Summary
Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de University of California, Davis, en gehandeld op grond van de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health.
1. Voorbereiding
- Bereid twee geconcentreerd (25X) voorraden van gemodificeerde oplossing Tyrode op voorhand en bewaar bij 4 ° C: (1) Stock I (in mm: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26,25) en (2) Stock II (in mm: NaHCO3 500).
- Vers bereiden 2 L Tyrodes oplossing van de volgende samenstelling (mM): NaCl 128,2, CaCl2 1,3, KCl 4,7, MgCl2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO3 20 en glucose 11,1 door het combineren van 1840 ml gedeïoniseerd (DI) water, 80 ml Stock I, 80 ml van Stock II, en 4 g glucose. Niet direct mengen Stock I en II Stock; voeg dem tot 1840 ml DI om neerslag te voorkomen.
- Bereid voorraadoplossing van de excitatie-contractie ontkoppelaar blebbistatin bij 10 mg / ml in watervrij di- methylsulfoxide (DMSO) vooraf en bewaar de stock oplossing bij 4 ° C.
- Bereid voorraadoplossingen van fluorescente kleurstoffen: (1) spanningsgevoelige kleurstof RH237 (1 mg / ml in DMSO) en (2) lage-affiniteit calcium indicator Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik de voorbereidingen onmiddellijk ontleding met daaropvolgend verlies van laadvermogen vermijden.
- Vul het recirculerende Langendorff perfusie systeem geoxygeneerde (95% O2, 5% CO 2) Tyrode's oplossing. Stel de stroom van O2 / CO2 om de pH van de Tyrode-oplossing bij 7,4 ± 0,05 houden. Gebruik een in-line geweven nylon net filter (poriegrootte: 11 pm) om continu te filteren het perfusaat.
- Prime de perfusie-systeem bij KT, zoals daaropvolgende loading Fluo-5N AM wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur. Voor Fluo-5N AM laden, gebruik dan een klein volume van recirculatie perfusaat (~ 150 ml). Na kleurstof laden, gebruik dan een groter volume van perfusaat (1-2 L, zie figuur 1C).
- Zet data-acquisitie systeem en voor te bereiden voor de continue bewaking van ECG en perfusie druk. Bereid druk-monitoring systeem: Sluit een druksensor om de perfusie lijn en toezicht op de perfusie druk met een transbridge versterker. Stel de basislijn perfusiedruk tot 0 mmHg wanneer het hart niet is bevestigd aan het perfusie systeem.
- Lijn de optische mapping camera's om de ruimtelijke afstemming tussen de V m en SR Ca 2 + signalen te verzekeren.
- Ten eerste, de focus van de camera door een liniaal of een object met tekst de perfusie schaal. Draai het in kaart brengen van camera's in een live view mode en de scherpstelling totdat de tekst is helder en duidelijk. Verwerven van een enkel beeld frame uit elke camera.
- Bedekkingdeze beelden en stel de transparantie van de bovenste afbeelding zodat beide beelden zichtbaar zijn. De tekst in de afbeeldingen moet exact overlappen. Indien niet perfect uitgelijnd, stel de hoek van de dichroïsche spiegel of de positie van elke camera tot de twee beelden worden uitgelijnd.
2. Oogsten, perfusie en Dye-laden van Rabbit Heart
- Bevestig het konijn in een goedgekeurd konijn restrainer. Diep verdoven via een intraveneuze injectie (marginale oor ader) natrium pentobarbital (50 mg / kg) en heparine (1000 IU).
- Als het konijn toont gebrek aan nociceptieve reflexen, maak een middellijn incisie in de huid van het borstbeen en ribben bloot. Dwars door het borstbeen met stompe-tip chirurgische schaar van de xyphoid naar de manubrium. Zorg het hart niet te beschadigen tijdens het openen van het borstbeen. Verspreid de ribben naar het hart bloot te leggen.
- Snel accijnzen het hele hart-long block door snel snijden van alle schepen en bindweefsel. Immediately plaats de hart-long blok in oplossing ijskoude Tyrode's.
