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Immunology and Infection

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

Für RNA virologists, die in der rekombinanten DNA-Technologie in den späten 1970er Jahren wurde es möglich, die virale RNA-Genome in cDNA-Klonen, die dann als Plasmide in Bakterien, die für die genetische Manipulation von RNA-Viren vermehrt werden konnten konvertieren. 1 Die erste RNA-Virus zu sein, molekular kloniert wurde Bakteriophage Qß, ein Positiv-Strang-RNA-Virus, das Escherichia coli infiziert. Ein Plasmid, das eine vollständige cDNA Kopie des Qß-Genom-RNA führte zu Infektions Qß-Phagen, wenn sie in E. eingeführt coli. 2 Kurz danach wurde diese Technik auf Poliovirus angewendet wird, ein Positiv-Strang-RNA-Virus, von Menschen und Tieren. Ein Plasmid, das für ein Volllängen-cDNA des Poliovirus-Genom-RNA infektiös, wenn es in Säugerzellen transfiziert und in der Lage, infektiöse Virionen 3 In diesem "DNA-aufgelegt" Ansatzes sollte die klonierten cDNAs intrazellulär transkribiert, um virale RNA-Replikation zu initiieren.Es ist jedoch unklar, wie die Transkription initiiert wird, und wie die Transkripte werden auf die richtige Virussequenz verarbeitet. Dieses Anliegen wurde für die Entwicklung eines alternativen "RNA-ins Leben gerufen" orientierten Ansatz, wobei eine vollständige cDNA-Kopie der viralen RNA-Genom unter einem Promotor, der von einem E. erkannt geklont coli oder Phagen-RNA-Polymerase zur Herstellung von synthetischen RNAs in vitro mit definierten 5'- und 3'-Enden, die, wenn sie in Wirtszellen eingeführt das vollständige virale Replikationszyklus durchlaufen. 4,5 Der erste Erfolg mit diesem Ansatz wurde für Brommosaikvirus gemeldet , 6,7 eine positive Strang RNA-Virus von Pflanzen. Seitdem hat sich der RNA-ins Leben gerufen Ansatz für eine breite Palette von Positivstrang-RNA-Viren, einschließlich Caliciviren, Alphaviren, Flaviviren, Arteriviren und Coronaviren entwickelt. 1,4,5,8

Sowohl in der DNA- und RNA-aufgelegt reversen Genetik Systemen die Konstruktion eines volll cDNA-Klon ist der Schlüssel zum Erzeugen von infektiösen DNA oder RNA von Positivstrang-RNA-Viren, aber es wird eine beträchtliche technische Herausforderung dar, wenn die Größe des viralen Genoms zunimmt. 9-17 Insbesondere ein großer RNA Genom von ~ 10 -32 kb präsentiert drei Haupthindernisse für das Klonen von voller Länge funktionellen cDNA. 18 Die erste Schwierigkeit ist die Synthese eines treuen cDNA zu kopieren, da die Wiedergabetreue der RT-PCR ist umgekehrt proportional zur Länge der viralen RNA. Die zweite Hürde ist die Anwesenheit von potentiell toxischen Sequenzen, da lange RNA-Moleküle sind eher unerwartete Sequenzen, die zur Herstellung des cDNA-Fragments in die Plasmide instabil in E. enthalten coli. Der dritte und kritische Punkt ist die Verfügbarkeit eines geeigneten Vektors, da es schwierig ist, einen Klonierungsvektor, der eine virale cDNA-Insert von> 10 kb aufnehmen kann, zu finden. In den vergangenen drei Jahrzehnten haben diese Barrieren durch einige Fortschritte in der Enzymologie, Methodik, eine überwundend Vektorologie. 1,4,5,8 Davon ist die vielversprechendsten und innovativsten Entwicklungs das Klonen von großen positiven Strang RNA-Viren, wie infektiöse bakterielle künstliche Chromosomen (BACs). Der BAC-Vektor ein low-copy Klonierungsplasmid (1-2 Kopien / Zelle) auf der Grundlage der E. coli F-Plasmid, mit einem Durchschnitt DNA Insertgröße von ~ 120-350 kb 19-21 Ein DNA-Fragment wird in den BAC-Vektor in einer ähnlichen Weise wie die Klonierung in allgemeinen Klonierungsvektoren eingeführt. die resultierenden BAC-Klone sind über viele Generationen in E. stabil coli. 22,23 Bisher wurde die BAC-Technologie wurde verwendet, um infektiöse cDNA-Klone für> 10 Mitglieder von drei Positivstrang RNA Virusfamilien, also Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 und Coronaviridae erstellen. 9,16,17 , 31,32

Verwendung Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) als Beispiel, berichtet die vorliegende Arbeit die detaillierten Verfahren, die sein können,verwendet, um eine genetisch stabil voller Länge infektiös BAC für eine Vielzahl von Positiv-Strang-RNA-Viren zu konstruieren. JEV ist eine zoonotische Flavivirus 33, die in der Natur zwischen Vögeln, Schweinen und anderen Wirbeltierwirten durch Mückenvektoren übertragen wird. 34,35 Beim Menschen kann JEV-Infektion die schwere oft tödliche neurologische Erkrankung Japanische Enzephalitis verursachen (JE), 36, die in auftritt Asien und Teilen des Westpazifik, 37,38 mit einem geschätzten jährlichen Inzidenz von ~ 50,000-175,000 klinische Fälle. 39,40 Das Genom der JEV ist ein ~ 11-kb, einzelsträngig, positive Sense-RNA-Molekül und besteht aus einen einzelnen offenen Leserahmen (ORF), die durch zwei nicht-kodierenden Regionen (NCR) am 5 'und 3' flankiert endet. 41,42 Der ORF codiert ein Polyprotein, das von Host und virale Proteasen gespalten wird, um 10 einzelne Proteine ​​zu erzeugen, bezeichnet als C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5 in N- zu C-terminalen Richtung. 34,43,44 Auch eine EXtended Form von NS1 (NS1 ') von ribosomalem -1-Leserastersprung an den Codons 8-9 von NS2A ausgedrückt. 45,46 Von diesen 11 Proteine, sind die drei Strukturproteine ​​(C, prM und E) für die Bildung von Infektions Virionen, 47,48 und die verbleibenden acht strukturelle Proteine ​​(NS1 bis NS5 und NS1) sind von entscheidender Bedeutung für die virale RNA-Replikation, 49-51 Partikelzusammenlagerung, 52-56 und angeborenen Immunität Flucht. 57-59 Sowohl die 5 'und 3 'NCRs enthalten konservierte Primärsequenzen und Form RNA sekundäre / ​​tertiäre Strukturen, 60-62, die wichtig für die Modulation Virus-RNA-Replikation sind. 63,64

Dieses Protokoll beschreibt die Werkzeuge, Verfahren und Strategien zur Erzeugung eines Volllängen-infektiösen BAC von JEV SA 14 -14-2. 28 diese Funktions BAC-Klon enthält eine vollständige cDNA-Kopie des JEV genomische RNA, 65, die durch einen Promotor umfasst ist für die SP6-RNA-Polymerase stromaufwärtsdes viralen 5'-Ende und eine einzigartige Xba I-Restriktionsstelle stromabwärts von der viralen 3'-Ende für eine in vitro run-off-Transkription. Dieser BAC-Technologie anwendbar ist, um eine voll funktionsfähige Konstruktion cDNA molekularen Klon für eine Reihe von Positivstrang-RNA-Viren.

