Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriell artificiella kromosomer: En funktionsgenomik verktyg för studier av styrd trängade RNA-virus

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

För RNA virologer, tillkomsten av rekombinant DNA-teknik i slutet av 1970 gjorde det möjligt att omvandla virala RNA-genom i cDNA-kloner, som sedan skulle kunna förökas som plasmider i bakterier för genetisk manipulation av RNA-virus. 1 Den första RNA-virus att vara molekylärt klonade var bakteriofag QP, en positiv sträng RNA-virus som infekterar Escherichia coli. En plasmid innehållande en fullständig cDNA-kopia av Qp genomiskt RNA gav upphov till infektiösa Qp fager när de införs i E. coli. 2 Kort därefter, var denna teknik tillämpas på poliovirus, en positiv sträng RNA-virus hos människor och djur. En plasmid som bär en fullängds-cDNA av poliovirusgenomiskt RNA infektiöst när den transfekteras in i däggdjursceller och kan producera infektiösa virioner 3 I denna "DNA-lanserade", bör de klonade cDNA transkriberas intracellulärt för att initiera viral RNA-replikering.;emellertid är det oklart hur transkription initieras och hur transkripten bearbetas till rätt virala sekvensen. Denna oro har lett till utvecklingen av en alternativ "RNA-lanserade" strategi, som innebär en fullständig cDNA-kopia av det virala RNA-genomet klonas i en promotor som känns igen av ett E. coli eller fag-RNA-polymeras för produktion av syntetiska RNA in vitro med definierad 5 'och 3' termini, som genomgår den fullständiga virala replikationscykeln när de införs i värdceller. 4,5 Den första framgången med detta tillvägagångssätt rapporterades för brommosaikvirus , 6,7 en positiv-sträng-RNA-virus av växter. Sedan dess har RNA lanserade metod utvecklats för ett brett spektrum av positiva trängade RNA-virus, inklusive caliciviruses, alfavirus, flavivirus, arteriviruses och coronavirus. 1,4,5,8

I både DNA- och RNA-lanserade omvänd genetik system, byggandet av en full-cDNA-klonen är nyckeln till att generera infektiös DNA eller RNA med positiv-sträng-RNA-virus, men det blir en avsevärd teknisk utmaning som storleken av det virala genomet ökar. 9-17 I synnerhet har en stor RNA-genomet av ~ 10 -32 kb presenterar tre stora hinder för kloning av en fullängds-funktionell cDNA. 18 Den första svårigheten är syntesen av en trogen cDNA-kopia, eftersom trohet RT-PCR är omvänt proportionell mot längden av det virala RNA. Det andra hindret är förekomsten av potentiellt toxiska sekvenser, eftersom långa RNA-molekyler är mer att innehålla oväntade sekvenser med förmåga att göra cDNA-fragmentet i plasmider instabila i E. sannolikt coli. Den tredje och mest kritiska frågan är tillgången till en lämplig vektor, eftersom det är svårt att hitta en kloningsvektor som kan inrymma en viral cDNA-insatsen i> 10 kb. Under de senaste tre decennierna har dessa hinder övervunnits av flera framsteg inom enzymologi, metodik, end vectorology. 1,4,5,8 Av dessa är den mest lovande och innovativ utveckling kloning av stora positiva trängade RNA-virus som smitt bakteriella artificiella kromosomer (BAC). BAC vektorn är en låg-kopia klonings plasmiden (1-2 kopior / cell) baserat på E. coli-fertilitet faktor, med en genomsnittlig DNA-insertstorlek på ~ 120-350 kb 19-21 Ett DNA-fragment insattes i BAC-vektorn på ett liknande sätt att kloning i allmänna kloningsvektorer.; de erhållna BAC-kloner är stabila under många generationer i E. coli. 22,23 Hittills har BAC teknik använts för att skapa infektiösa cDNA-kloner för> 10 medlemmar av tre positivt RNA-virus familjer dvs Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 och Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32

Med hjälp av japanskt encefalitvirus (JEV) som ett exempel, detta arbete rapporterar de detaljerade förfaranden som kan varaanvänds för att konstruera en genetiskt stabil fullängds infektiöst BAC för en mängd olika positiv-sträng-RNA-virus. JEV är en zoonotisk flavivirus 33 som överförs i naturen mellan fåglar, grisar och andra vertebratvärdar genom mygga vektorer. 34,35 Hos människa kan JEV-infektion orsaka allvarlig ofta dödlig neurologisk sjukdom japansk encefalit (JE), 36 som uppträder i Asien och delar av västra Stilla havet, 37,38 med en beräknad årlig förekomst av ~ 50,000-175,000 kliniska fall. 39,40 Genomet hos JEV är en ~ 11 kb, enkelsträngade, positiv sens-RNA-molekylen och består av en enda öppen läsram (ORF) flankerad av två icke-kodande regioner (NCRS) vid 5 'och 3' ändarna. 41,42 ORF kodar för ett polyprotein som klyvs av värd och virala proteaser för att generera 10 enskilda proteiner, betecknade C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B och NS5 i N- till C-terminal riktning. 34,43,44 Dessutom, en eXtended form av NS1 (NS1) uttrycks med -1 ribosomal frameshifting vid kodon 8-9 av NS2A. 45,46 Av dessa 11 proteiner, de tre strukturella proteiner (C, prM och E) är nödvändigt för bildandet av smitt virioner, 47,48 och de återstående åtta icke-strukturproteiner (NS1 till NS5, och NS1 ") är avgörande för viral RNA-replikation, 49-51 partikelsammansättning, 52-56 och medfödd immunitet skatteflykt. 57-59 Både 5'- och 3 "NCRS innehåller konserverade primära sekvenser och bildar RNA sekundära / tertiära strukturer, 60-62 som är viktiga för att modulera viralt RNA-replikation. 63,64

Detta protokoll beskriver de verktyg, metoder och strategier för att generera en fullängds smittsam BAC av JEV SA 14 -14-2. 28 Detta funktionella BAC-klon innehåller en komplett cDNA-kopia av JEV genomiskt RNA, 65, som omges av en promotor för SP6-RNA-polymeras uppströmsav den virala 5'-änden och ett unikt Xbal-restriktionsställe nedströms om den virala 3'-änden för in vitro-avrinning transkription. Denna BAC teknologi är tillämpbar på att bygga en fullt fungerande cDNA molekylär klon för en rad positiva trängade RNA-virus.

Protocol

Anmärkning: Figur 1 visar en strategi för byggandet av en fullängds-infektiös JEV-cDNA som en BAC 28 Tabell 1 innehåller en lista över de oligonukleotider som används i detta protokoll 28..