- Zoek de aorta voor retrograde perfusie. Snijd de aorta ascendens net proximaal van de drie onderdelen van de aortaboog. De aorta canule met een 8 G canule verbonden met het perfusie systeem. Gebruik een stuk van USP 0 zijden hechtdraad om de aorta te beveiligen op de canule.
- Ontleden de luchtpijp, de longen, en epicardiale vet van het hart zorgvuldig. Met een scherpe pincet en dissectie schaar, zoek de mitralisklep en zorgvuldig beschadigen of een folder om de oplossing van de congestie in de linker hartkamer te voorkomen verwijderen.
- Dompel het hart in de met glas ommantelde perfusie kamer horizontaal met het voorste oppervlak van het hart omhoog voor beeldvorming. Bevestig de canule een stuk Sylgard met U-vormige pinnen op het silicium bodem van de schaal om beweging van het hart in kaart brengen (figuur 1D) te voorkomen. Indien gewenst, plaatst u een klein insect pin aan de top van het hart voor stabilization.
- Positie elektrocardiogram (ECG) elektroden in het bad aan de rechter- en linkerkant van het hart. Volledig onderdompelen elektroden in het bad en zorgen dat ze niet in contact met het oppervlak van een hart-volume uitgevoerd analoog aan een ECG Lead configuratie I verschaffen. Controleer of een normale Lead ik ECG morfologie. Stel de stroom (25 - 35 ml / min) waardoor de aorta druk wordt gehandhaafd op 60 - 70 mmHg.
- Schakel verlichting in de kamer en voeg 0,3-0,6 ml blebbistatin voorraad oplossing (stap 1.2) naar het perfusaat (uiteindelijke concentratie 10-20 uM).
- Schakel ruimte lichten om photoinactivation van blebbistatin voorkomen. Indien nodig kan een kleine spot of koplamp worden gebruikt om de taak verlichting.
Opmerking: Blebbistatin is een myosine ATPase-remmer en een excitatie-contractie ontkoppelrail. Omdat Fluo-5N laden vergt uitgebreide (60 min) RT (onderkoeling) (zie stappen 2,8-2,10), cardiale energieproductie kan worden aangetast. Therefore, toevoeging van blebbistatin in het perfusaat vóór het laden kleurstof kan de vraag naar energie 16 te verminderen en bewegingsartefacten elimineren tijdens de daaropvolgende optische opnames 17.
- Schakel ruimte lichten om photoinactivation van blebbistatin voorkomen. Indien nodig kan een kleine spot of koplamp worden gebruikt om de taak verlichting.
- Wanneer samentrekking van het hart heeft opgehouden (10 - 15 min, gecontroleerd op de aorta druk opname), over te schakelen naar het kleine volume recirculatie perfusie-systeem (zie stap 1.4.1).
- Bereiden en laad Fluo-5N AM laden oplossing: Voeg 0,25 ml van Fluo-5N AM stockoplossing (stap 1.3) tot 0,25 ml warm 20% Pluronic F127. Voeg 0,5 ml warm Tyrode's oplossing aan het mengsel, meng en voeg de kleine volume recirculatie perfusie systeem.
- Continu toezicht perfusie druk en ECG en pas de stroom indien nodig. Dye laden duurt ongeveer 1 uur bij RT. 45 min na het laden begonnen, zet het circulerend waterbad beginnen opwarmen het perfusie systeem perfusaat tot 37 ° C.
- Na 60 min van Fluo-5N AM laden, SWItch de perfusie aan het grotere volume recirculatie perfusie-systeem (zie stap 1.4).
- Verdun 50 pi spanning gevoelige kleurstof RH237 voorraadoplossing (stap 1,3) in 1 ml warm Tyrode's oplossing en voeg langzaam (gedurende ~ 5 min) in een injectiepoort proximaal aan de canule.
3. Optical Mapping
- Tijdens de laatste momenten van de kleurstof laden, plaatst u het hart en de focus van de optische mapping camera's om de juiste gezichtsveld te zorgen voor het experiment.