Protocol

ANMERKUNG: Abbildung 1 stellt eine Strategie für die Konstruktion eines in voller Länge infektiös JEV cDNA als BAC 28 Tabelle 1 gibt eine Liste der in diesem Protokoll verwendeten Oligonukleotide. 28.

1. Extrahieren viraler RNA aus JEV Partikel in Zellkulturüberständen

  1. Beginnen Sie mit der Zellkulturmedium, das JEV-SA 14 -14-2, eine Live-JE-Impfstoff-Virus, biologischen Sicherheitsstufe 2 Sicherheitsbehälter erfordert.
    Hinweis: Der Virustiter ungefähr 1-3 × 10 6 plaquebildenden Einheiten / ml.
  2. Nehmen Sie die Biosicherheitstraining für alle mikrobiologischen Standardverfahren, Sicherheitsausrüstung, und Laboreinrichtungen erforderlich, vor jeder Arbeit mit JEV SA 14 -14-2.
  3. Reinige viraler RNA aus einem Aliquot der virushaltigen Zellkulturmedium unter Verwendung einer einphasigen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat 66 (Figur 1A).
    1. Anzeiged 600 ul der monophasischen Reagens zu 200 ul des Kulturüberstands in einem 1,7 ml Mikroröhrchen. Homogenisieren der Mischung durch Quittungs das Rohr kräftig für 30 sec und Inkubation für 5 min bei RT.
    2. Fügen Sie 160 ul Chloroform zu der homogenisierten Probe. Gründlich mischen durch Händeschütteln das Rohr kräftig für 15 Sekunden und lassen es für 2-3 min bei RT.
    3. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 13400 × g für 15 min bei 4 ° C, was zu einer Trennung der beiden flüssigen Phasen, dh eine untere organische Phase und in eine obere wäßrige Phase führt. Wird die obere wäßrige Phase (weniger als 200 & mgr; l), enthaltend die RNA zu einem neuen Mikroröhrchen.
    4. Ausfällung der RNA durch Zugabe von 1 ul von 5 ug / ul Glykogen 400 ul 100% iges Isopropanol und einer Inkubation für 10 min bei RT.
    5. Zentrifuge das Gemisch bei 13.400 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol durch Puls Vortexen drei vor fünfZeiten und Zentrifugieren bei 13.400 × g für 5 min bei 4 ° C.
    6. Der Luft trocknen den RNA-Pellet für 10 min und lösen es in 40 ul dH 2 O. Bewahren Sie die extrahierte RNA bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. Synthesize einen Satz von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4), die die gesamte virale Genom-RNA durch reverse Transkription (RT) -PCR

  1. Führen eine 20 & mgr; l RT-Reaktion mit einem 10 ul-Aliquot der gereinigten viralen RNA als Matrize und einer modifizierten Form des murinen Moloney-Leukämie-Virus-Reverse-Transkriptase. 67
    1. Ein 13 ul-Gemisch, enthaltend 10 & mgr; l der gereinigten RNA, 1 & mgr; l 10 mM dNTP-Mix, 1 & mgr; 4 pmol / ul Primer und 1 & mgr; l dH 2 O eingestellt Verwenden Sie die Fragment-spezifischen Primer für jeden RT-Reaktion: 1RT für F1, 2RT für F2, 3RT für F3 und 4RT für F4.
    2. Inkubieren der Mischung bei 65 ° C für 5 min auf Eis für 1 min, und dann schnell Spin, um den conte sammelnnts an der Unterseite des Rohres.
    3. Hinzufügen von 4 ul 5 · RT-Puffer, 1 & mgr; l 0,1 M DTT, 1 & mgr; l 40 U / & mgr; l RNase-Inhibitor und 1 ul 200 U / ul reverse Transkriptase. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren drei bis fünf Mal.
    4. Ließ die Reaktion ablaufen bei 50 ° C für 1 h, dann Hitze-Inaktivierung die Probe bei 70 ° C für 15 min. Bewahren Sie die synthetisiert Erststrang-cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung.
  2. Führen eine 100 & mgr; l PCR-Reaktion mit einem 5 ul Aliquot der hitzeinaktiviertem RT-Reaktion als Template und einem High-Fidelity-DNA-Polymerase, thermostabilen 68 (1B).
    1. Einrichten einer 100 ul PCR-Reaktion auf Eis mit 5 ul des RT-Reaktion wurden 20 ul 5 · PCR-Puffer, 4 ul 10 mM dNTP-Mischung, 5 ul 10 uM Vorwärtsprimer 5 ul 10 uM reverse-Primer, 1 & mgr; l 2 U / & mgr; l DNA-Polymerase und 60 & mgr; l dH 2 O. Verwenden Sie die fragmentspezifischen Primerpaar für jede PCR reaction: 1F + 1R für F1 (2573 bp), 2F + 2R für F2 (4171 bp), 3F + 3R für F3 (3922 bp), und 4F + 4R für F4 (1798 bp).
    2. Vorsichtig mischen durch Finger-Spiegeln das Rohr drei bis fünf Mal und kurz zentrifugieren, um den Inhalt am Boden zu sammeln.
    3. Beginnen Thermocycling mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 30 Sekunden bei 98 ° C, gefolgt von 25-30 Zyklen mit dem folgenden PCR-Profil: 10 s bei 98 ° C, 30 sec bei 60 ° C und 1-2 min (30 s / kb) bei 72 ° C. Speicherung der PCR-Produkte bei 4 ° C bis zur Analyse.
  3. Ausführen eines 2-5 & mgr; l Aliquot von jeder PCR-Reaktion auf einem 0,8% Agarosegel, das 0,5 ug / ml Ethidiumbromid (EtBr) (Abbildung 2).
    ACHTUNG: EtBr ist ein starkes Mutagen und erfordert Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen und äußerst vorsichtig, um während seiner Verwendung, Lagerung und Entsorgung beachten.

3. Subklon jeder der vier cDNA-Fragmente (F1 bis F4) in einen BAC Vector zum pBAC / F1 bis pBAC / F4 b erstelleny Molecular Cloning Techniques