1. Utdrag Viral RNA från JEV Partiklar i cellkultursupernatanterna

  1. Börja med cellodlingsmedium innehållande JEV SA 14 -14-2, en levande JE vaccinvirus som kräver biosäkerhetsnivå 2 inneslutning.
    Obs: Den virala titern är ca 1-3 x 10 6 plackbildande enheter / ml.
  2. Ta den utbildning som krävs biosäkerhet för alla vanliga mikrobiologiska metoder, säkerhetsutrustning och laboratorielokaler före att arbeta med JEV SA 14 -14-2.
  3. Rena viralt RNA från en alikvot av virusinnehållande cellodlingsmedium med användning av en monofasisk lösning av fenol och guanidinisotiocyanat 66 (Figur 1A).
    1. A.dd 600 pl av monofasiska reagens till 200 pl av kultursupernatanten i en 1,7 ml mikrorör. Homogenisera blandningen för hand-skaka röret kraftigt i 30 sek och inkubation under 5 min vid RT.
    2. Lägg 160 pl kloroform till den homogeniserade provet. Blanda noggrant för hand-skaka röret kraftigt i 15 sek och lämnar den för 2-3 min vid rumstemperatur.
    3. Centrifugera det totala lysatet vid 13,400 x g under 15 min vid 4 ° C, vilket resulterar i en separation av två vätskefaser, dvs., en lägre organisk fas och en övre vattenfas. Överför den övre vattenhaltiga fasen (mindre än 200 | j, l) innehållande RNA i ett annat mikrorör.
    4. Fälla ut RNA genom tillsats av 1 pl av 5 pg / pl glykogen och 400 | il av 100% isopropanol och inkubering under 10 min vid RT.
    5. Centrifugera blandningen vid 13,400 x g under 10 min vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten och tvätta RNA-pelleten med en ml 75% etanol genom puls virvling 3 till 5tider och centrifugering vid 13,400 x g under 5 min vid 4 ° C.
    6. Lufttorka RNA-pelleten i 10 min och lös den i 40 | il dH2O Förvara extraherade RNA vid -80 ° C fram till användning.

2. syntetisera en uppsättning av fyra överlappande cDNA fragment (F1 till F4) som spänner över hela Viral Genomic RNA med omvänd transkription (RT) -PCR

  1. Utför en 20 | il RT-reaktion med en 10 | il alikvot av det renade virala RNA som mall och en modifierad form av Moloney murint leukemivirus omvänt transkriptas. 67
    1. Inrätta en 13 pl blandning innehållande 10 pl renat RNA, 1 pl 10 mM dNTP-blandning, 1 pl 4 pmol / ul primer och 1 pl dH 2 O. Använd fragment-specifik primer för varje RT reaktion: 1RT för F1, 2RT för F2, 3RT för F3 och 4RT för F4.
    2. Inkubera blandningen vid 65 ° C under 5 minuter, placera på is under 1 min och därefter snabb-dragning för att samla in de contents i botten av röret.
    3. Lägg 4 pl 5 x RT-buffert, 1 | il 0,1 M DTT, 1 | il 40 U / ^ RNas-inhibitor, och en pl 200 U / ^ omvänt transkriptas. Blanda genom att pipettera upp och ned tre till fem gånger.
    4. Låt reaktionen fortgå vid 50 ° C under 1 timme, varefter värmeinaktivering av provet vid 70 ° C under 15 minuter. Förvara den syntetiserade första sträng-cDNA vid -20 ° C tills användning.
  2. Utför en 100 pl PCR-reaktion med en 5 pl alikvot av värmeinaktiv RT-reaktionen som ett templat och en high-fidelity termostabilt DNA-polymeras 68 (Figur 1B).
    1. Sätt upp en 100 pl PCR-reaktion på is, innehållande 5 | il av RT-reaktionen, 20 ^ il 5 x PCR-buffert, 4 | il 10 mM dNTP-blandning, 5 pl 10 pM framåtriktad primer, 5 | al 10 | iM bakåtriktad primer, 1 | il 2 U / | il DNA-polymeras och 60 | j, l dH2O Använd fragmentet specifikt primerpar för varje PCR reaction: 1F + 1R för F1 (2573 bp), 2F + 2R för F2 (4171 bp), 3F + 3R för F3 (3922 bp), och 4F + 4R för F4 (1798 bp).
    2. Blanda försiktigt genom finger vända röret tre till fem gånger och centrifugera kort att samla innehållet i botten.
    3. Börja termocykling med ett initialt denatureringssteg av 30 sek vid 98 ° C, följt av 25-30 cykler med följande PCR-profil: 10 sek vid 98 ° C, 30 sekunder vid 60 ° C och 1-2 min (30 s / kb) vid 72 ° C. Förvara PCR-produkterna vid 4 ° C tills de analyserades.
  3. Kör ett 2-5 | j, l alikvot av varje PCR-reaktion på en 0,8% agarosgel innehållande 0,5 ^ g / ml etidiumbromid (EtBr) (Figur 2).
    VARNING: EtBr är en potent mutagen och kräver rockar, skyddsglasögon och handskar för att bäras och extrem försiktighet iakttas vid användning, lagring och avfallshantering.

3. klon Varje fyra cDNA fragment (F1 till F4) i en BAC Vector Skapa pBAC / F1 till pBAC / F4 by molekylära kloningstekniker