- Indien gewenst, plaats een bipolaire pacing elektrode op het epicardiale oppervlak van het hart voor pacing.
- Een plastic of glazen dekglas op het oppervlak van de perfusie kamer om bewegingsartefacten te verminderen op het vloeistofoppervlak die aanwezig kunnen zijn als gevolg van hercirculatie van het perfusaat.
Opmerking: Als alternatief voor een dekglas, een schone plastic 50 mm petrischaal deksel. - De focus van de lichtgeleiders gelijkmatig verlichten het oppervlak van het hart met excitation licht. Gebruik blauw licht emitterende diode (LED) lichtbronnen en het licht verder te filteren met een 475-495 nm banddoorlaatfilter (Figuur 1A).
- Verzamel uitgezonden fluorescentie met een macroscoop en twee complementaire metaal-oxide-halfgeleider (CMOS) optische mapping camera's. Splits het uitgezonden licht met een dichroïsche spiegel bij 545 nm.
- Lang doorlaatfilter langere golflengte deel met het signaal Vm bij 700 nm. Banddoorlaatfilter kortere golflengte eenheid met het SR Ca 2 + signaal vanuit 502 - 534 nm (figuur 1A). Stel de frequentie van optische data-acquisitie tot 0,5-1 kHz.
- Voor elke optische opname, eerste inleiding van de gewenste pacing protocol, zet de excitatie licht, en het verzamelen van 1-4 sec van de gegevens. Indien gewenst, synchroniseert het tempo protocollen en data-acquisitie.
Opmerking: Het is niet mogelijk om opnieuw laden van de Fluo-5N AM, dus de signaal-ruisverhouding (SNR) wordt decrease gedurende het experiment door lekkage kleurstof uit de SR. Beperk experimentele protocol om 1-2 uur tot hoge SNR waarden te waarborgen. - Na het experiment was het perfusie systeem in de volgorde DI water, 70% reagens alcohol en opnieuw met DI water.
- Filtreer elke dataset met een ruimtelijk Gaussiaanse filter (radius 3 pixels) met in de handel verkrijgbare software pakketten volgens het protocol van de fabrikant.
- Eventueel ruimtelijk uitlijnen Vm en SR Ca 2 + datasets. Als in stap 1.6, overlay beelden van elke camera en controleer of de anatomische structuren van het hart (bijv., Coronaire vaatstelsel, randen van de atria of ventrikels) of andere items in het gezichtsveld (dwz, canule, pacing elektrode) exact overlap. Zo niet, ruimtelijke uitlijning van de datasets noodzakelijk.
- Verschuiven de top transparante afbeelding in de x- en y-richting tot exacte overlap is bereikt, met vermelding van het aantal pixelshet beeld moet worden verschoven in elke richting. De gehele dataset overeenkomt met de bovenste afbeelding (ofwel V m of SR Ca 2+) moet dan worden verschoven door de bepaald aantal pixels in elke richting om nauwkeurige afstemming tussen de V m en SR Ca 2+ datasets te verzekeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een schematisch diagram van de optische configuratie voor dual Vm en SR Ca 2+ mapping. Met deze opstelling is er volledige spectrale scheiding van de Vm en SR Ca 2 + signalen (Figuur 1B). Een diagram van de tweevoudige-loop perfusie systeem voor Fluo-5N loading dye is geïllustreerd in figuur 1C. Figuur 1D toont de horizontale richting van het hart in de perfusie schaal. Representatieve Vm en SR Ca 2 + optische sporen in continue stimulatie van verschillende locaties op het epicardiale oppervlak van het hart zijn weergegeven in figuur 2A. De optische gezichtsveld met deze opstelling is 31 mm x 31 mm en de oriëntatie van het hart binnen het gezichtsveld wordt getoond in figuur 2B. Activeringskaarten worden ook getoond in figuur 2B en worden geconstrueerd door het selecteren van de activeringstijd van elke pixel en pverkaveling deze waarde op een isochronische kaart (let op de typische vertraging van ~ 8-10 msec tussen de V m en SR Ca 2+ activering maps). Belangrijk key actiepotentiaal (AP) eigenschappen, zoals AP stijgtijd (van 10% tot 90% van de amplitude [Trise]) en AP duur bij 80% repolarisatie (APD 80), niet statistisch verschillend tussen harten geladen met RH237 en Fluo-5N vergeleken met die geladen met RH237 en Rhod-2 (Trise: 14,9 ms ± 1,9 ms vs. 14,2 msec ± 1,2 msec en APD 80: 155,3 msec ± 5,8 msec vs. 156,9 msec ± 5,7 msec voor Fluo-5N en Rhod-2, respectievelijk p> 0,05 voor beide;. n = 8 / groep) aangeeft minimaal effect van Fluo-5N of kleurstof belasting van de AP Figuur 2C toont het vermogen om te observeren en te kwantificeren relatieve veranderingen in diastolische SR Ca 2+ load en systolische SR Ca 2+ vrijlating amplituden bij verschillende stimulatiecyclus lengtes. Slechts relatieve veranderingen in deze parameters kunnen worden quantified, als absolute ijking ([Ca 2+] SR) van het signaal in het intacte hart niet mogelijk.