  1. Verdauen die Vektor und Insert-DNA mit zwei geeigneten Restriktionsendonukleasen, wie folgt:
    1. Durchführen einer sequentiellen Verdau pBAC / PRRSV / FL (Vektor), 30 eine Ableitung des pBeloBAC11 Plasmid (7507 bp, GenBank Zugangsnummer U51113) mit Pme I und Not I in einem Gesamtvolumen von 60 ul (enthaltend ~ 500 ng DNA 10 U Enzym 1x Verdauungspuffer und 1 · BSA) bei 37 ° C für 12-15 h, der den 15426-bp-Vektorfragment ergibt.
    2. Durchführen einer sequentiellen Verdau von jeder der vier cDNA-Amplikons (Einsatz) mit Sma I und Not I in einem Gesamtvolumen von 60 ul (enthaltend ~ 1 & mgr; g DNA, 20 U Enzym, 1 × Verdauungspuffer und 1 · BSA) bei 25 ° C (Sma I) oder 37 ° C (Not I) für 12-15 h, das die folgenden Insertfragmente der gewünschten Grße ergibt: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), und F4 (1784 bp).
  2. Reinigen diegewünschten Vektor und Insert-DNA-Fragmente durch Gel-Extraktion.
    1. Trennen Sie die doppelt verdauten Produkte auf einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, das 0,5 ug / ml EtBr. Ausschneiden eines Bandes des gewünschten DNA-Fragments mit einer minimalen Menge von Agarose (üblicherweise ~ 200 ul) unter langwelligem UV-Licht.
    2. Ein gleiches Volumen von TEM-Puffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA und 10 mM MgCl 2) einer Agarose in einem 1,7 ml Mikroröhrchen der ausgeschnitten. Inkubieren der Probe bei 72 ° C für 10-15 min, mit Vortexen alle 2-3 min, bis die Agarose vollständig geschmolzen.
    3. Hinzufügen eines gleichen Volumens vorgewärmten Puffer-gesättigtem Phenol, kräftig vortexen für 1 min, und die Zentrifuge bei 13.400 xg für 10 min bei RT.
      Hinweis: Das Gemisch trennt sich in eine untere organische Phase und eine obere wässrige Phase. Wird die obere wässrige Phase, die die DNA in ein neues Mikroröhrchen.
    4. Ein gleiches Volumen an Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1), 1 min vortexen und zentrifugieren bei 13,400 xg für 10 min bei RT. Wird die obere wässrige Phase in ein neues Mikroröhrchen.
    5. Mit 0,5 ul 10 ug / ul Hefe-tRNA, 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina 100% Ethanol. Halten Sie die Mischung auf Eis für 20 min.
    6. Zentrifugieren der Mischung bei 13.400 × g für 10 min bei RT. Entfernen des Überstandes und Waschen des DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol durch Puls Vortexen drei bis fünf mal und Zentrifugieren bei 13.400 × g für 10 min.
    7. Luft trocknen den DNA-Pellet 10 Minuten zu und löse es in 20 ul TE-Puffer (10 mM Tris-Cl und 1 mM EDTA [pH 7,6]).
  3. Ligieren den gewünschten Vektor und Insert-DNA-Fragmente unter Verwendung von T4 DNA-Ligase.
    1. Ein 20 ul Ligationsreaktionslösung, enthaltend 50-100 ng der Vektor-DNA, ein ~ 3-fachen molaren Überschuss der Insert-DNA, 400 U T4-DNA-Ligase und 1 × Ligationspuffer eingestellt. Inkubieren der Ligationsreaktion bei 16 ° C für 12-15 Std.
      Hinweis: Fügen Sie eine negative control Reaktion, dh, vector nur ohne Einsatz, parallel.
    2. Führen Sie vier separate Ligationen, die jeweils den Beitritt zur 15426-bp Pme-NotI-Fragment von pBAC / PRRSV / FL mit dem 2559-bp (F1), 4157-bp (für F2), 3908-bp (für F3), oder 1784-bp (F4) SmaI-NotI-Fragment von einem der vier cDNA-Amplikons, um Subklone pBAC / F1 um pBAC / F4 zu erzeugen.
  4. Transformieren der ligierten DNA in E. coli DH10B durch das CaCl 2 -Hitze Schockverfahren.
    1. Nehmen Sie 100 & mgr; l Aliquots der CaCl 2 -behandelten kompetente DH10B-Zellen 69 bei -80 ° C gelagert und tauen sie auf Eis.
      Hinweis: Verwenden Sie 100 ul der Zellen pro Transformation.
    2. Fügen Sie eine 10 ul-Aliquot der DNA-Ligationsreaktion zu 100 ul der aufgetauten Zellen in einem 1,7 ml Mikroröhrchen, vorsichtig mischen, indem Sie den Schlauch und halten auf dem Eis für 30 min.
    3. Hitzeschock die DNA-Zellmischung für 45 Sekunden in einem 42 ° C water Bad, auf Eis für 2 min, und fügen Sie 900 ul LB-Brühe auf RT vorgewärmt.
    4. Die Hitzeschock-Zellen bei 35 ° C für 1 Stunde, mit 225-250 rpm schütteln.
    5. Verteilt 50 bis 200 ul Aliquots der kultivierten Zellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 10 ug / ml Chloramphenicol (CML). Halten Sie die Platten bei RT rechten Seite nach oben, bis sie trocken sind.
    6. Drehen Sie die Platten auf den Kopf und Inkubation bei 35 ° C für 15 Stunden.
  5. Rückgewinnung des klonierten BAC-DNA aus den Wirtszellen durch eine spaltenbasierten Reinigungsverfahren (Abbildung 1C).
    1. Pick sechs bis acht Bakterienkolonien aus den LB-Agarplatten und Cml inokulieren sie in 3 ml 2 × YT-Brühe, die 10 ug / ml Cml. Die Kulturen bei 35 ° C inkubieren 10 h unter starkem Schütteln (225-250 UpM).
    2. Isolieren rekombinanten BAC DNAs 1 bis 1,5 ml der Bakterienkulturen mit Spin-Säulen, wie durch den Hersteller vorgeschrieben. 70 Eluiere das extrahierte DNA (typitisch 100-200 ng) in 20 ul TE-Puffer.
    3. Führen zwei analytischen Restriktionsenzymverdaus der isolierten BACs für ~ 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 10 ul, einer, um die Anwesenheit des Vektors mit einem korrekten Insert identifiziert unter Verwendung der gleichen Enzyme für die Klonierung verwendet wird (siehe Protokoll 3.1) und das andere die Integrität des klonierten BACs mit einem geeigneten Enzym (z, Bgl II, Nco I oder Pst I) zu prüfen, Erzeugen eines einmaligen Restriktionsfragmentmuster.
    4. Propagieren die korrekt kloniert BACs durch Inokulieren 500 ul der positiven Bakterienkulturen (von Protocol 3.5.1) in 500 ml 2 × YT-Medium Cml und Kultivierung des Inokulums für 6 Stunden bei 35 ° C unter Schütteln bei 225-250 Umdrehungen pro Minute. Reinige den BAC-DNA (typischerweise 10-20 ug) aus dem 500-ml-Kultur unter Verwendung von Filterkerzen, wie vom Hersteller empfohlen. 71
      Hinweis: Die ersten vier BAC Subklone, die jeweils eine cDNA-Fragment des JEV-Genom-RNA, könnte sich auf habene oder mehrere unerwünschte Mutation (en) im Vergleich zu der Konsensus-Sequenz des viralen Genoms 42 (die als eine Referenzsequenz dient). Eine solche Mutation muss durch PCR-basierende stellengerichtete Mutagenese vor der Montage eines Volllängen-JEV cDNA korrigieren. 27