  1. Smälta vektorn och infoga DNA med två lämpliga restriktionsendonukleaser, enligt följande:
    1. Utför en sekventiell digerering av pBAC / PRRSV / FL (vektor), 30 ett derivat av pBeloBAC11 plasmiden (7507 bp, GenBank accessionsnummer U51113), med Pmel och Not I i en total volym av 60 | il (innehållande ~ 500 ng DNA , 10 U enzym, 1x digereringsbuffert, och 1 x BSA) vid 37 ° C under 12 till 15 h, vilket ger den 15.426 bp vektorfragmentet.
    2. Utför en sekventiell nedbrytning av vart och ett av de fyra cDNA amplikonema (infoga) med Sma I och Not I i en total volym på 60 ^ (innehållande ~ 1 mikrogram DNA, 20 U enzym, 1 × matsmältningen buffert, och 1 x BSA) vid 25 ° C (Smal) eller 37 ° C (Not I) för 12 till 15 timmar, vilket ger följande insert fragment av önskad storlek: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), och F4 (1784 bp).
  2. Rena denönskade vektorn och infoga DNA-fragment genom gel-extraktion.
    1. Separera de dubbelt spjälkade produkterna på en 1% låg smältpunkt agarosgel innehållande 0,5 | ig / ml EtBr. Skär ut ett band av det önskade DNA-fragmentet med en minimal mängd av agaros (vanligtvis ~ 200 | al) under långvågigt ultraviolett ljus.
    2. Tillsätt en lika volym av TEM-buffert (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA och 10 mM MgCl2) till den utskurna agarosen i en 1,7 ml mikrorör. Inkubera provet vid 72 ° C under 10 till 15 minuter, med vortexa varje 2-3 min tills agarosen har smält helt.
    3. Tillsätt en lika volym av förvärmd buffert-mättad fenol, skaka kraftigt under 1 min, och centrifugera vid 13,400 x g under 10 min vid RT.
      Obs: Blandningen separeras i en undre organisk fas och en övre vattenfas. Överför den övre vattenhaltiga fasen innehållande DNA i ett annat mikrorör.
    4. Tillsätt en lika stor volym kloroform: isoamylalkohol (24: 1), virvel under 1 min, och centrifugera vid 13,400 x g under 10 min vid RT. Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett nytt mikrorör.
    5. Tillsätt 0,5 pl av 10 ug / ul jäst tRNA, 1/10 volym 3 M natriumacetat och 2,5 volymer av 100% etanol. Hålla blandningen på is under 20 minuter.
    6. Centrifugera blandningen vid 13,400 x g under 10 min vid RT. Avlägsna supernatanten och tvätta DNA-pelleten med 1 ml 70% etanol genom puls-virvling tre till fem gånger och centrifugering vid 13,400 x g under 10 minuter.
    7. Lufttorka DNA-pelleten i 10 min och lös den i 20 | il TE-buffert (10 mM Tris-Cl och 1 mM EDTA [pH 7,6]).
  3. Ligera önskade vektorn och infoga DNA-fragment med användning av T4 DNA-ligas.
    1. Sätt upp en 20 | il ligeringsreaktion innehållande 50-100 ng av vektor-DNA, en ~ 3-faldigt molärt överskott av insatt DNA, 400 U T4 DNA-ligas, och 1 x ligeringsbuffert. Inkubera ligeringsreaktionen vid 16 ° C under 12-15 h.
      Obs: Inkludera en negativ control reaktion, det vill säga enbart vektor utan insatsen, parallellt.
    2. Utför fyra separata ligeringar, varje gå med 15.426 bp Pme-Notl-fragmentet av pBAC / PRRSV / FL med 2559-bp (för F1), 4157-bp (för F2), 3908-bp (för F3), eller 1784 bp (för F4) Smal-NotI-fragmentet av en av de fyra cDNA-amplikoner, för att generera subkloner pBAC / F1 till pBAC / F4.
  4. Omvandla det ligerade DNA i E. coli DH10B av CaCl2 -HEAT chockmetoden.
    1. Ta 100 | il alikvoter av CaCl 2 -behandlade kompetenta DH10B-celler 69 lagrades vid -80 ° C och tina dem på is.
      Obs: Använd 100 pl celler per omvandling.
    2. Lägg till en 10 ul alikvot av DNA ligeringsreaktionen till 100 pl av de upptinade cellerna i en 1,7 ml mikrorör, blanda försiktigt genom att knacka på röret och hålla på is under 30 minuter.
    3. Värmechock DNA-cellblandningen under 45 sekunder i en 42 ° C water bad, plats på is i 2 minuter, och sedan lägga till 900 il LB-buljong förvärmas till RT.
    4. Inkubera de värmechock celler vid 35 ° C under 1 h, med skakning vid 225-250 rpm.
    5. Sprid 50 till 200 | il alikvoter av de odlade cellerna på LB-agarplattor innehållande 10 | j, g / ml kloramfenikol (CML). Håll plattorna vid RT, med rätsidan uppåt, tills de är torra.
    6. Vänd plattorna upp och ned och inkubera vid 35 ° C under 15 h.
  5. Återvinna det klonade BAC-DNA från värdcellerna genom en kolumnbaserad reningsmetod (Figur 1C).
    1. Pick sex till åtta bakteriekolonier från LB-Cml agarplattor och ympa in dem i 3 ml 2xYT-buljong innehållande 10 | ig / ml Cml. Inkubera kulturer vid 35 ° C under 10 h med kraftig skakning (225-250 rpm).
    2. Isolera rekombinant BAC DNA 1-1,5 ml av bakteriekulturer med hjälp av spinnkolonner, enligt anvisningar från tillverkaren. 70 Eluera det extraherade DNA (typitiskt 100-200 ng) i 20 yl TE-buffert.
    3. Utför två analytiska restriktionsenzymdigestioner av de isolerade BAK för ~ 6 h i en total volym av 10 | j, l, en för att identifiera närvaron av vektorn med en korrekt insatta materialet med användning av samma enzymer som används för kloning (se protokoll 3,1), och den andra att testa integriteten av de klonade BAC med ett lämpligt enzym (t ex Bglll, Ncol, eller PstI), generera ett unikt restriktionsfragmentmönstret.
    4. Propagera korrekt klonade BAK genom inokulering 500 fil av de positiva bakteriekulturer (från protokoll 3.5.1) i 500 ml 2 x YT-Cml-medium och odling av inokulum för 6 h vid 35 ° C under skakning vid 225-250 rpm. Rena BAC DNA (vanligen 10-20 mikrogram) från 500 ml kultur med hjälp av filter kolonner, som rekommenderas av tillverkaren. 71
      Obs: De första fyra BAC subkloner, vardera innehållande en cDNA fragment av JEV genomiskt RNA, kan visa sig ha påe eller mer oönskad mutation (er) jämfört med konsensussekvensen av det virala genomet 42 (som fungerar som en referenssekvens). En sådan mutation måste korrigeras genom PCR-baserad webbplats riktad mutagenes före monteringen av en fullängds-JEV-cDNA. 27