Deze benadering is bijzonder nuttig voor het karakteriseren en kwantificeren van pathologische SR Ca 2+ behandeling, zoals getoond in figuur 3. Na het aanbrengen van de β-adrenerge receptor agonist isoproterenol (100 nM), duidelijke diastolische Ca2 + lekkage uit de SR waargenomen ( rode pijlen, Figuur 3A). Indien lekkage groot genoeg, Ca2 + gemedieerde triggered activiteit kan voorkomen (Figuur 3B).
Figuur 1. Systeeminstellingen voor Dual kaart brengen van V m en SR Ca 2+. (A) Schematische weergave van de optische opstelling, met inbegrip van noodzakelijke filters en dichroïsche spiegel voor een goede spectrale scheiding. (B) beeldvorming van het hart ofwel geladen met Fluo-5N alleen (i) of alleen RH237 (ii) geeft volledige spectrale scheiding van Vm en SR Ca 2 + fluorescentiesignalen. Ex: excitatie, Em. Emissie (C) Schematische weergave van de dual-loop perfusie-systeem voor een normale perfusie en Fluo-5N kleurstof laden (D) Afbeelding van een canule hart en ECG-elektroden in de perfusie gerecht.. Panelen A en B weergegeven met toestemming van Wang et al. 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. V m en SR Ca 2+ Optical Sporen tijdens Continu en niet-continue Pacing. (A) Vertegenwoordiger V m en SR Ca 2+ optical sporen tijdens continue stimulatie op een cyclus lengte van 300 msec. Signalen worden weergegeven uit de afzonderlijke locaties aangegeven in (B). Let op de vertraging ~ 8 - 10 msec tussen Vm en SR Ca 2+ activeringstijden zoals typisch voor normale excitatie-contractie koppeling. (B) Afbeelding van een hart in het in kaart brengen gezichtsveld (witte pijl geeft pacing elektroden) en activering kaarten van V m en SR Ca 2+. (C) SR Ca 2+ optische sporen aantonen veranderingen in diastolische SR Ca 2+ load en de amplitude van SR Ca 2+ vrijlating volgende abrupte veranderingen in stimulatiefrequentie. Alle sporen beginnen met stimulatie bij CL = 300 msec. Stimulatiefrequentie wordt vervolgens abrupt veranderd CL = 500 msec (i), CL = 400 msec (ii) of CL = 250 msec (iii). Bij langere CLS ingeleid (i - ii) een grotere SR Ca 2+ EERSTE optreedt (vanwege de langere interval diastolische en terugwinning van RyRs) en de diastolische SR Ca2+ lading licht daalt naar een nieuwe steady-state (horizontale stippellijn). Bij een kortere CL geïnitieerd echter een kleinere SR Ca 2+ afgifte amplitude optreedt (vanwege de kortere interval diastolische en onvolledige terugwinning van RyRs) en diastolische SR Ca 2 + belasting toeneemt tot een nieuwe stabiele toestand (horizontale stippellijn) . Afwisseling van SR Ca 2+ vrijlating amplitude komt ook voor bij CL = 250 msec. S: kleine versie amplitude, L: grote versie amplitude. (CL: cyclus lengte) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Diastolische SR Ca 2 + Lek