4. Erstellen Sie ein in voller Länge JEV cDNA mit dem 5 'SP6-Promotor und 3'-Run-off-Site

  1. Machen Sie drei genetische Veränderungen (siehe unten Protokolle 4.1.1-4.1.3) in den geklonten cDNAs in vitro Run-off-Transkription von Genomlänge RNAs mit der authentischen 5 'und 3' zu ermöglichen Enden des viralen Genoms.
    1. Einzuführen einen SP6-Promotor unmittelbar stromaufwärts von dem 5'-Ende des viralen Genoms durch Überlappungsextensions-PCR (1D, pBAC / F1 SP6).
      1. Verstärken zwei überlappenden DNA-Fragmente über die erste Standard-PCR von pBAC / F1 mit den beiden Primerpaare SP6F + SP6R (Produktgröße, 173 bp) und F1F + F1R (Produkt sIZE 676 bp), die jeweils in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend 1 & mgr; l Matrizen-DNA (~ 200 pg / ul), 10 ul 5 x PCR-Puffer, 2 ul 10 mM dNTPs, je 10 & mgr; M Vorwärts und Rückwärts 2,5 ul Primer, 0,5 ul 2 U / & mgr; l DNA-Polymerase, 68 und 31,5 & mgr; l dH 2 O Führen Sie die PCR unter Verwendung des folgenden Zyklusprofils: 98 ° C für 30 sec, und 25 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 20 sec.
      2. Gel-Reinigung der zwei PCR-amplifizierten DNA-Fragmente nach dem Ausführen von jeder der beiden PCR-Produkte auf einem 1,5% niedrigschmelzende Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      3. Verschmelzen die beiden Gel-gereinigtes DNA-Fragmente über die zweite Fusions-PCR mit der äußersten Primer SP6F + F1R (Produktgröße, 821 bp) in einem 100 & mgr; l-Reaktion, darunter 1 & mgr; l jeder der beiden gereinigten DNA-Fragmente (~ 100 pg / ul) 20 & mgr; l 5 × PCR-Puffer, 4 ul 10 mM dNTPs, jeweils von 10 & mgr; M Vorwärts- und Rückwärts 5 ul Primer, 1 & mgr;2 U / ul DNA-Polymerase, 68 und 63 & mgr; l dH 2 O. Verwenden Sie die folgende thermische Zyklus-Profil: 98 ° C für 30 sec, und 25 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 30 sec.
      4. Gel-Reinigung des fusionierten PCR Amplikon aus einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      5. Führen Sie die in den Protokollen 3.1-3.5 beschriebenen fünf Schritten Klonen vor, um die 760-bp Pac I- Bsi WI-Fragment des gelgereinigt verschmolzen PCR Amplikon mit dem 9532-bp Pac I- Bsi WI-Fragment von pBAC / F1 ligieren zu erzeugen pBAC / F1 SP6.
    2. Entfernen Sie die bereits bestehenden, internen XbaI-Stelle bei Nukleotid 9131 durch die Einführung einer stillen Punktmutation (A 9134 → T) über Overlap-Extension-PCR (1D, pBAC / F3 KO).
      1. Amplifizieren zwei überlappenden DNA-Fragmente, die durch die erste Standard-PCR von pBAC / F3 mit den beiden Primerpaare x1F + X1R(Produkt-Größe, 746 bp) und X2F + X2R (Produktgröße, 316 bp) in einer 50 ul Reaktion unter den in Protokoll 4.1.1.1 beschriebenen Versuchsbedingungen.
      2. Gel-Reinigung der zwei PCR-amplifizierten DNA-Fragmente nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1,5% niedrigschmelzende Agarose-Gele, wie in 3.2 beschriebenen Protokoll.
      3. Verschmelzen die beiden Gel-gereinigtes DNA-Fragmente über die zweite Fusions-PCR unter Verwendung der Primer äußersten x1f + X2R (Produktgröße, 1033 bp) in einem 100 ul Reaktion unter den in Protokoll 4.1.1.3 beschriebenen Versuchsbedingungen.
      4. Gel-Reinigung des fusionierten PCR Amplikon aus einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      5. Führen Sie die in den Protokollen 3.1-3.5 beschriebenen fünf Schritten Klonen vor, um die 949-bp Avr II- Not I Fragment des gelgereinigt verschmolzen PCR Amplikon mit dem 16245-bp NotI Bsi WI und 2141 bp Bsi W I ligieren - AvrII Fragmente pBAC / F3 zu pBAC / F3 KO zu produzieren.
      </ li>
    3. Ingenieur eine neue künstliche Xba I run-off-Stelle direkt stromabwärts von dem 3'-Ende des viralen Genoms durch PCR-basierte zielgerichtete Mutagenese (1D, pBAC / F4 RO).
      1. Generieren Sie ein DNA-Fragment durch PCR von pBAC / F4 mit Primern ROF + ROR (Produktgröße, 324 bp) in einem 100 & mgr; l-Reaktion, die 1 & mgr; l Matrizen-DNA (~ 200 pg / ul), 20 & mgr; l 5 × PCR-Puffer, 4 ul 10 mM dNTPs, jeweils von 10 uM vorn 5 & mgr; l und Rückwärtsprimer, 1 & mgr; 2 U / & mgr; l DNA-Polymerase, 68 und 64 & mgr; l dH 2 O Führen Sie die PCR unter Verwendung des folgenden Zyklusprofils: 98 ° C für 30 sec, und 25 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 15 sec.
      2. Gel-Reinigung des PCR-amplifizierte DNA-Fragment aus einem 1% niedrig schmelzenden Agarose-Gel, wie in Protokoll 3.2 beschrieben.
      3. Führen Sie die in den Protokollen 3.1-3.5 beschriebenen fünf Schritten Klonen vor, um die 283-bp Sfi I- N ligierenot I-Fragment des Gel-gereinigtes PCR-Amplicon mit der 16933-bp Sfi-NotI-Fragment von pBAC / F4, um pBAC / F4 RO erstellen.
  2. Montieren Sie einen Satz der vier modifizierten, überlappende cDNAs in einer einzigen abendfüllenden SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) durch den Beitritt von drei natürlichen Restriktionsstellen (BSR GI, Bam HALLO, und Ava I ) in sequentieller Weise mit dem fünfstufigen Klonierungsverfahren in Protocols detailliert 3.1-3.5 (1E): F1 SP6 → F1 SP6 F2 (durch Ersetzen des BSR G-NotI-Fragment von pBAC / F1 SP6 mit der pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (durch den Austausch des Bam H-NotI-Fragment von pBAC / F1 SP6 F2 mit der pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (durch Austausch der Ava-NotI-Fragment von pBAC / F1 SP6 F2F3 KO mit dem der pBAC / F4 RO).