4. Skapa en full längd JEV cDNA med 5 'SP6 promotorn och 3' Run-off Site

  1. Gör tre genetiska modifieringar (se nedan protokoll 4.1.1-4.1.3) i de klonade cDNA att släppa in vitro avrinning transkription av genomlängds RNA med den autentiska 5 'och 3' ändarna av det virala genomet.
    1. Införa ett SP6-promotorn direkt uppströms om 5 'änden av det virala genomet genom överlappande extensions-PCR (figur 1D, pBAC / F1 SP6).
      1. Förstärk två överlappande DNA-fragment via den första standarden PCR av pBAC / F1 med de två primerparen SP6F + SP6R (produktens storlek, 173 bp) och F1F + F1R (produkt size, 676 bp), var och en i en 50 pl reaktion innehållande 1 pl mall-DNA (~ 200 pg / pl), 10 pl 5 x PCR-buffert, 2 pl 10 mM dNTP, 2,5 pl vardera 10 iM framåt och bakåt primers, 0,5 il 2 U / ul DNA-polymeras, 68 och 31,5 pl dH 2 O. Utför PCR med användning av följande cykelprofil: 98 ° C under 30 sek, och 25 cykler av 98 ° C under 10 sek, 60 ° C under 30 sek, och 72 ° C under 20 sek.
      2. Gel-rena de två PCR-amplifierade DNA-fragment efter att ha kört var och en av de två PCR-produktema på en 1,5% lågsmältande agarosgel, såsom beskrivs i protokoll 3,2.
      3. Smälta de två gel-renade DNA-fragment via den andra fusions-PCR med användning av den yttersta primrar SP6F + F1R (produktstorlek, 821 bp) i en 100 pl reaktion inklusive 1 | il vardera av de två renade DNA-fragment (~ 100 pg / | il), 20 | il 5 x PCR-buffert, 4 | j, l 10 mM dNTP, 5 | il vardera av 10 pM framåt och bakåt primrar, 1 | il2 U / mikroliter DNA-polymeras, 68 och 63 pl dH 2 O. Använd följande termisk cykling profil: 98 ° C under 30 sek, och 25 cykler av 98 ° C under 10 sek, 60 ° C under 30 sek, och 72 ° C under 30 sek.
      4. Gel-rena smält PCR amplikon från en 1% låg smältpunkt agarosgel, som beskrivs i protokoll 3.2.
      5. Utför fem steg kloning förfarande som beskrivs i protokollen 3,1-3,5 att ligera 760 bp Pac I- Bsi WI fragment av gel-renade smält PCR amplikon med 9532-bp Pac I- Bsi WI fragment av pBAC / F1 för att generera pBAC / F1 SP6.
    2. Avlägsna befintlig, inre Xbal-stället vid nukleotid 9131 genom införande av en tyst punktmutation (A 9134 → T) via överlappnings extensions-PCR (figur 1D, pBAC / F3 KO).
      1. Förstärk två överlappande DNA-fragment av den första standarden PCR av pBAC / F3 med två primerpar x1F + X1R(produktstorlek, 746 bp) och X2F + X2R (produktens storlek, 316 bp) i en 50 pl reaktion under de experimentella betingelser som beskrivs i protokoll 4.1.1.1.
      2. Gel-rening de två PCR-förstärkta DNA-fragment efter elektro separation på 1,5% låg smältpunkt agarosgeler, som beskrivs i protokoll 3.2.
      3. Smälta de två gel-renade DNA-fragment via den andra fusions-PCR med användning av yttersta primrar x1F + X2R (produktstorlek, 1033 bp) i en 100 | il reaktion under de experimentella betingelser som beskrivits i protokoll 4.1.1.3.
      4. Gel-rena smält PCR amplikon från en 1% låg smältpunkt agarosgel, som beskrivs i protokoll 3.2.
      5. Utför fem steg kloning förfarande som beskrivs i protokollen 3,1-3,5 att ligera 949-bp Avr II Notl fragment av gel-renade smält PCR amplikon med 16.245 bp Not I- Bsi WI och 2141-bp Bsi W I - Avr Il-fragment av pBAC / F3 för att producera pBAC / F3 KO.
      </ li>
    3. Engineer en ny artificiell Xbal avrinning stället strax nedströms om 3 '-änden av det virala genomet genom PCR-baserad sätesstyrd mutagenes (Figur 1D, pBAC / F4 RO).
      1. Skapa ett DNA-fragment genom PCR av pBAC / F4 med primers ROF + ROR (produktstorlek, 324 bp) i en 100 pl reaktion innehållande 1 pl mall-DNA (~ 200 pg / pl), 20 pl 5 x PCR-buffert, 4 pl 10 mM dNTP, 5 pl vardera av 10 iM framåt och bakåt grundfärger, 1 pl 2 U / ul DNA-polymeras, 68 och 64 pl dH 2 O. Utför PCR med användning av följande cykelprofil: 98 ° C under 30 sek, och 25 cykler av 98 ° C under 10 sek, 60 ° C under 30 sek, och 72 ° C under 15 sek.
      2. Gel-rena PCR-amplifierade DNA-fragmentet från en 1% låg smältpunkt agarosgel, som beskrivs i protokoll 3,2.
      3. Utför fem steg kloning förfarande som beskrivs i protokollen 3,1-3,5 att ligera 283 bp Sfi I- Not I fragment av gel-renade PCR-amplikon med 16.933 bp Sfi-Notl-fragmentet av pBAC / F4 för att skapa pBAC / F4 RO.
  2. Montera en uppsättning av de fyra modifierade, överlappande cDNA i en fullängds SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) genom att gå på tre naturliga restriktionsställen (BSR GI, BamHI, och Aval ) i ett sekventiellt sätt med hjälp av fem steg kloning förfaranden som anges i protokollen 3,1-3,5 (Figur 1E): F1 SP6 → F1 SP6 F2 (genom att ersätta BSR G-Notl-fragmentet av pBAC / F1 SP6 med den för pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (genom att ersätta Bam H-Notl-fragmentet av pBAC / F1 SP6 F2 med som pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (genom att ersätta Ava-Notl-fragmentet av pBAC / F1 SP6 F2F3 KO med som pBAC / F4 RO).