en latere gestuurde activiteit. (A) ECG, Vm en SR Ca 2+ sporen tijdens basislijn (links) en nabehandeling met 100 nM isoproterenol (ISO, rechts). ISO, is significant diastolische SR Ca 2+ lek waargenomen (rode pijlen). SR Ca 2+ signaalamplitudes zijn genormaliseerd voor en na Iso. De sinusknoop werd geablateerd om voor stimulatie CL = 300 msec in beide gevallen. (B) Als SR Ca 2+ lek groot genoeg is, kan het focale activiteit (premature ventriculaire complexen, PVC's) veroorzaken. In dit voorbeeld worden PVC's onderbreken de normale sinusritme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sleutels tot succesvolle Fluo-5N dye geladen zijn de kleine aantallen recirculatie perfusie setup, die zorgt voor een hoge Fluo-5N concentratie zonder dat grote hoeveelheden kleurstof, de lengte van de beschikbare tijd (1 uur), en het uitvoeren van het laden bij kamertemperatuur. Als het laden wordt uitgevoerd bij fysiologische temperaturen, cellulaire enzymatische activiteit snel splitst het -AM tag wanneer de kleurstof passeert de celmembraan, het vangen van de kleurstof moleculen in het cytoplasma en niet waardoor ze het SR membraan passeren. Bij KT echter enzymatische activiteit wordt vertraagd en een voldoende hoeveelheid kleurstof kan zowel de celmembraan en SR membraan passeren voordat de -AM tag wordt gesplitst, het vangen van de kleurstof in de SR.
Zelfs met een optimale belading echter signaalamplitudes en fractionele fluorescentie veranderingen (AF / F) met deze aanpak zal lager zijn dan met de traditionele optische kaart brengen van V m en intracellulaire Ca 2+ met een hoge affiniteit kleurstoffen zijn. Bijvoorbeeld, bij de optische opstelling die hier gebruikt dat bestaat uit LED excitatielicht, macroscopische doelstellingen, grote filters en dichroïsche spiegel (5 cm x 5 cm) en CMOS camera, fractionele fluorescentieveranderingen (AF / F) in de orde van 1 - 2% van de Fluo-5N signaal en 2 - 3% van de RH237 signaal 15. De fractionele fluorescentie zal uiteraard afhangen van de specifieke optische configuratie lichtbron en camera's van een bepaalde opstelling, maar ook onder optimale omstandigheden de Fluo-5N signaal aanzienlijk lager dan wat gewoonlijk waargenomen voor opnames van intracellulaire Ca 2+ met hoge affiniteit kleurstoffen. Bijvoorbeeld op de zelfde opstelling, AF / F in de orde van 20 - 30% voor Rhod-2 bij groen (545 nm) excitatielicht wordt gebruikt 18. De groene excitatielicht ook dichter bij de excitatiepiek van RH237, zodat de AF / F van RH237 ook groter in dit geval ongeveer 4 - 5%. Zo deze laboratoria al uitvoeren tweevoudige optische kaart brengen van Vm 2+, moet ervoor worden gezorgd dat alle onderdelen van de optische opstelling te optimaliseren om maximale waarborgen AF / F voor de Fluo-5N signaal.