5. Bereiten Sie ein hochreines Maxi-Prep des in voller Länge SA 14 -14-2 BAC

  1. Wachsen Sie eine Einzelkolonie von E. coli DH10B Durchführung pBAC / SA 14 -14-2 in 3 ml 2 × YT-Brühe, die 10 ug / ml Cml 10 h bei 35 ° C unter Schütteln bei 225-250 rpm und dann skaliert durch Inokulieren 500 ul der 10 h Bakterienkultur in 500 ml 2 × YT-Medium Cml und Kultivierung des Inokulums für 6 Stunden bei 35 ° C unter kräftigem Schütteln.
  2. Zentrifuge die Bakterienkultur in zwei 250 ml Flaschen bei 3.107 × g für 15 min bei 4 ° C. Resuspendieren jedes Pellet in 30 ml GTE-Lösung (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl und 10 mM EDTA [pH 8,0]), und fügen 500 ul 60 mg / ml Lysozym. Inkubieren Sie die beiden Zellsuspensionen auf Eis für 10 min.
  3. 60 ml frisch zubereitete Lyse-Lösung (0,2 N NaOH und 1% SDS) an jeder Zellsuspension, gut mischen, bis klar ist, und halten Sie die Lysatebei RT 10 min.
  4. In 45 ml Neutralisationslösung (100 ml, bestehend aus 60 ml 5 M Kaliumacetat, 11,5 ml Eisessig und 28,5 ml dH 2 O) zu jeder Flasche, gut mischen durch Umdrehen der Flaschen und bebrüten die neutralisiert Lysaten auf Eis für 10 min.
  5. Zentrifugation der Lysate bei 18.566 neutralisiert × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand der beiden Flaschen in zwei neue 250 ml-Flaschen; fügen 0,6 Volumen von 100% Isopropanol zu jedem, und bewahren Sie sie auf Eis für 20 min.
  6. Spin-down der Niederschläge bei 18.566 × g für 20 min bei 4 ° C. Aufzulösen jedes Pellet in 5 ml TE-Puffer, kombiniert sie in ein 50 ml Röhrchen (10 ml gesamt) und fällt die RNA durch Zugabe eines gleichen Volumens von 5 M Lithiumchlorid. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min.
  7. Zentrifuge das RNA-Präzipitat bei 14.636 × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein neues 250-ml-Tube und fallen DNA durch Zugabe von 2 Volumina 100% Isopropanol.Inkubieren der Mischung auf Eis für 20 min.
  8. Zentrifugieren Sie das DNA-Präzipitat bei 18.566 × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand aspirieren, resuspendieren DNA-Pellet in 9,5 ml TE-Puffer (pH 7,6), und fügen Sie 10 g Cäsiumchlorid (CsCl) und 390 & mgr; l 10 mg / ml EtBr.
  9. Laden der DNA-CsCl-EtBr-Lösung in ein 16 × 76 mm siegelbare Polypropylenröhrchen unter Verwendung einer Spritze mit einer 18 G-Nadel ausgestattet. Spin der abgedichteten CsCl Gradienten in einer Ultrazentrifuge bei 401.700 × g für 16 h bei 20 ° C (Figur 3).
  10. Sammeln eine DNA-Bande von BAC-Plasmid aus dem CsCl-Gradienten unter Verwendung einer 18 G-Nadel, um eine Entlüftungsöffnung an der Oberseite des Gradienten und eine 20 G-Nadel ausgestatteten Spritze den BAC-DNA von der Seite des Gradienten abzurufen.
  11. In 2,5 Volumina dH 2 O-gesättigtem Butanol zu der EtBr-gefärbten BAC DNA-Probe und mischen durch Vortexen. Zentrifuge das Gemisch bei 13.400 × g für 1 min und übertragen die untere wäßrige Phase in ein neues 1,7 ml microtube. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal.
  12. Fällt das EtBr freien BAC-DNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina 100% Ethanol zu dem Butanol extrahiert BAC-DNA und Inkubieren für 10 min auf Eis. Zentrifuge der Niederschlag bei 13.400 × g für 10 Minuten, Waschen der DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen und erneut pelle es durch Zentrifugieren.
  13. Luft trocknen den DNA-Pellet 10 Minuten zu und löse es in 200 ul TE-Puffer (pH 7,6).
    ANMERKUNG: Abbildung 4 zeigt eine Übersicht der reversen Genetik System für JEV SA 14 -14-2.

6. Transkribieren synthetische RNAs in vitro aus einem linearisierten voller Länge JEV BAC-DNA

  1. Führen eine große Restriktionsenzymverdau pBAC / SA 14 -14-2 mit XbaI in einem Gesamtvolumen von 100 ul (enthaltend 3 ug DNA, 60 U Enzym, 1 × Verdauungspuffer und 1 · BSA) bei 37 & deg; C für 12-15 h. Untersuchen Sie ein 3-ul-Aliquot der digestion Reaktion auf einem 0,8% Agarosegel, enthaltend 0,5 & mgr; g / ml EtBr.
  2. Weiter Inkubieren der Aufschlussreaktion mit 25 U Mung Bean Nuclease (MBN) bei 30 ° C für 2 Stunden (4A).
  3. Bringe das Volumen des XbaI-verdauten, MBN behandelten Probe bis zu 300 & mgr; l mit dH 2 O. Ein gleiches Volumen an Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zu der verdünnten Probe, kräftig vortexen für 1 min, Schleudern bei 13.400 xg für 10 min, und dann wird die obere wässrige Phase in ein neues 1,7 ml Mikroröhrchen. Hinzufügen eines gleichen Volumen Chloroform und wiederholen Sie den Extraktionsverfahren.
  4. Wiederherstellen der Phenol / Chloroform-extrahiert, linearisiert BAC durch Ethanolpräzipitation: Hinzufügen von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina 100% Ethanol und Inkubation auf Eis für 20 min. Centrifuge der Niederschlag bei 13.400 × g für 10 Minuten, waschen Sie die DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und dann drehen Sie es nach unten durch erneute Zentrifugation.
  5. Der Luft trocknen den DNA pellet für 10 min zu und löse es in 30 ul dH & sub2; O Überprüfen ein 1-ul-Aliquot der gewonnenen BAC auf einem 0,8% igen Agarosegel mit 0,5 ug / ml EtBr (5A).
  6. Durchführen einer Ablauf Transkription des linea BAC-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 ul (enthaltend ~ 200 ng Matrizen-DNA, 0,8 mM Kappe analog [m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTPs 40 U RNase-Inhibitor, 20 U SP6 RNA-Polymerase, 72 und 1 × Transkriptionspuffer) bei 37 ° C für 1 Stunde (4B). Umfassen 0,5 & mgr; M [3 H] UTP für die RNA-Quantifizierung auf der Grundlage von [3 H] UTP Inkorporation, wie durch Adsorption an DE-81-Filterpapier beobachtet. 69
  7. Ausführen eines 1-2 & mgr; l Aliquot des Ablauftranskriptionsreaktion auf einem 0,6% Agarosegel, enthaltend 0,5 & mgr; g / ml EtBr (5B).

7. Bestimmen RNA Infektiosität und Virusausbeute

  1. Kultivieren Sie BHK-21-Zellen in 150 mm culture Schalen in einer Dichte von 3 × 10 6 Zellen / Schale für 24 h bei 37 ° C mit 5% CO 2.
    Hinweis: Beibehaltung der BHK-21-Zellen in Alpha Minimalmedium mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin, Vitaminen und Penicillin / Streptomycin ergänzt.
  2. Spülen der Zellenmonoschicht mit 10 ml kalten Lösung A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4 und 1,5 mM KH 2 PO 4). Trennen der Zellen von den Schalen durch Behandlung mit 4 ml Trypsin-EDTA (0,25%), und sammeln sie durch Zentrifugation bei 270 × g in einer Tischzentrifuge für 2 min.
  3. Zellpellet mit 50 ml kalten Lösung A in einem konischen 50 ml-Röhrchen und zentrifugieren der Zellsuspension bei 270 × g für 2 min. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal; nach dem letzten Waschen, Zellpellet in einer Dichte von 2 × 10 7 Zellen / ml in Sol A.
  4. Mischen Sie eine 400-ul-Aliquot der Zellsuspension mit 2 μg synthetischer RNA in einem 2-mm-Spalt Küvette und prompt elektroporieren der Mischung mit einem Elektroporator unter optimalen Elektroporationsbedingungen: 980 V, 99 & mgr; s Pulslänge und 5 Impulsen (4C).
    Hinweis: Mit der 3 H-markierte RNA in Protokoll 6.5 direkt zur Elektroporation hergestellt ohne weitere Reinigung.
  5. Lassen Sie die elektroporierten Zellen bei RT für 10 min und in ein 1,7 ml Mikroröhrchen, die 600 ul komplettem Kulturmedium.
  6. Vorbereitung einer 10-fachen Serienverdünnung der elektroporierten Zellen in 1 ml komplettem Kulturmedium und der Platte 100 & mgr; l-Aliquot jeder Verdünnung auf den Monoschichten von BHK unelectroporated-21-Zellen (5 × 10 5) in einer Platte mit 6 Vertiefungen.
  7. Nach 4-6 h Inkubation lagern die Zellen mit 0,5% Agarose in minimalem essentiellen Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Die Platten für 4 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  8. Visualisieren Sie die Infektionszentrums (Plaques), die durch Fixierung mit 7% Formaldehyd und Färbung mit 1% Kristallviolett in 5% Ethanol 27 (6A).
    1. Optional: Überprüfen Sie RNA-elektroporierten Zellen bei 18-20 h nach der Transfektion für die JEV-Proteinexpression durch Immunfluoreszenztests 27,73 (6B), und Ernte der Überstände aus den RNA-elektroporierten Zellen bei 22 und 40 Stunden nach der Transfektion für die Virus Titration von Plaque-Assays 27,63 (6C).