5. Förbered en hög renhet Maxi-prep av Full längd SA 14 -14-2 BAC

  1. Väx en enda koloni av E. coli DH10B bär pBAC / SA 14 -14-2 i 3 ml 2 x YT-buljong innehållande 10 | ig / ml Cml för 10 h vid 35 ° C med skakning vid 225 till 250 varv per minut, och sedan skala upp genom att ympa 500 | il av 10 h bakteriekultur i 500 ml 2 x YT-Cml-medium och odling av inokulum för 6 h vid 35 ° C under kraftig skakning.
  2. Centrifugera bakteriekulturen i två 250 ml flaskor vid 3107 x g under 15 min vid 4 ° C. Resuspendera varje pelleten i 30 ml GTE-lösning (50 mM glukos, 25 mM Tris-Cl, och 10 mM EDTA [pH 8,0]), och sedan lägga till 500 pl 60 mg / ml lysozym. Inkubera de två cellsuspensioner på is under 10 minuter.
  3. Tillsätt 60 ml nyligen gjorda Lysis-lösning (0,2 N NaOH och 1% SDS) till varje cellsuspension, blanda väl tills den blir klar, och hålla lysatenvid RT under 10 minuter.
  4. Lägg 45 ml neutralisering lösning (100 ml, bestående av 60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml isättika och 28,5 ml dH 2 O) till varje flaska, blanda väl genom att vända flaskorna, och inkubera neutraliserade lysat på is under 10 min.
  5. Centrifugera neutraliserade lysaten vid 18.566 x g under 20 min vid 4 ° C. Överför supernatanten från båda flaskorna i två nya 250 ml flaskor; lägga 0,6 volym av 100% isopropanol till varje, och hålla dem på is under 20 minuter.
  6. Centrifugera ner fällningarna vid 18.566 x g under 20 min vid 4 ° C. Upplös varje pellet i 5 ml TE-buffert, kombinera dem i en 50 ml rör (totalt 10 ml), och fälla ut RNA genom tillsats av en lika stor volym av 5 M litiumklorid. Inkubera blandningen på is under 10 minuter.
  7. Centrifugera RNA fällningen vid 14.636 x g under 20 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt 250 ml rör och utfälla DNA genom att tillsätta 2 volymer av 100% isopropanol.Inkubera blandningen på is under 20 minuter.
  8. Centrifugera ner DNA-fällningen vid 18.566 x g under 20 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten, återsuspendera DNA-pelleten i 9,5 ml TE-buffert (pH 7,6), och tillsätt 10 g cesiumklorid (CsCl) och 390 pl av 10 mg / ml EtBr.
  9. Ladda DNA-CsCl-EtBr lösningen i en 16 x 76 mm förslutningsbar polypropylen rör med hjälp av en spruta försedd med en 18 G nål. Snurra förseglade CsCl-gradient i en ultracentrifug vid 401.700 x g under 16 h vid 20 ° C (Figur 3).
  10. Samla en DNA-band av BAC-plasmiden från CsCl-gradient med användning av en 18 G nål för att skapa en luftventil i toppen av gradienten och en 20 G nål-försedd spruta för att hämta BAC-DNA från den sida av gradienten.
  11. Lägg 2,5 volymer dH 2 O-mättad butanol till EtBr-färgade BAC DNA-prov och blanda genom att vortexa. Centrifugera blandningen vid 13,400 x g under 1 min och överföra den lägre vattenfasen i ett annat 1,7 ml mikrotube. Upprepa denna procedur sex gånger.
  12. Fälla ut EtBr fria BAC-DNA genom tillsats av 1/10 volym av 3 M natriumacetat och 2,5 volymer 100% etanol till den butanol-extraherade BAC-DNA och inkubering under 10 min på is. Centrifugera fällningen vid 13,400 x g under 10 minuter, tvätta DNA-pelleten med en ml 70% etanol, och återpelletera den genom centrifugering.
  13. Lufttorka DNA-pelleten i 10 min och upplösa den i 200 | il TE-buffert (pH 7,6).
    Obs: Figur 4 visar en översikt av omvänd genetik system för JEV SA 14 -14-2.

6. Transkribera Syntetiska RNA in vitro från en Linjäriserad Hellång JEV BAC DNA

  1. Utför en storskalig restriktionsenzymdigerering av pBAC / SA 14 -14-2 med Xbal i en total volym av 100 | il (innehållande 3 pg DNA, 60 U enzym, ett x nedbrytningsbuffert och 1 x BSA) vid 37 ° C i 12-15 h. Undersök en 3 | il alikvot av digestion reaktion på en 0,8% agarosgel innehållande 0,5 | ig / ml EtBr.
  2. Inkubera uppslutningsreaktionen ytterligare med 25 U av mungbönnukleas (MBN) vid 30 ° C under 2 h (figur 4A).
  3. Bringa volymen av Xbal-digererad, MBN behandlade provet upp till 300 | il med dH2O Tillsätt en lika stor volym fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) till det spädda provet, skaka kraftigt under 1 minut, centrifugera vid 13,400 x g under 10 minuter, och sedan överföra den övre vattenfasen till ett nytt 1,7 ml mikrorör. Tillsätt en lika stor volym kloroform och upprepa extraktionsmetoden.
  4. Återvinn fenol / kloroform-extraherades, linjäriserad BAC genom etanolutfällning: Lägg 1/10 volym av 3 M natriumacetat och 2,5 volymer 100% etanol, och inkubera på is under 20 minuter. Centrifugera fällningen vid 13,400 x g under 10 minuter, tvätta DNA-pelleten med 1 ml 70% etanol, och sedan snurra den genom återcentrifugering.
  5. Lufttorka DNA pelleton för 10 min och lös den i 30 pl dH 2 O. Undersök en 1 | il alikvot av den återvunna BAC på en 0,8% agarosgel med 0,5 | ig / ml EtBr (figur 5A).
  6. Utför en avrinning transkription av den linearise BAC-DNA i en total volym av 25 | il (innehållande ~ 200 ng mall-DNA, 0,8 mM cap-analog [m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTP, 40 U RNas-inhibitor, 20 U SP6 RNA-polymeras, 72 och 1 x transkriptionsbuffert) vid 37 ° C under 1 h (figur 4B). Inkludera 0,5 iM [3 H] UTP för RNA kvantifiering på grundval av [3H] UTP bolagsordning, som övervakas av adsorption DE-81 filterpapper. 69
  7. Kör ett 1-2 | j, l alikvot av avrinningstranskriptionsreaktion på en 0,6% agarosgel innehållande 0,5 | ig / ml EtBr (figur 5B).

7. Bestäm RNA Smitt och virus Yield

  1. Cultivate BHK-21-celler i 150 mm Culture rätter på en densitet av 3 x 10 6 celler / skål för 24 h vid 37 ° C med 5% CO2.
    Obs: Bibehåll de BHK-21-celler i alfa minimalt essentiellt medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 2 mM glutamin, vitaminer, och penicillin / streptomycin.
  2. Skölj cellmonoskiktet med 10 ml kall lösning A (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 8,1 mM Na 2 HPO 4, och 1,5 mM KH 2 PO 4). Drag av cellerna från skålarna genom behandling med 4 ml av trypsin-EDTA (0,25%), och samla dem genom centrifugering vid 270 x g i en skrivbordscentrifug under 2 minuter.
  3. Resuspendera cellpelleten med 50 ml kall lösning A i ett 50 ml koniskt rör och centrifugera cellsuspensionen vid 270 x g under 2 minuter. Upprepa detta tvättförfarande tre gånger; Efter den sista tvättningen, resuspendera cellpelleten vid en densitet av 2 x 10 7 celler / ml i Sol A.
  4. Blanda en 400 | il alikvot av cellsuspension med 2 μg syntetisk RNA i en 2-mm spalt kyvett, och snabbt elektroporera blandningen med en elektroporator under optimala elektroporer betingelser: 980 V, 99 ^ sek pulslängd, och 5 pulser (figur 4C).
    Obs! Använd 3 H-märkt RNA syntetiseras i protokoll 6.5 direkt för elektroporering utan ytterligare rening.
  5. Låt de elektroporerade cellerna vid RT under 10 min och överför till en 1,7 ml mikrorör innehållande 600 ul av komplett odlingsmedium.
  6. Bered en 10-faldig serieutspädning av de elektroporerade cellerna i 1 ml komplett odlingsmedium och plattan en 100 | il alikvot av varje spädning på de monoskikt av unelectroporated BHK-21-celler (5 x 10 5) i en 6-brunnsplatta.
  7. Efter 4-6 h av inkubation, överlagra cellerna med 0,5% agaros i minimalt essentiellt medium innehållande 10% fetalt bovint serum. Inkubera plattorna under 4 dagar vid 37 ° C med 5% CO2.
  8. Visualisera den smittsamma centrums (plack) efter fixering med 7% formaldehyd och färgning med en% kristallviolett i 5% etanol 27 (figur 6A).
    1. Tillval: Undersök RNA-elektro celler vid 18-20 timmar efter transfektion för JEV-proteinuttryck genom immunofluorescens analyser 27,73 (figur 6B), och skörda supernatanterna från RNA-elektro celler vid 22 och 40 timmar efter transfektion för virus titrering av plackanalyser 27,63 (figur 6C).