Met deze aanpak kunnen de onderzoekers precies SR Ca 2+ dynamiek en de impact ervan op V m op een manier die niet mogelijk zijn met de bestaande benaderingen te onderzoeken. Zo kan kwantitatieve metingen van SR Ca 2 + lekkage (zoals in figuur 3A) en een nauwkeurige tijdconstante van SR Ca 2 + recovery (tau -een maatstaf SR Ca 2 + -ATPase [SERCA] activiteit) uitgevoerd. Met behulp van bestaande benaderingen voor optische kaart brengen van intracellulaire Ca 2+ met een hoge affiniteit kleurstoffen, kunnen deze metingen worden 'besmet' met transmembraan Ca 2+ flux (bijv., Bijdragen van de L-type Ca2 + kanalen en de Na + -Ca 2 + wisselaar). Verder hoge affiniteit Ca2 + indicatoren intrinsiek langzamer kinetics dan lage-affiniteit indicatoren 5, dus Fluo-5N signalen worden verwacht om te rapporteren over precieze SR Ca 2+ bewegingen met high fidelity en in wezen geen vertraging tussen de werkelijke Ca 2+ veranderingen en bijbehorende veranderingen in fluorescentie.
De mogelijkheid om de gedetailleerde mechanismen waarmee SR Ca2 + afgifte en heropname dragen aritmogene fenomenen is een ander voordeel van deze aanpak. Bijvoorbeeld met behulp van deze methode, hebben we onlangs gemeld hoe vuurvastheid van SR Ca 2+ afgifte bijdraagt aan het ontstaan van Ca2 + alternantie en die tijdens ventriculaire fibrillatie, SR Ca 2+ afgifte blijft nagenoeg constant refractaire 15. Dit was het eerste verslag van SR Ca 2+ dynamiek tijdens fibrillatie en belicht de belangrijkste voordeel van SR Ca 2+ imaging in het intacte hart: ruimtelijk verschillende en complexe fenomenen zoals ruimtelijk discordant alternans en fibrillation kan worden bestudeerd. Helaas kan deze informatie niet worden afgeleid uit geïsoleerde cellen, waarbij fibrillatie niet mogelijk, of methoden die alleen opnemen vanaf één locatie op het intacte hart 12.
Bovendien kan gelijktijdige optische kaart brengen van V m en vrije SR Ca 2+ in het intacte hart van een nieuw instrument voor de beoordeling abnormale Ca 2+ behandeling in pathologische aandoeningen, waaronder hartfalen te bieden. De afwijkingen in de SR Ca 2+ regelgeving, met inbegrip van de activering en de beëindiging van SR Ca 2+ release, diastolische SR Ca 2+ lek, en SR Ca 2+ opname - alle belangrijke stappen in Ca 2+ fietsen en alle potentieel gewijzigd bij hartfalen - kan direct worden bestudeerd. Bovendien kan deze methode ook nuttig voor het beoordelen van de effecten van nieuwe therapeutische interventies, zoals RyR stabilisatie 19 en SERCA modulatie 20 zijn.
2+] SR concentraties. Helaas, variabiliteit in kleurstof laden, ongelijkmatige excitatie- en emissie licht door het gekromde oppervlak van het hart en foto-bleken en kleurstof lekken uit de SR gedurende het verloop van het experiment het uiterst moeilijk Fluo-5N signalen kalibreren exacte [Ca 2+] SR in het intacte hart. Eerdere in vitro studies in fysiologische bufferoplossingen en doorlaatbaar geïsoleerde myocyten zijn dergelijke ijkingen gerapporteerd en hebben aangetoond dat veranderingen in Fluo-5N fluorescentie evenredig aan veranderingen in [Ca 2+] SR en de fluorescentie wordt niet verwacht verzadigen bij fysiologische [Ca 2 +] SR niveau 11. Daarom moet de onderzoekers de werkwijze van Ca2 + ma kiezenpping (lage of hoge affiniteit kleurstof) op basis van hun specifieke experimentele doelstellingen en fysiologische onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).
- Kong, W., Fast, V. G. The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).
- Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).
- Bers, D. M., Shannon, T. R. Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes. Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).
- Knollmann, B. C. New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle. The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).
- Chen, H., et al. Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions. The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).
- Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans. Circulation research. 94, 650-656 (2004).
- Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve. Circulation research. 93, 40-45 (2003).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).
- Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations. Circulation research. 99, 740-748 (2006).
- Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).
- Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).
- Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).
- Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).
- Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).
- Marks, A. R. Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics. The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).
- Cutler, M. J., et al. Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart. Circulation. 126, 2095-2104 (2012).