Representative Results

Für alle Positivstrang-RNA-Viren, die Zuverlässigkeit und die Effizienz einer reversen Genetik System abhängig von der genetischen Stabilität eines klonierten cDNA voller Länge, deren Sequenz ist äquivalent zu der Konsensussequenz der genomischen Virus-RNA. 27. Figur 1 zeigt einen fünf- Schritt-Strategie für die Konstruktion eines Volllängen-infektiösen cDNA als BAC für JEV SA 14 -14-2 28: Schritt 1 Reinigung von viraler RNA aus der Zellkulturüberstand von JEV-infizierten BHK-21-Zellen (1A); Schritt 2 Synthese von vier überlappenden cDNA-Amplikons (F1 bis F4) überspannt die gesamte virale Genom (1B); Schritt 3 Subklonieren jedes der vier benachbarten cDNA-Fragmenten in einen BAC-Vektor, wodurch pBAC / F1 um pBAC / F4 (1C); Schritt 4 Abwandlung der klonierten cDNAs für in vitro-Run-off-Transkription mit SP6-RNA-Polymerase, das heißt, wobei sich der SP6Promotorsequenz unmittelbar stromaufwärts des viralen 5'-Ende (pBAC / F1 SP6), wodurch eine bereits bestehende interne Xba I-Stelle am Nukleotid 9131 durch die Einführung einer stillen Punktmutation, A → T 9134 (pBAC / F3 KO) und das Einfügen eine neue künstliche Xba I run-off-Stelle unmittelbar stromabwärts der viralen 3'-Ende (pBAC / F4 RO) (1D); und Schritt 5, Montage von einer Volllängen-SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (1E). In Tabelle 1 sind die in diesem Klonierungsverfahren verwendeten Oligonukleotide. 28

Für die Konstruktion eines funktionalen JEV cDNA ist ein erster wichtiger Schritt bei der Synthese der vier überlappenden cDNA-Fragmente unter Verwendung der gereinigten viralen RNA als Matrize für die RT-PCR. 2 stellt ein repräsentatives Ergebnis für die vier RT-PCR-Produkte waren auf einem 0,8%Agarose-Gel. Dieses Gel zeigt deutlich, dass ein voller Länge JEV cDNA ist in vier überlappenden cDNA-Fragmente amplifiziert. Gelegentlich kann RT-PCR-Reaktionen ein oder mehrere weitere virusspezifische oder nicht-spezifische Produkte, die meist kleiner als die erwarteten Produkts zu ergeben, wegen der nicht-spezifischen Anlagerung der Primer bei der cDNA-Synthese / Amplifikation. Andererseits wenig oder keine erwartete RT-PCR-Produkt würde aufgrund zufälliger RNase Kontamination während der viralen RNA-Isolierung oder unsachgemäße RT-PCR-Technologie amplifiziert sein.

Der nächste Schlüsselschritt ist die Clonierung und Modifikation einer Teil- oder Volllängen-JEV cDNA in BAC, die eine relativ einfache Prozedur, die von rekombinanten Standard-DNA-Techniken verwendet, ist. 69 3 stellt ein repräsentatives Ergebnis für die Reinigung des BAC-Klon, eine cDNA voller Länge des JEV SA 14 -14-2 durch Streifenbildung in einem CsCl-Gradienten EtBr.In diesem Experiment wurde nach Zentrifugation für 16 Stunden bei 401.700 × g, zwei getrennte Banden, dh der E. coli chromosomale DNA oben und die supercoiled BAC-Plasmid-DNA unter, sind in der Mitte des Rohres unter langwelligem UV-Licht sichtbar. Ein minimales Volumen (~ 400 & mgr; l) des unteren BAC-DNA-Bande wurde vorsichtig durch das Stoßen ein Loch mit einer Spritze auf der Seite der Röhrchen gesammelt. Anschließend wurde das Ethidiumbromid aus dem BAC-DNA durch Butanolextraktion extrahiert und der EtBr freien BAC DNA wurde durch Ethanolfällung konzentriert.

Der letzte Schritt ist die Bestimmung der spezifischen Infektivität der synthetischen RNAs in vitro aus dem Volllängen-SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) nach der RNA-Transfektion in permissive Zellen (Figur 4) transkribiert. Dieser Schritt erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten: Schritt 1, Linearisierung des Volllängen-SA 14 -14-2-cDNA am 3'-Ende des viralen Genoms (4A); Schritt 2 Herstellung von synthetischen RNAs, die von dem linearisierten cDNA durch Run-off-Transkription (4B); und Schritt 3, Rettung der rekombinanten Viren in BHK-21-Zellen mit den synthetischen RNAs (4C) transfiziert. Experimentell wurden zwei unabhängige Klone von pBAC / SA 14 -14-2 mit XbaI Verdau linearisiert und mit MBN behandelt, um das Vier-Basen 5'-Überhang von der XbaI-Verdauung erzeugten entfernen. Die linearisierten BACs wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt, gefolgt von Ethanolfällung. Die Linearisierung der beiden gereinigten BACs wurde auf einem 0,8% igen Agarosegel (5A) demonstriert. Die Phenol-Chloroform-Extraktion muss sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß die linearisierte BACs RNase-frei. Jeder der beiden linearisierte BACs diente als Vorlage für die cDNA Ablauf Transkription unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase in Gegenwart der m 7 G (5 ') ppp (5') Eine Kappe analog. Die Integrität der synthetischen RNAs wurde durch Ausführen von Aliquots der zwei Transkriptionsreaktionsgemische auf einem 0,6% igen Agarosegel zusammen mit einer Referenz 1 kb DNA-Leiter (5B) dargestellt ist. In diesem einfachen Test, der Haupt prominenten RNA band stets nur migriert unterhalb der 3 kb Referenz DNA-Bande und erschien scharf sein. Allerdings verschlechtert RNA würde eine verschmierte Aussehen auf dem gleichen Gel müssen.

Eine Infektionszentrum Assay ist der Goldstandard für die Bestimmung der spezifischen Infektiosität der synthetischen RNAs. Dieser Assay wurde durch Elektroporation von BHK-21-Zellen, die mit RNA-Proben, die Beimpfung gleiche Aliquots der 10-fach seriell verdünnt elektroporierten Zellen in 6-Well-Platten, die naive BHK-21-Zellen (3 × 10 5 Zellen / Well), und Überlagern Agarose getan auf die Zellmonoschichten. Nach einer Inkubationszeit von 4 Tagen wurden die überlebenden Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit einer Kristallviolett gebeiztolution um die Anzahl der Infektionszentren (Plaques), die die Anzahl der in den Zellen (6A) geliefert infektiöse RNA-Moleküle entspricht quantifizieren. Da die cDNA-Matrize für die in vitro Transkription eingesetzt wurde, erwiesen sich als nicht-infektiös wurde 27 ein Aliquot der Transkriptionsreaktionsmischung direkt für die Elektroporation verwendet. Elektroporation ist die bevorzugte Methode zur RNA-Transfektion; alternativ kann RNAs durch andere Verfahren unter Verwendung von DEAE-Dextran und kationischen Liposomen transfiziert werden. RNA Elektroporation ist sehr effektiv, aber "Lichtbogenbildung" des elektrischen Impulses tritt selten, wenn Salze in der Reaktions Elektroporation oder die Elektroporationsküvette wiederverwendet vorliegen. Die Expression von viralen Proteinen in RNA-transfizierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Anti-NS1 Kaninchen-Antiserum (6B) untersucht. Die Produktion von Viruspartikeln in den Überständen von RNA-transfizierten Zellen akkumuliert wardurch Plaque-Assays (6C) sierten. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen deutlich, dass die cDNA-abgeleitete synthetische RNAs sind infektiös in permissiven BHK-21-Zellen, wodurch eine hohe Titer von rekombinanten Viren.

Oligonukleotid Sequenz A (5 'nach 3') Position b Polarität
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense-
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 Sinn
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense-
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 Ameiseich spüre
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Sinn
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense-
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense-
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Sinn
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense-
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10.952-10.977 Antisense-
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Sinn
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10.956-10.977 Antisense-
SP6F cataccccgcgtattcccac
ta 		Sinn
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisense-
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 Sinn
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense-
X1f CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Sinn
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense-
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Sinn
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense-
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10670-10694 Sinn
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10.954-10.977 Antisense-
ein JEV-Sequenzen werden in Großbuchstaben angezeigt, und BAC-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben.
b Nukleotid-Position bezieht sich auf die komplette Genomsequenz von JEV SA 14 -14-2 (Genbank-Zugangsnummer JN604986).

Tabelle 1: Oligonukleotide, die für die cDNA-Synthese, PCR-Amplifikation und BAC-Mutagenese verwendet.

Abbildung 1
Abbildung 1.0; Strategie für die Konstruktion einer cDNA voller Länge von JEV SA 14 -14-2 als BAC (A) Isolierung von viraler RNA aus JEV Teilchen.. Gezeigt ist eine schematische Darstellung der genomischen RNA des JEV SA 14 -14-2. (B) Synthese von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4), die den gesamten Virusgenom. (C) Subklonierung von vier überlappenden cDNA-Fragmente in einen BAC-Vektor, die Schaffung pBAC / F1 bis pBAC / F4. (D) Änderung der geklonten cDNAs für Run-off-Transkription in vitro. pBAC / F1 SP6 ist ein Derivat von pBAC / F1, der die SP6-Promotorsequenz stromaufwärts des viralen 5'-Ende enthält. pBAC / F3 KO ist ein Derivat der pBAC / F3, die eine stille Punktmutation (A 9134 → T, Sternchen) enthält. pBAC / F4 RO ist ein Derivat der pBAC / F4, die eine künstliche Xba I run-off-Stelle stromabwärts der viralen 3'-Ende enthält. (E strong>) Montage eines in voller Länge SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Synthese von vier überlappenden cDNA-Fragmente (F1 bis F4) überspannt den in voller Länge genomischen RNA des JEV SA 14 -14-2. Die vier RT-PCR-Produkte werden durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarosegel bewertet. M, 1 kb DNA-Leiter. Die erwarteten Größen der vier cDNA-Fragmente werden am unteren Rand des Gels Bild angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Die Reinigung des BAC, das eine cDNA voller Länge des JEV SA 14 -14-2. Die BAC-Plasmid von E. isoliert coli DH10B durch die SDS-Alkali-Lyse-Verfahren und durch Streifenbildung in einem CsCl-EtBr-Gradienten gereinigt. Präsentiert wird, ist ein Beispiel für die CsCl-Gradienten EtBr mit einem 16 × 76 mm verschließbaren Polypropylenröhrchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Überblick über die Rückgewinnung von infektiösen Viren aus einem in voller Länge JEV SA 14 -14-2 cDNA in einer BAC zusammengestellt. (A) Die Linearisierung der cDNA-Matrize. Die in voller Länge JEV BAC mit geschnittenXbaI und mit MBN behandelt. (B) Synthese der RNA-Transkripte. Das linearisierte cDNA durch SP6-RNA-Polymerase in Gegenwart der m 7 G (5 ') ppp (5') eine Kappe analogen transkribiert. (C) Die Gewinnung des synthetischen JEVs. Die in vitro transkribierte RNAs werden in BHK-21-Zellen durch Elektroporation, die einen hohen Titer von synthetischen Virus erzeugt transfiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Figur 5. Synthese der RNAs durch in vitro Transkription unter Verwendung einer Volllängen-JEV BAC als cDNA-Templat. (A) Herstellung des linearisierten Volllängen JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Zwei unabhängige Klone von pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 und Cl.2) durch Verdau mit XbaI und anschließende Behandlung mit MBN linearisiert. Die linearisierten BACs werden durch Elektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel untersucht. (B) Herstellung der synthetischen RNAs durch Run-off-Transkription. Jeder der beiden linearisierte BACs wird als Matrize für die SP6-RNA-Polymerase-Run-off-Transkription eingesetzt. Aliquots der beiden Transkriptionsreaktionen werden auf einem 0,6% Agarosegel laufen gelassen. M, 1 kb DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Figur 6. spezifische Infektiosität der synthetischen RNAs, die von einer Volllängen-JEV BAC und die Gewinnung synthetischer virus transkribiert. BHK-21-Zellen mock-elektroporiert (Mock), oder durch Elektroporation mit den RNA-Transkripten hergeleitet sind from jede der beiden unabhängigen Klonen von voller Länge JEV BAC (Cl.1 und Cl.2). (A) RNA-Infektiosität. Die Zellen werden mit Agarose überschichtet und mit Kristallviolett gefärbt bei 4 Tage nach der Transfektion. RNA-Infektiosität durch infectious center Tests bestimmt, um die Menge der infektiösen RNA in die Zellen (links) elektroporiert abzuschätzen. Auch sind repräsentative Bilder von Infektionszentren dargestellt (rechtes Bild). (B) Proteinexpression. Die Zellen sind in 4-Well-Kammerobjektträgern kultiviert. Virale Proteinexpression in RNA-elektroporierten Zellen bei 20 Stunden nach der Transfektion (hpt) durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines primären anti-NS1 Kaninchen-Antiserum und einer Sekundär Cy3-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (rot) analysiert. Die Kerne werden mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (blau) gegengefärbt. Die Immunfluoreszenz-Bilder werden auf ihre entsprechenden Differentialinterferenzkontrastbilder überlagert. (C) Virus-Ausbeute. Die Zellen werden in 1 kultiviert50 mm Kulturschalen. Die Produktion von infektiösen Virionen in den Kulturüberständen von RNA-elektroporierten Zellen bei 22 und 40 hpt sammelt wird durch Plaque-Assays untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Das aktuelle Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Volllängen-infektiöse cDNA-Klone für zwei verschiedene Stämme (CNU / LP2 27 und SA 14 -14-2 28) des JEV, einem Flavivirus, deren funktionelle cDNA hat sich als von Natur aus schwierig zu konstruieren und zu erzeugen, ausbreiten, weil Wirtszelltoxizität und die genetische Instabilität der klonierten cDNA 8,74-76 Dieses Protokoll besteht aus drei Hauptkomponenten:. erste und maximiert die Synthese / Amplifikation einer cDNA getreue Kopie der viralen RNA unter Verwendung von High-Fidelity-Reverse Transkriptase / DNA-Polymerase; Zweitens Klonieren des viralen prM-E kodierenden Region mit toxischen Sequenzen (unveröffentlichte Daten) 74,77,78 in sehr geringer Kopienzahlvektor BAC von der anfänglichen cDNA Subklonieren der endgültigen cDNA mit voller Länge Montageschritte; und drittens, die Verwendung eines Klonierungsvektors BAC, die eine Fremd-DNA mit einer durchschnittlichen Größe von 120-350 kb, 19-21, die offensichtlich toleriert größere DNA inse aufnehmen kannrts als andere Klonierungsvektoren. Diese Klonierungsansatz im allgemeinen auf viele andere Positiv-Strang-RNA-Viren, insbesondere solchen mit einem großen RNA-Genom von ca. 10 bis 32 kb. Erzeugung eines infektiösen cDNA-Klon ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung einer reversen Genetik System für RNA-Viren, insbesondere bei Positiv-Strang-RNA-Viren, da das Genom wirkt als virale mRNA, die von Wirtszellen Ribosomen in Proteine ​​übersetzt wird. Somit kann die virale Replikation durch die Einführung einer cDNA-abgeleitete Genomlänge RNA-Moleküls in einer empfänglichen Wirtszelle eingeleitet werden. Die Verfügbarkeit eines infektiösen JEV cDNA-Klon, wenn sie mit rekombinanter DNA-Technologie kombiniert wird, hat das Verständnis der verschiedenen Aspekte der Lebenszyklus des Virus auf molekularer Ebene wie Genexpression 73,79 und die Genomreplikation 63,64 erhöht. Außerdem ist ein Volllängen-JEV cDNA-Klon hat sich als ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung von antiviralen Impfstoffen 28 und Genübertragungsvektoren können. <sup> 80,81

Wie bei allen Positivstrang-RNA-Viren gibt es mehrere wichtige Schritte bei der Konstruktion eines zuverlässigen Funktions cDNA für JEV, aus dem hochinfektiösen RNAs können in vitro synthetisiert werden. Idealerweise sollte die Sequenz der synthetischen RNAs aus einem Klon der Volllängen-cDNA transkribiert identisch sein zu derjenigen der genomischen Virus-RNA, insbesondere die 5'- und 3'-terminalen Sequenzen, die für die Initiation der viralen RNA-Replikation erforderlich sind, . 60-62 In der aktuellen Protokolls der authentische 5'-und 3'-Enden wurden durch Anordnen der SP6-Promotorsequenz stromaufwärts des ersten Adeninnucleotid des viralen Genoms und Positionieren einer einzigartigen künstlichen Xba I-Restriktionsstelle stromabwärts des letzten sichergestellt Thymin Nukleotid des viralen Genoms sind. Capped synthetischen RNAs mit der authentischen 5 'und 3'-Enden wurden durch Run-off-Transkription einer Xba I-linearisiert und MBN behandelten cDNA te hergestelltmplate mit SP6 RNA-Polymerase mit der m 7 G (5 ') ppp grundiert (5') eine Kappe analog. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Für in vitro-Transkription, eine andere Bakteriophagen-RNA-Polymerase (zB T3 oder T7) kann in Verbindung mit seinen gut definierten Promotor-Sequenz 27 als Run-off-Website verwendet werden. Kann eine andere Restriktionsstelle verwendet werden, wenn es nicht vorhanden sein, das virale Genom und wenn synthetische RNA aus dem linearisierten cDNA-Enden mit dem authentischen 3'-Ende. Die Wichtigkeit des 3'- Ende Nukleotidsequenz wurde durch einen ca. 10-fachen Verringerung der Infektiosität RNA nachgewiesen, wenn eine synthetische RNA enthält drei oder vier virus unabhängigen Nukleotide an seinem 3'-Ende. 27 in einem in vitro-Transkriptions-Reaktion, sowohl die m 7 G (5 ') ppp (5') A und m 7 G (5 ') ppp (5') G cap Analog kann gleichermaßen verwendet werden, obwohl die letzteren Orte eine unabhängige zusätzliche G-Nukleotid stromaufwärts des viralen 5 '-Ende, aber dasZusatz nicht die Infektiosität oder Replikation von synthetischer RNA verändern. 27 ist darüber hinaus nicht für die RNA-Infektiosität Prüfungen erforderlich Entfernen der cDNA-Matrize aus dem RNA-Transkripte durch DNase I-Verdau, da der cDNA-Matrize selbst ist nicht infektiös. 27

Die BAC-Technologie wurde nun auf den Bau infektiösen cDNA-Klone für eine Handvoll Positiv-Strang-RNA-Viren, nämlich zwei JEVs, CNU / LP2 27 und SA 14 -14-2 28 (Genomgröße, ~ 11 kb) zugrunde gelegt wurden; zwei Dengue-Viren, BR / 90 26 und NGC 29 (~ 11 kb); das Virus der bovinen Virusdiarrhoe, SD1 (~ 12 kb); 25 zwei KSP-Viren, C und Paderborn (~ 12 kb); 24 die Grenze Euche-Virus, Gifhorn (~ 12 kb); 24 das PRRS-Virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 die Transmissible Gastroenteritis Virus PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 die Feline Infektiöse Peritonitis-Virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus, Urbani (~ 30 kb); 9 der MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 und der menschlichen Coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31. Der Hauptvorteil der Verwendung BACs für die cDNA-Konstruktion ist der hohe genetische Stabilität der großen, 1- oder 2-copy BAC-Plasmide. jedoch ist die intrinsische Natur ihrer extrem niedrigen Kopienzahl auch ein großer Nachteil, wegen der sehr geringen Ausbeuten von BAC-DNA und der daraus folgenden Verringerung der Reinheit der BAC-DNA in Bezug auf die chromosomale DNA beherbergen. Im aktuellen Protokoll wird die Ausbeute von BAC-DNA durch wachsende E. maximiert coli DH10B transformiert mit dem infektiösen BAC pBAC / SA 14 -14-2 in einem nährstoffreichen Medium, 2xYT. Trotz dieser Bemühungen ist das mittlere Ausbeute nur ~ 15 ug BAC-DNA aus 500 ml 2 × YT-Brühe. Auch ist die Reinheit des BAC-DNA am besten mit CsCl-EtBr-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung erreichtAnstelle des üblicherweise verwendeten spaltenbasierten Plasmidisolierung. Allerdings ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass die BAC-transformierten E. coli sollte nicht überwuchern, denn es könnte die genetische Stabilität des geklonten cDNA zu gefährden, und ein höheres Wachstum nicht zwangsläufig zu größeren Ausbeuten oder höhere Reinheit BAC DNA führen.

Das hier beschriebene Protokoll ist eine optimierte, effiziente und gestraffte Verfahren für den Bau und die Ausbreitung eines genetisch stabil voller Länge infektiösen cDNA-Klon als BAC für JEV, ein Verfahren einmal dachte, praktisch unmöglich. Diese gleichen Klonierungsstrategie kann auch auf viele andere Positiv-Strang-RNA-Viren angewendet werden. Im allgemeinen infektiöse cDNA-Klone ermöglichen es uns, eine Vielzahl von Mutationen (zB Deletionen, Insertionen und Punktmutationen) zu einer viralen RNA-Genom einzuführen, um ihre biologischen Funktionen in die virale Replikation und Pathogenese studieren. Diese cDNA-basierte reversen Genetik-System macht es möglich, zu entwickeln und zu test-Impfstoff und therapeutischen Kandidaten gezielt ein Virulenzfaktor (n) eines bestimmten Positiv-Strang-RNA-Virus von Interesse. Darüber hinaus kann diese infektiösen cDNA-Technologie auch als ein viraler Vektor, der fähig ist, ein fremdes Gen (en) von Interesse exprimieren, für viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

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References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

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Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren
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Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

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