Representative Results

För alla positiva-trängade RNA-virus, tillförlitligheten och effektiviteten i en omvänd genetik systemet beror på genetiska stabilitet en klonad fullängds-cDNA, vars sekvens motsvarar konsensussekvensen av viralt genomiskt RNA. 27 Figur 1 visar en fem- steg strategi för konstruktion av en fullängds-infektiös cDNA som en BAC JEV SA 14 -14-2 28: Steg 1, rening av viralt RNA från cellkultursupernatanten av JEV-infekterade BHK-21-celler (figur 1 A); Steg 2, syntes av fyra överlappande cDNA amplikoner (F1 till F4) spänner över hela virusgenomet (Figur 1B); Steg 3, subkloning av var och en av de fyra angränsande cDNA-fragmenten in i en BAC vektor, skapar pBAC / F1 pBAC / F4 (Figur 1C); Steg 4, modifiering av klonade cDNA för in vitro avrinning transkription med SP6 RNA-polymeras, det vill säga placera en SP6promotorsekvens omedelbart uppströms om det virala 5'-änden (pBAC / F1 SP6), vilket eliminerar en befintlig inre Xbal-stället vid nukleotid 9131 genom införande av en tyst punktmutation, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), och insättning av en ny konstgjord Xbal avrinning site omedelbart nedströms den virala 3'-änden (pBAC / F4 RO) (Figur 1D); 28 och Steg 5, montering av en fullängds SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Figur 1E). Tabell 1 visar de oligonukleotider som används i denna kloningsförfarandet.

För konstruktion av ett funktionellt JEV-cDNA, är det första viktiga steget vid syntesen av de fyra överlappande cDNA-fragment med användning av det renade virala RNA som mall för RT-PCR. Figur 2 tillhandahåller ett representativt resultat för de fyra RT-PCR-produkter som var elektrofores på en 0,8%agarosgel. Denna gel visar tydligt att en fullängds JEV cDNA förstärks i fyra överlappande cDNA-fragment. Ibland kan det hända RT-PCR-reaktioner i utbyte ge en eller flera ytterligare virusspecifika eller icke-specifika produkter som är till största delen är mindre än den förväntade produkten, på grund av den ospecifika parning av primrar under cDNA-syntes / amplifiering. Å andra sidan, lite eller inget förväntat RT-PCR-produkt skulle amplifieras på grund av oavsiktlig RNas kontamination under det virala RNA-isolering eller felaktig RT-PCR-prestanda.

Nästa viktiga steg är kloningen och modifieringen av en omfatta partiellt eller fullängds JEV-cDNA i BAC, vilket är en relativt enkel procedur som använder vanliga rekombinant-DNA-tekniker. 69 Figur 3 visar ett representativt resultat för rening av BAC-klon innehållande en fullängds-cDNA av JEV SA 14 -14-2 genom bandning i CsCl-EtBr gradient.I detta experiment, efter centrifugering under 16 h vid 401.700 x g, två distinkta band, dvs E. coli-kromosomalt DNA ovan och den supertvinnade BAC-plasmid-DNA nedan, är synliga i mitten av röret under långvågigt ultraviolett ljus. En minimal volym (~ 400 | al) av den nedre BAC-DNA-bandet var noggrant uppsamlades genom att peta ett hål med en spruta på den sida av röret. Därefter var EtBr extraherades från BAC-DNA genom butanolextraktion, och EtBr fria BAC-DNA koncentrerades genom etanolutfällning.

Det sista steget är fastställandet av den specifika infektiviteten hos de syntetiska RNA: n transkriberade in vitro från fullängds-SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) efter RNA-transfektion i permissiva celler (fig 4). Detta steg innefattar tre på varandra följande steg: Steg 1, linearisering av fullängds-SA 14 -14-2 cDNA vid 3 '-end av det virala genomet (Figur 4A); Steg 2, framställning av syntetiska RNA från den linjäriserade cDNA genom avrinning transkription (Figur 4B); och Steg 3, räddning av de rekombinanta virusen i BHK-21-celler transfekterade med de syntetiska RNA (Figur 4C). Experimentellt har två oberoende kloner av pBAC / SA 14 -14-2 arise med Xbal matsmältningen och behandlades med MBN att ta bort de fyra-basen 5 'överhäng genereras av Xbal matsmältningen. De linjäriserade BAC städades upp genom fenol-kloroformextraktion, följt av etanolutfällning. Den linearisering av de två renade BAC visades på en 0,8% agarosgel (figur 5A). Fenol-kloroform-extraktion måste göras noggrant för att säkerställa att de linjäriserade BAK är RNas-fri. Var och en av de två linjäriserade BAC tjänade som en cDNA-templat för avrinning transkription med användning av SP6-RNA-polymeras i närvaro av m 7 G (5 ') ppp (5') Ett lock-analog. Integriteten av de syntetiska RNA visades genom att köra portioner av de två transkriptionsreaktionsblandningarna på en 0,6% agarosgel, tillsammans med en referens 1 kb DNA-stege (figur 5B). I detta enkla test, den stora framträdande RNA-band alltid migrerade bara under 3 kb referens DNA-bandet och verkade vara skarp. Men degraderat RNA skulle ha en utsmetad utseende på samma gel.

En smittsam center analysen är guldmyntfoten för att fastställa rymdsmittsamheten de syntetiska RNA. Denna analys gjordes genom electroporating BHK-21-celler med RNA-prover, sådd lika alikvoter av 10-faldigt serieutspädda electroporated celler i 6-brunnars plattor innehållande naiva BHK-21-celler (3 x 10 5 celler / brunn), och överlagring agaros på cellmonoskikt. Efter inkubation under 4 dagar räknades överlevande celler fixerades med formaldehyd och färgades med en kristallviolett solution att kvantifiera antalet infektiösa centra (plack), vilket motsvarar det antal infektiösa RNA-molekyler som levereras in i celler (Figur 6A). Eftersom cDNA-templat som användes för in vitro-transkription har visat sig vara icke-infektiös, var 27 en alikvot av transkriptionsreaktionsblandningen direkt för elektroporering. Elektroporering är den bästa metoden för RNA transfektion; alternativt kan RNA transfekteras med andra metoder med hjälp av DEAE-dextran och katjoniska liposomer. RNA-elektroporation är mycket effektivt, men "Ijusbågsbildning" av den elektriska pulsen uppträder sällan, om salterna är närvarande i elektroporeringsreaktionen eller om elektroporationskyvett återanvänds. Expressionen av virala proteiner i RNA-transfekterade celler undersöktes med immunofluorescens-analyser med användning av en anti-NS1 kaninantiserum (Figur 6B). Produktionen av virala partiklar som ackumulerats i supernatanterna från RNA-transfekterade celler var enalyzed genom plackanalyser (figur 6C). Resultaten av dessa experiment visar tydligt att cDNA-härledda syntetiska RNA är smittsamma i permissiva BHK-21-celler, generering av en hög titer av rekombinanta virus.

Oligonukleotid Sekvens en (5 'till 3') Läge b Polaritet
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 Känsla
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 MyraiSense
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Känsla
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Känsla
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10.952-10.977 Antisense
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Känsla
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10.956-10.977 Antisense
SP6F cataccccgcgtattcccac
TA 		Känsla
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisense
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 Känsla
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Känsla
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Känsla
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10.670-10.694 Känsla
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10.954-10.977 Antisense
en JEV-sekvenserna visas i versaler, och BAC-sekvenser indikeras med små bokstäver.
b Nukleotid ståndpunkten hänvisar till den fullständiga genomsekvensen av JEV SA 14 -14-2 (Genbank accessionsnummer JN604986).

Tabell 1: Oligonukleotider som används för cDNA-syntes, PCR-amplifiering, och BAC-mutagenes.

Figur 1
Figur 1.0; Strategi för konstruktion av en fullängds-cDNA av JEV-SA 14 -14-2 såsom en BAC (A) Isolering av viralt RNA från JEV-partiklar.. Visat är ett schematiskt diagram av det genomiska RNA av JEV-SA 14 -14-2. (B) Syntes av fyra överlappande cDNA-fragment (F1-F4) som täcker hela virala genomet. (C) Subkloning av fyra överlappande cDNA-fragment i en BAC vektor, skapa pBAC / F1 till pBAC / F4. (D) Modifiering av de klonade cDNA för avrinning transkription in vitro. pBAC / F1 SP6 är ett derivat av pBAC / F1 som innehåller SP6-promotorsekvensen uppströms om den virala 5'-änden. pBAC / F3 KO är ett derivat av pBAC / F3 som innehåller en tyst punktmutation (A 9134 → T, asterisk). pBAC / F4 RO är ett derivat av pBAC / F4 som innehåller ett artificiellt Xbal avrinning plats nedströms den virala 3'-änden. (E strong>) Montering av en fullängds SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Syntes av fyra överlappande cDNA-fragment (F1-F4) som spänner över den fulla längden genom-RNA av JEV-SA 14 -14-2. De fyra RT-PCR-produkter utvärderas genom elektrofores i en 0,8% agarosgel. M, 1 kb DNA-stege. De förväntade storleken på de fyra cDNA-fragmenten indikeras längst ner på gelen bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
Figur 3. Rening av BAC innehållande en fullängds-cDNA av JEV-SA 14 -14-2. BAC-plasmiden isoleras från E. coli DH10B genom SDS-alkalisk lysering och renades ytterligare genom bandning i en CsCl-EtBr-gradient. Presenteras är ett exempel på CsCl-EtBr gradient med hjälp av en 16 × 76 mm förseglings polypropylenrör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Översikt av återvinning av smittsamma virus från en fullängds JEV SA 14 -14-2 cDNA monterad i en BAC. (A) Linjärisering av cDNA mall. Fullängds-JEV-BAC skärs medXbal och behandlades med MBN. (B) Syntes av RNA-transkripten. Den linjäriserade cDNA transkriberas av SP6 RNA-polymeras i närvaro av m 7 G (5 ') ppp (5') Ett lock-analog. (C) Återvinning av syntetiska JEVs. De in vitro transkriberade RNA transfekteras in i BHK-21-celler genom elektroporering, vilket genererar en hög titer av syntetiskt virus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Syntes av RNA genom transkription in vitro med hjälp av en fullängds JEV BAC som en cDNA mall. (A) Framställning av den linjäriserade fullängds JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Två oberoende kloner av pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 och CI.2) är linjär genom digestion med Xbal och efterföljande behandling med MBN. De linjäriserade BAC undersöks genom elektrofores i en 0,8% agarosgel. (B) Framställning av syntetiska RNA genom avrinning transkription. Var och en av de två linjäriserade BAC används som en mall för SP6 RNA-polymeras avrinning transkription. Alikvoter av de två transkriptionsreaktionerna kördes på en 0,6% agarosgel. M, 1 kb DNA-stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Specifik smittsamheten de syntetiska RNA transkriberat från en fullängds JEV BAC och återvinning av syntetiska virus. BHK-21-celler är mock-elektro (Mock) eller elektro med RNA-transkriptioner som härrör frabout vardera av de två oberoende kloner av full längd JEV BAC (Cl.1 och CI.2). (A) -RNA infektivitet. Cellerna överskiktades med agaros och färgades med kristallviolett vid 4 dagar efter transfektion. RNA smitt bestäms av smittsamma centrum analyser för att uppskatta mängden smitt RNA elektro in i cellerna (till vänster). Dessutom är representativa bilder av infektionscentra visas (högra panelen). (B) Protein uttryck. Cellerna odlas i 4-brunnars kammarobjektglas. Viralt proteinuttryck i RNA-electroporated celler vid 20 h efter transfektion (HPT) analyseras genom immunofluorescens-analyser med användning av ett primärt anti NS1 kaninantiserum och en sekundär Cy3-konjugerad get-anti-kanin-IgG (röd). Kärnorna motfärgades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (blå). De immunofluorescens bilderna överlagras på sina motsvarande differentialinterferenskontrastrika bilder. (C) Virus utbyte. Cellerna odlas i en50 mm odlingsskålar. Produktionen av smittsamma virioner ackumulerats i odlingssupernatanterna av RNA-elektro celler vid 22 och 40 hpt examineras genom plackanalyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det nuvarande protokollet har framgångsrikt använts för att generera full längd infektiösa cDNA-kloner för två olika stammar (CNU / LP2 27 och SA 14 -14-2 28) JEV, ett flavivirus vars funktionella cDNA har visat sig vara potentiellt svårt att konstruera och propagera på grund av toxicitet värdcell och den genetiska instabilitet av den klonade cDNA-8,74-76 Detta protokoll innefattar tre huvudkomponenter:. första, maximera syntes / amplifiering av en trogen cDNA-kopia av det virala RNA med användning av high-fidelity omvänt transkriptas / DNA-polymeras; andra, kloning av den virala prM-E-kodande region innehållande toxiska sekvenser (opublicerade data) 74,77,78 i en mycket låg-kopietal vektor BAC från den initiala cDNA-subkloning av de slutliga fullängds-cDNA monteringssteg; och tredje, med användning av en kloningsvektor BAC som kan rymma en främmande DNA med en medelstorlek av 120 till 350 kb, från 19 till 21 som tydligen tolererar större DNA inserts än andra kloningsvektorer. Denna klonings strategi kommer att vara generellt tillämpbar på många andra positiva-trängade RNA-virus, särskilt de med ett stort RNA-genomet av ~ 10 till 32 kb. Generering av en infektiös cDNA-klon är ett viktigt steg i utvecklingen av en omvänd genetik system för RNA-virus, särskilt för positiva-trängade RNA-virus, eftersom dess genom fungerar som viral mRNA som översätts till proteiner genom värdcellens ribosomer. Sålunda kan viral replikation initieras genom införandet av ett cDNA-härledda genomlängds RNA-molekyl i en mottaglig värdcell. Tillgängligheten av en infektiös JEV-cDNA-klon, när den kombineras med rekombinant DNA-teknologi, har ökat vår förståelse för olika aspekter av den virala livscykeln på molekylär nivå, såsom genuttryck 73,79 och genomreplikation. 63,64 Även en fullängds-JEV cDNA-klon har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att utveckla antivirala vacciner 28 och gentillförsel vektorer. <sup> 80,81

Som med alla positiva-trängade RNA-virus, det finns flera kritiska steg i att konstruera en tillförlitlig funktionell cDNA för JEV från vilka mycket infektiösa RNA kan syntetiseras in vitro. Helst bör sekvensen av de syntetiska RNA som transkriberats från en klon av den fullängds-cDNA vara identisk med den av det virala genom-RNA, särskilt de 5'- och 3'-terminala sekvenser som krävs för initieringen av viral RNA-replikation . 60-62 I det nuvarande protokollet, den autentiska 5'- och 3'-ändar säkerställdes genom att placera SP6-promotorsekvensen uppströms om den första adeninnukleotid av det virala genomet och placering av en unik artificiell Xbal-restriktionsställe nedströms om den sista tymin nukleotiden av det virala genomet, respektive. Capped syntetiska RNA med den autentiska 5 'och 3' ändarna framställda genom avrinning transkription av ett Xba I-lineariserad och MBN-behandlad cDNA template användning av SP6 RNA-polymeras primades med m 7 G (5 ') ppp (5') Ett lock-analog. Detta protokoll kan modifieras på flera sätt. För in vitro transkription, kan en annan bakteriofag RNA-polymeras (t.ex. T3 eller T7) användas tillsammans med sin väldefinierade promotorsekvensen. 27 Som en run-off plats, kan en annan restriktionsställe användas om det inte är närvarande i det virala genomet och om syntetisk RNA från den linearise cDNA-ändar med den autentiska 3 '-änden. Betydelsen av 3'-änden nukleotidsekvens har visats av en ~ 10-faldig minskning i RNA-infektivitet då ett syntetiskt RNA innehåller tre eller fyra virus orelaterade nukleotider vid sin 3'-ände. 27 I en in vitro transkriptionsreaktion, både m 7 G (5 ') ppp (5') A och m 7 G (5 ') ppp (5') G cap-analog kan användas lika väl, även om de senare platserna en obesläktad extra G-nukleotid uppströms om det virala 5 'end, men attDessutom förändrar inte infektiviteten eller replikation av syntetiskt RNA. 27 Dessutom är det inte nödvändigt för RNA infektionstester avlägsnande av cDNA-templatet från RNA-transkripten från DNas I digerering, eftersom cDNA-templatet i sig är inte infektiös. 27

BAC tekniken har nu använts för att konstruera infektiösa cDNA-kloner för en handfull positiv trängade RNA-virus, nämligen två JEVs, CNU / LP2 27 och SA 14 -14-2 28 (genomstorlek, ~ 11 kb); två dengue-virus, BR / 90 26 och NGC 29 (~ 11 kb); bovint virusdiarrévirus, SD1 (~ 12 kb), 25 två klassisk svinpest-virus, C och Paderborn (~ 12 kb), 24 gränssjukevirus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 den porcine reproductive och respiratory syndrome virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb), 30 genomsläpp gastroenterit virus, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 felin infektiös peritonit virus,DF-2 (~ 29 kb), 32 den svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus, Urbani (~ 30 kb), 9 mers-cov, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 och den mänskliga coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Den huvudsakliga fördelen med att använda BAC för cDNA konstruktion är den höga genetiska stabiliteten hos de stora, 1- eller 2-kopierings BAC plasmider.; emellertid är den inneboende naturen av dess extremt låga kopietal också en stor nackdel, på grund av mycket låga utbyten av BAC-DNA och den därav följande minskningen av renheten av BAC-DNA med avseende på värdens kromosomala DNA. I det nuvarande protokollet, är utbytet av BAC-DNA maximerad genom att odla E. coli DH10B transformerad med smitt BAC pBAC / SA 14 -14-2 i ett näringsrikt medium, 2xYT. Trots denna insats, är den genomsnittliga avkastningen endast ~ 15 pg av BAC-DNA från 500 ml 2xYT buljong. Dessutom är renheten hos BAC-DNA bäst uppnås genom att använda CsCl-EtBr densitetsgradientcentrifugering för rening, Snarare än den vanligen använda kolumnbaserad plasmidisolering. Det är dock viktigt att komma ihåg att BAC-transformerade E. coli bör inte växa över, eftersom det kan äventyra den genetiska stabilitet av den klonade cDNA och högre tillväxt inte nödvändigtvis leda till större avkastning eller högre renhet BAC DNA.

Protokollet som beskrivs här är en optimerad, effektiv och strömlinjeformad metod för konstruktion och utbredningen av en genetiskt stabil fullängds infektiös cDNA-klon som BAC för JEV, en gång trodde praktiskt taget omöjligt förfarande. Denna samma kloningsstrategi kan även tillämpas på många andra positiv-sträng-RNA-virus. I allmänhet, infektiösa cDNA-kloner möjligt för oss att införa en mängd olika mutationer (t.ex. deletioner, insättningar och punktmutationer) i ett viralt RNA genom att studera deras biologiska funktioner i virusreplikation och patogenes. Denna cDNA-baserade omvänd genetik system gör det möjligt att utveckla och test-vaccin och terapeutiska kandidater som riktar en virulensfaktor (er) av en speciell positiv-sträng-RNA-virus av intresse. Dessutom kan denna smitt cDNA teknik också användas som en viral vektor, som kan uttrycka en främmande gen (er) av intresse för många tillämpningar inom den biomedicinska forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

Immunologi omvänd genetik infektiös cDNA bakteriell artificiell kromosom RNA-virus enkelsträngad positiv känsla infektion replikering patogenes flavivirus japanskt encefalitvirus
Bakteriell artificiella kromosomer: En funktionsgenomik verktyg för studier av styrd trängade RNA-virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter