 kat azalma ile gösterilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda 27, her iki m 7 G (5 ') ppp (5'), A ve m 7 G (5 ') ppp (5') G kap analog 5 viral ikinci yerleri ne kadar alakasız bir ekstra G nükleotid yukarı aynı kalitede kullanılabilir '-end, ancakİlave enfeksiyon veya sentetik RNA replikasyonunu değiştirmez. 27 Ayrıca, DNase I sindirimi ile RNA transkriptlerinden cDNA şablonu çıkarılması RNA enfekte testler için gerekli değildir, cDNA şablonu kendisi bulaşıcı değildir, çünkü. 27

BAC teknolojisi artık pozitif sarmallı RNA virüslerinin, yani, iki JEVs, CNU / LP2 27 ve SA 14 -14-2 28 (genom boyutu, ~ 11 kb) bir avuç enfeksiyon cDNA klonlarının oluşturulması uygulanmıştır; İki dang virüs, BR / 90 26 ve NGC 29 (~ 11 kb); sığır viral diyare virüsü, SD1 (~ 12 kb) 25 iki domuz vebası virüsleri, C ve Paderborn (~ 12 kb) 24 sınır hastalığı virüsü, Gifhorn (~ 12 kb) 24 domuz üreme ve solunum sendromu virüsü , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb) 30 bulaşıcı gastroenterit virüsü, PUR46-MAD (~ 29 kb) 16 kedi bulaşıcı peritonit virüsü,DF-2 (~ 29 kb) 32 ağır akut solunum sendromu coronavirus, Urbani (~ 30 kb) 9 MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb) 17 ve insan koronavirüsü, OC43 (~ 31 kb) 31 cDNA yapımı için BAC'ler kullanılarak ana avantajı, büyük, 1- ya da 2-kopyalama BAC plazmidlerin yüksek genetik stabilitesidir.; Bununla birlikte, son derece düşük kopya sayısı iç yapısı nedeniyle BAC DNA ve kromozomal DNA'yı barındıran göre BAC DNA saflıkta azalmasının çok düşük verimleri, aynı zamanda büyük bir dezavantaj teşkil etmektedir. Geçerli protokolde, BAC DNA verimi E. büyüyen maksimize edilir coli DH10B bir besin açısından zengin bir ortamda, 2xYT içinde / bulaşıcı BAC pBAC ile SA 14 -14-2 dönüştürdü. Bu çabaya rağmen, ortalama verim sadece ~ 15 ug 2xYT suyu 500 ml BAC DNA taşımaktadır. Ayrıca, BAC DNA saflığı en iyi temizleme için CsCl-EtBr yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilirOldukça yaygın olarak kullanılan kolon bazlı plazmid izolasyon daha. Ancak, akılda tutulması gereken önemli olduğunu BAC-dönüştürülmüş E. klonlanmış cDNA genetik istikrarı tehlikeye olabilir çünkü coli sarmak olmamalı ve yüksek büyüme mutlaka büyük verimleri veya daha yüksek saflıkta BAC DNA yol açmaz.

Burada açıklanan protokol JEV bir BAC olarak genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonunun inşaat ve yayılması için optimize edilmiş, etkili ve akıcı bir yöntemdir, bir prosedür bir kez pratik olarak imkansız düşünülmektedir. Bu, aynı klonlama stratejisi aynı zamanda pek çok diğer pozitif sarmallı RNA virüsü tatbik edilebilir. Genel olarak, bulaşıcı cDNA klonları, viral replikasyon ve patogenezinde biyolojik fonksiyonlarını incelemek için, bir viral RNA genomu içine mutasyon (örneğin, silmeler, girmeler ve nokta mutasyonları) çeşitli tanıtmak için olanak sağlar. Bu cDNA tabanlı ters genetik sistemi geliştirmek mümkün ve tes kılart aşısı ve belirli bir ilgi pozitif sarmallı RNA virüsü oluşturma faktörünü (ler) hedefleyen terapötik aday. Buna ek olarak, bu bulaşıcı cDNA'dan teknolojisi de biyomedikal araştırmalarda birçok uygulama için, ilgili bir yabancı gen (ler) ifade edebilen bir virüs vektörü olarak kullanılabilir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

İmmünoloji Sayı 106 genetik bulaşıcı cDNA bakteriyel yapay kromozom RNA virüsü tek iplikli pozitif anlamda enfeksiyon çoğaltma patogenez flavivirüs Japon ensefaliti virüsü ters
Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter